Mudanças no sistema gástrico entérico nervoso e muscular: um relato de caso de dois pacientes com alterações diabéticos gastroparesis

no sistema nervoso entérico gástrico e muscular: Um relato de caso em dois pacientes com gastroparesia diabética da arte abstracta
Fundo
A base fisiopatológica da gastroparesia diabética é mal compreendida, em grande parte devido à quase total ausência de dados sobre alterações neuropatológicas e moleculares nos estômagos dos pacientes. Modelos experimentais indicam várias lesões que afectam as vago, músculo, neurônios entéricos, células intersticiais de Cajal (ICC) ou outros componentes celulares. O objetivo deste estudo foi utilizar métodos analíticos modernos para determinar as mudanças morfológicas e moleculares na parede gástrica em pacientes com gastroparesia diabética.
Métodos
biópsias gástricas espessura total foram obtidos por laparoscopia de dois pacientes gastroparetic submetidos a intervenção cirúrgica e de áreas livres de indivíduos controle submetidos a outras formas de cirurgia gástrica. As amostras foram processadas para exame histológico e imuno-histoquímico.
Resultados
Embora ambos os pacientes apresentaram sintomas refratários graves com desnutrição, exigindo a colocação de um estimulador gástrico, um deles não teve alterações significativas em comparação com os controles. Este paciente teve um início abrupto dos sintomas com uma duração relativamente curta de diabetes que foi bem controlado. Por outro lado, o outro paciente tinha diabetes de longa data frágeis e mal controlados com inúmeros episódios de cetoacidose diabética e episódios de hipoglicemia frequentes. O exame histológico neste paciente revelou aumento da fibrose nas camadas musculares, bem como um número significativamente menor de fibras nervosas e os neurónios mientéricos como avaliado por coloração com PGP9.5. Além disso, a redução significativa foi observada na coloração para a sintase de óxido nítrico neuronal, heme oxigenase-2, hidroxilase de tirosina, bem como de c-kit.
Conclusão
Conclui-se que o controle metabólico pobre está associado a alterações patológicas significativas na parede gástrica que afetam todos os principais componentes, incluindo musculares, neurônios e ICC. sintomas graves pode ocorrer na ausência dessas mudanças, no entanto e pode reflectir influências vagais, centrais ou hormonais. Gastroparesia é, portanto, susceptível de ser um transtorno heterogêneo. análise molecular e patológica cuidadosa pode permitir a diferenciação fenotípica mais preciso e derramou insights sobre os mecanismos subjacentes, bem como identificar novos alvos terapêuticos.
Fundo
de longa data e diabetes controlado por mal pode resultar em muitas perturbações na função gastrointestinal de que gastroparesia é uma das mais comuns. Em centros terciários gastroparesia é visto em 20-55% de pacientes com o tipo I e até 30% dos doentes com diabetes tipo II [1]. A patogénese de gastroparesia é mal compreendida, em parte por causa de uma falta de estudos exaustivos em perspectiva de patologia gástrica nestes pacientes. Além disso, enquanto os modelos animais sugerem que a patogénese de gastroparesia diabética é susceptível de ser multifactorial envolvendo os vago, nervos intrínsecas, células intersticiais e do músculo liso do estômago, a importância relativa destes elementos para explicar as variações na apresentação clínica e história natural da pacientes permanece desconhecido [2]. Aqui nós relatamos a primeira análise sistemática da patