Изменения в желудочном энтеральной нервной системы и мышц: Случай отчет о двух пациентах с диабетом gastroparesis

Изменения в желудочном энтеральной нервной системы и мышц: отчет о случае на двух пациентов с диабетической гастропарезу
Аннотация
Справочная информация
патофизиологической основой диабетической гастропарезу мало изучен, в значительной степени из-за почти полного отсутствия данных о нейропатологических и молекулярных изменений в желудках пациентов. Экспериментальные модели показывают различные повреждения, влияющие на блуждающий, мышцы, энтеральной нейроны, интерстициальные клетки Кахалем (МТП) или других клеточных компонентов. Цель данного исследования состояла в том, чтобы использовать современные аналитические методы для определения морфологических и молекулярных изменений в стенке желудка у больных с диабетической гастропарезу.
Методы
полной толщины биопсии желудка были получены лапароскопическим из двух gastroparetic пациентов, перенесших хирургическое вмешательство и от безрецидивная участки контрольных субъектов, подвергающиеся другие формы желудочной хирургии. Образцы были обработаны для гистологического и иммуногистохимического обследования.
Результаты
Хотя у обоих пациентов были тяжелые тугоплавкие симптомы с недоеданием, требуя размещения желудочного стимулятора, один из них не имел каких-либо существенных отклонений по сравнению с контрольной группой. Этот пациент имел резкое начало симптомов с относительно короткой длительностью диабета, который был хорошо контролируемым. В противоположность этому, другой пациент долго стоять хрупкими и плохо контролируемым диабетом с многочисленными эпизодами диабетического кетоацидоза и частых гипогликемических эпизодов. При гистологическом исследовании у этого пациента показали увеличение фиброза в мышечных слоев, а также значительно меньше нервных волокон и нейронов мышечной оболочки кишечника, как оценивали с помощью PGP9.5 окрашивания. Кроме того, значительное снижение наблюдалось в окрашивании для нейрональной синтазы окиси азота, гемоксигеназы-2, тирозин гидроксилазы, а также с-KIT.
Заключение
Мы пришли к выводу, что плохое метаболического контроля связано со значительными патологическими изменениями в стенки желудка, которые влияют на все основные компоненты, в том числе мышц, нейроны и ICC. Серьезные симптомы могут возникать в отсутствие этих изменений, однако и может отражать удушья, центральные или гормональных влияний. Гастропарез поэтому, вероятно, будет гетерогенным расстройством. Тщательное молекулярный и патологическая анализ может позволить более точную фенотипическую дифференциацию и пролил понимание основных механизмов, а также выявления новых терапевтических целей.
Фон
Длительная и плохо контролируемый диабет может привести к многочисленным нарушениям в желудочно-функции который парез является одним из наиболее распространенных. В третичных центрах направления парез наблюдается в 20-55% больных с типа I и до 30% пациентов с диабетом типа II [1]. Патогенез гастропарезу мало изучен, отчасти из-за отсутствия перспективных комплексных исследований желудочной патологии у этих больных. Кроме того, в то время как модели на животных позволяют предположить, что патогенез диабетической гастропарезу, вероятно, будет многофакторный с участием блуждающего, внутренние нервы, интерстициальные клетки и гладкие мышцы живота, относительная важность этих элементов в объяснении изменений в клинических проявлениях и естественной истории больных остается неизвестным [2]. Здесь мы сообщаем первый систематический анализ желудочной патологии у двух людей с диабетической гастропарезу, с использованием гистологических и иммуногистохимических методов. Наши результаты подчеркивают гетерогенность этого синдрома и обеспечивают несколько гипотез для будущих исследований.
Методы
Пациентов
Оба пациента сообщили здесь были переданы в Университете штата Техас медицинского отделения (UTMB) с диагнозом диабетической гастропарезу и тугоплавкие симптомы. Пациенты согласились принять участие в перспективном исследовании полной толщины желудочных биопсий лапароскопически во время хирургического размещения тощей трубки или желудочной электрического стимулятора размещения. Все возрастные группы сообщили здесь во время биопсии желудка.
Полная толщина желудка биопсии
Полная толщина части ткани (1 × 2 см в диаметре) были взяты хирургом (GG) выше уровня incisura в передней стенке середины тела желудка. Контрольные образцы (п = 2) были получены из соответствующей области в не страдающих диабетом, страдающих ожирением пациентов, перенесших шунтирование желудка и тем же хирургом.
Патологический и иммуногистохимическое исследование ткани
Для исследования иммуногистохимических, биоптаты фиксировали в 4 % параформальдегида (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) в 1 × фосфатном буферном растворе, промывают в 1 × фосфатно-буферным раствором (PBS) и погружали в течение ночи в 1 × PBS раствор, содержащий 30% сахарозы (Sigma-Aldrich, St. Louis , МО). Все инкубации были выполнены при температуре 4 ° С. Биопсии были вырезаны в поперечном сечении и замораживали в Tissue-Tek ОСТ соединение (электронная микроскопия наук, Hatfield, PA). Толщина 12 мкм криостатные были вырезаны. Стандартный H &Amp; E и протокол пятно трехцветный был завершен на участках. Присутствие фиброза оценивали с помощью трехцветный пятно Массона. Для иммуногистохимии были использованы шесть различных антител, следуя той же схеме, описанной ниже. Антитела, используемые были поликлональной кроличьей анти-человеческий продукт гена белка 9,5 (PGP 9,5) (1: 2000, ABD Serotec, Оксфорд, Великобритания), поликлональные кроличьи антитела против человеческого нейрональной синтазы оксида азота (нОАС) (1: 4000, Хемикон, Temecula, CA), поликлональные овцы против крысиного тирозин-гидроксилазы (ТН) (1: 200), поликлональные кроличьи антитела вещество Р (1: 1200, Хемикон, Temecula, CA), кролика против человеческого гемоксигеназы II (HO-2 ) (1: 10000, добрый подарок от доктора Снайдера, университет Джона Хопкинса, Балтимор, MA), поликлональной кроличьей античеловеческой с-Kit (2 нг /мкл, MBL, Нагоя, Япония). Слайды были сначала промывали дважды в 1 × PBS с последующим блокирующим шагом на неспецифическое вторичного связывания с антителом путем инкубации ткани с 1 × PBS, 10% нормальной сыворотки осла (NDS; Jackson ImmunoResearch Lab, Inc., West Grove, ПА) и 0,3% Тритон × -100 раствор (Pierce, Rockford, IL) в течение одного часа. Соответствующее первичное антитело затем разводили в 1 × PBS, 5% НСР, 0,3% Тритон × 100 и инкубировали в течение ночи при температуре 4 ° С. Су3 конъюгированный осла против кроличьего вторичное антитело или Су3 конъюгированный осла анти-овца вторичное антитело (Jackson ImmunoResearch Lab, Inc., Уэст-Гров, штат Пенсильвания), разведенного в 1 × PBS, 2,5% НДС, 0,3% Тритон × -100 раствор используется для визуализации иммуно-позитивных структур.
Институциональная одобрение
Данное исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом университета Техасского медицинского отделения и клиники Майо медицинский колледж. Информированное согласие было получено у всех пациентов и контрольной группы.
Результаты
Клинические проявления
Случай 1
Это был 37-летний белая женщина, кто развился сахарный диабет 1 типа, около 3-х лет до биопсии. Gastroparetic симптомы тошноты и рвоты, присутствовали приблизительно в течение той же продолжительности. Несмотря на различные методы лечения, она продолжала иметь сильную тошноту и рвоту, наряду с потерей веса. Тем не менее, ее диабет оставался хорошо контролируется повсюду с HbA1c 6,2% при первоначальном представлении.
Случай 2
Это был 32-летний белая женщина с историей диабета типа I в течение примерно десяти лет. Сахарный диабет был относительно трудно контролировать с помощью многочисленных эпизодов диабетического кетоацидоза и частых приступов гипогликемии. Во время презентации ее HbA1c колебалась между 6,6 до 7%. Более чем за год до начала размещения желудочного электростимулятора, пациент имел неразрешимыми симптомы тошноты, рвоты и боли с частыми госпитализаций.
Оба пациента имели радиологического и /или сканирующие доказательства сильно замедленного опорожнения желудка. Хотя формальное тестирование вегетативной нервной системы не проводилось, оба пациента также имели покоя тахикардию, когда они были относительно хорошо, при отсутствии явных признаков обезвоживания. И, наконец, в долгосрочной перспективе (> 1 год) реакция на желудочный электростимуляции заметно отличалась с пациентом 1 сообщая улучшение симптомов более чем на 50% по сравнению с исходным уровнем в то время как пациент 2 не испытывал никаких существенных изменений в ее клиническом течении <бр.> Патологические изменения в желудке
Оценка фиброза (Рисунок 1) Рисунок 1
окрашивание для фиброза и нейронных структур. Панели А-С. Трехцветный окрашивание. Управления (A) и секции от случая 1 (B) не показали никакого увеличения фиброза, тогда как участки от случая 2 (С) показали увеличение фиброза в обеих мышечных слоев и вдоль сплетении мышечной оболочки кишечника. Масштабная линейка 200 мкм. Панели D-F. PGP 9.5 иммунореактивности. PGP9.5 иммунореактивности в качестве маркера для нейрональных структур была нормальной в контрольной (D), и в случае 1 (E). Был снижение PGP 9.5 иммунореактивности в обоих слоев мышц и мышечной оболочки кишечника сплетение в секциях от случая 2 (F), что свидетельствует о потере нервных структур. Панели G-I. Тирозингидроксилаза иммунореактивности. Тирозингидроксилаза иммунореактивности было нормально в контроле (G). Разделы от случая 1 (H), показывающие нормальный Тирозингидроксилаза иммунореактивности вокруг сплетении мышечной оболочки кишечника с уменьшением lsight в тирозин гидроксилазы иммунореактивности в мышечных слоях. Срезы случае 2 (I) показал заметную потерю тирозин гидроксилазы иммунореактивности во всех регионах, предполагающими потерю внешних нервных волокон. Масштабная линейка 100 мкм. Круговая мышца (CM), мышечной оболочки кишечника сплетение (МП), продольные мышцы (LM).
Case 1
Разделы от пациента с хорошо контролируемым диабетом показали нормальную структуру окрашивания без признаков увеличения фиброза в мышечных слоях.
Случай 2
В противоположность этому, секции из ткани, полученной от пациента с плохо контролируемым диабетом показали заметное увеличение фиброза в обеих мышечных слоев и вокруг сплетении мышечной оболочки кишечника.
Кишечные нервы (рисунок 1) <бр> число тел нервных клеток и волокон оценивали с использованием антител против пан-нейронный производителя PGP 9.5.
Case 1
количество нервных волокон в круговых и продольных слоев мышц была нормальной в секциях от пациента с хорошо контролируемым диабетом по сравнению с контрольной группой.
Случай 2
Существовал уменьшение числа нервных волокон у пациента с плохо контролируемым диабетом на 40-50% по сравнению с контрольной группой.
Изменения в выражении нейромедиаторов и родственных белков (рисунок 2) Рисунок 2
Immunoreactiivty для ННО, SP и НО2 в качестве маркеров для тормозных и возбуждающих нервных клеток органов и волокон. Панели А-С. Нормальный иммунореактивности для нОАС в контроле (А) и 1 случай (B). нОАС иммунореактивность заметно снижалась в случае 2 (C). Панели D-F. Выражение Вещество P было нормальным контролем (D), случай 1 (Е), и случай 2 (F). Панели G-I. Гемоксигеназы II (HO-2) иммунореактивности был нормальным контролем (G) и 1 случай (H). Срезы Случай 2 (I) показал потерю HO-2 иммунореактивности, который вместе с уменьшением нОАС immunoreactivty предполагает потерю ингибиторной входного ВЗ гладких мышц. Масштабная линейка 100 мкм. Круговая мышца (СМ), продольная мышца (LM).
Эксперименты были впоследствии направлены, чтобы определить, если потеря нервных волокон видно было специфическим для конкретного подмножества нервных волокон. Антитела против тирозингидроксилазе (TH) были использованы для immunolabel примесные нервных волокон. Антитела против вещества Р (SP) и нейрональной синтазы оксида азота (нОАС) использовались для immunolabel возбуждающие нервы и ингибирующих нервов соответственно. Антитела к гемоксигеназы-2 (НО2) были использованы для обозначения нервов и ICC, которые содержат гемоксигеназы, фермент, который дает начало окиси углерода, как известно, регулирует синапсах и мембраны гладких мышц потенциал [3, 4].
Case 1
Никаких изменений в экспрессии SP, ННО, H02 (рисунок 2) были отмечены в разделах от пациента с хорошо контролируемым диабетом по сравнению с контрольной группой. Был небольшое снижение числа TH положительных волокон в слоях мышц у этого пациента; Тем не менее, TH иммунореактивность вокруг ганглиев было нормально, что указывает на неповрежденную внешнюю иннервации внутренней нервной системы (Рисунок 1).
Случай 2
Никаких существенных изменений не было обнаружено с антителом SP но иммунноокрашивания для нОАС, H02 (рисунок 2 ) и TH (рис 1) у пациентов с плохо контролируемым диабетом был снижен (на 40-50%).
интерстициальные клетки Кахала
желудка человека МУС имеют два основных types- те, которые разбросаны по всему животу в обоих слоях мышц (ICC-IM) и те, которые связаны с мышечной оболочки кишечника сплетении (ICC-MY) в теле и антральном, но не в более проксимальных отделах желудка. В этом исследовании, ICC были immunolabeled с использованием антитела к с-Kit. ICC-MY не были визуализированы в любом пациент, ни в контрольной ткани в этой области желудка.
Случай 1
Распределение ICC-IM была нормальной у пациента с хорошо контролируемым диабетом с нормальным числом ICC (рисунок 3 ). Рисунок выражение 3 с-Kit в качестве маркера для интерстициальных клеток Кахалем. Контроль (А) и случай 1 (B) показал нормальную с-Kit иммунореактивности в то время как в случае 2 (С) произошла потеря с-Kit иммунореактивности предполагает уменьшение числа ICC. Масштабная линейка 100 мкм. Круговая мышца (CM), продольные мышцы (LM).
Случай 2
У пациентов с плохо контролируемым диабетом количество с-Kit положительное ICC-IM был снижен в обоих слоев мышц (на 30-40%, Рисунок 3).
Обсуждение
Несмотря на существование как клинический синдром в течение более чем пол-века [5], патогенез диабетической гастропарезу остается неизвестной. Исследования на экспериментальных моделях диабета были сравнительно узко направлены на интересы отдельных лабораторий и указывают на причастность нескольких типов клеток (нейронов, МТП, мышцы), которые были рассмотрены в последнее время [2]. Два наиболее последовательные выводы по всей видимости, связаны с изменениями в нейрональной экспрессии ННО и ICC. Тем не менее, общая тема или гипотеза для этих результатов до сих пор не возникло отчасти из-за невозможности их проверки у людей, у которых доступ к более глубоких интрамуральных структур, как правило, требует хирургического вмешательства. Несколько исследований, которые получили желудочной ткани таким образом, как правило, делается в эпоху, когда не существовало сложных изображений и молекулярные технологии и дали результаты, которые не соответствуют в лучшем случае. Мы сообщаем систематический анализ желудочного энтеральной нервной системы и мышц у двух пациентов с диабетической гастропарезу по сравнению с соответствующими тканями, полученными из тучных контрольной группы. Поразительные изменения были замечены у одного пациента; они включали значительную степень фиброза включающей мышечный слой, который, вероятно, отражает последствия тяжелой и, возможно, повторяющиеся повреждения тканей от метаболических, сосудистых или других осложнений сахарного диабета.
Эти изменения в соответствии с предыдущим отчетом, показывающим тяжелой отложение коллагена и фиброзом у 4 больных с резистентным диабетической гастропарезу [6, 7]. С другой стороны, в другом исследовании 16 пациентов с давними диабетом (пять из которых имели парез желудка) не показали никаких отклонений в гладких мышцах (или других структур) [8]. Кроме того, ни один из этих исследований было установлено каких-либо существенных изменений в сплетении мышечной оболочки кишечника, что в отличие от наших результатов в случае 2, где значительное сокращение мышечной оболочки кишечника нейронного окрашивания был замечен наряду с уменьшением маркеров для тормозных нейромедиаторов. Хотя мы не изучали маркеры апоптоза или гибели клеток в данном исследовании, обнаружение сниженного маркировки PGP9.5 предполагает, что эти изменения отражают степень потери нейронов, а не просто лишь потерю экспрессии синтетического фермента или медиатора. Тем не менее, доказательства фактического желудка потери нейронов при диабете не сообщалось либо в животных или больных [2], хотя ни одного случая исследование пациента с идиопатической гастропарезу показал, заметно снижается число гликопротеина 9.5-позитивных нейронов мышечной оболочки кишечника [9].
оксид азота является одним из наиболее важных медиаторов для поддержания нормальной функции желудка и существует значительная экспериментальная литература вовлекая роль для ее потери в патогенезе замедленное опорожнение желудка [10-19]. Совсем недавно, исследование 36 пациентов мужского пола с диабетом, перенесших резекцию желудка показало значительную потерю нОАС, а также выражение SP; Тем не менее, не было никакой информации о том, были симптоматическое эти пациенты или имели нарушение двигательной функции желудка [20]. У нашего пациента с плохо контролируемым диабетом, снижение общего нейронного окрашивания сопровождался значительной потерей нОАС, но не SP выражение, предполагая относительно конкретного повреждения тормозных нейронов. В этом контексте, наше исследование является первым сообщать об изменениях в Хо-2, конститутивной формой гемоксигеназы, что в значительной степени отвечает за производство окиси углерода, другого эндогенного газообразного нейромодулятор существенное значение с ингибиторной контролем моторики ЖКТ [3 21-25]. Общая потеря обоих ингибирующих молекул, таким образом, как ожидается, вызовет глубокое возмущение физиологии желудка, как это было видно у нашего пациента (случай 2). Этот случай также иллюстрирует различия и сходства между изменениями диабетической гастропатии по сравнению с диабетической энтеропатии. Последнее также связано с потерей нОАС и TH выражения, но, напротив, представляет с повышенной экспрессией SP [26], предполагая, региональные различия в уровне воздействия диабета на энтеральной нервной системы.
Наконец, мы также рассмотрели изменения в ICC с использованием C-Kit в качестве маркера. МТП играют несколько важных ролей в желудочно-кишечном физиологии, включая установки кардиостимулятора ритм, а также участие в синапсах и механоре- [21, 27-29]. Как в естественных условиях и в пробирке исследования экспериментального диабетом говорят ICC истощению, может быть вторичным по отношению к потере инсулина /ИФР и /или оксида азота или других, пока еще не определены, факторов выживания [7, 30-32]. Наши результаты значительной потере экспрессии с-Kit в случае 2 согласуются с результатами других изменений, отмеченных в этом пациента, а также с новыми сообщениями в организме человека. Таким образом, было установлено, что значительные потери ICC [33] четыре из девяти пациентов с рефрактерной диабетической гастропарезу. Снижение с-Kit окрашивания также было отмечено в исследовании пациентов, страдающих диабетом, перенесших резекцию желудка по поводу рака [20].
Наше исследование имеет важное значение, поскольку она обеспечивает редкую проницательность в патологический, а также молекулярные изменения потенциальной важности в патогенез диабетической гастропарезу. Кроме того, есть несколько примечательных уроки из этих случаев. Начнем с того, как представляется, четкая корреляция между гистологических изменений, отмеченных и клинического течения сахарного диабета, возможно, указывает на важность плохого гликемического контроля в их развитии. Распространенность замедленным опорожнением желудка слабо коррелирует с длительностью диабета [34]. Связанные факторы, такие как крайняя гипер- или гипогликемии, даже если недолго, может быть еще более важно, так как оба условия были экспериментально показано, что причиной повреждение нейронов и смерть (хотя гипергликемия не было доказано влияние МУС в животной модели) [31, 35, 36]. Поэтому возможно, что пациент был избавлен 1 значительные изменения в желудочной патологии, потому что она пережила более короткий и метаболически более стабильный курс развития диабета, чем пациента 2. Единственный вывод примечания в ткани от этого пациента было небольшое снижение TH иммунореактивности в круговой слой мышц, но не в сплетении мышечной оболочки кишечника. Так как внешняя нервная система непосредственно не иннервируют гладкие мышцы, эти волокна могут представлять нервы проходя свой путь к подслизистом сплетении. В качестве альтернативы, они могут быть также процессы от собственных нейронов как существует подмножество кишечными нервов, которые также выражает значение TH [37]. Несмотря на это, клинико-патологическими подтекст этой находки остается неясным.
Более примечательным, чем выше наблюдения, однако, тот факт, что изменения в стенке желудка, казалось, не имеют никакого отношения к клинической симптоматики. Таким образом, несмотря на сопоставимые клинической тяжести, два пациента имели значительно различия в желудочной патологии, при этом один по существу нормальным, а другой отображения спектра аномалий, влияющих на нервную, мышечную и ICC. Эти результаты обеспечивают место для нескольких различных спекуляций. Во-первых, возможно, что изменения в случае 2 представляют собой "конечной стадии" патологии в результате кумулятивных и повторяющихся метаболических инсультов. Таким образом, основная их клиническое значение может предсказать несговорчивость, а не причинно-следственной связи, которая, безусловно, предложенной неспособностью этого пациента реагировать на все вмешательства, включая желудка электрической стимуляции. Если это верно, то сами симптомы Гастропарез может быть связано с изменениями, которые либо происходят ранее (например, возможно, небольшая потеря TH иммунореактивных волокон в кольцевом слое мышц) или слишком тонким, чтобы быть обнаружены с помощью методов, которые мы использовали (например, нарушения в субклеточных сигнальных путей при отсутствии морфологических изменений, как было описано в желудочном мышцы от диабетических животных [38].
во-вторых, можно утверждать, что симптомы наших пациентов вовлечены механизмы, которые мы не исследовали, такие как вагусной дисфункции (предложенный наличием покоящихся тахикардии в обоих случаях). Изменения в блуждающего функции традиционно участвуют в патогенезе гастропарезу, хотя твердые доказательства отсутствуют и корреляция между вегетативной дисфункции и замедленное опорожнение желудка скромные в лучшем случае [2 , 34]. Наконец, возможно, что диабетический парез действительно гетерогенное заболевание, и что в то время как у некоторых пациентов явная патология желудка (как и в случае 2), другие могут разработать патофизиологически отчетливую форму гастропарезу в результате циркулирующих аутоиммунные факторы, которые могут вызвать дисфункция, но не разрушение нервов или мышц, как было описано [39, 40].
заключение
В заключение мы описали подробно патологическое исследование двух пациентов с диабетической гастропарезу. В то время как трудно обобщать на основе такого небольшого числа, эти случаи действительно предлагают некоторое представление о патогенезе гастропарезу, а также служат основой для нескольких важных гипотез для будущих исследований
Сокращения
нОАС:.
нейронная синтазы окиси азота


HO-2:
гемоксигеназы-2


ICC:
интерстициальные клетки Кахалем


SP:
вещество P.


декларациях
Благодарности
Эта работа была частично поддержана NIDDK U01 DK073983-01 ( ПЭП, GF) и DK DK68055 и DK57061 (GF)
авторов оригинальные представленные файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинальных представленных файлов для изображений. 'Исходный файл для Рисунок 1 12876_2007_254_MOESM2_ESM.tiff Авторского 12876_2007_254_MOESM1_ESM.jpeg авторов исходного файла для исходного файла Рисунок 2 12876_2007_254_MOESM3_ESM.tiff Авторского для фигурного 3 конкурирующими интересами
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

• Значение уровня сывороточного пепсиногена для диагностики заболеваний желудка в китайский ханьцев в MidSouth Ки…
• Маргинальный мутная полоса и светло-голубой гребень, признаки, наблюдаемые в увеличительным узкополосного э…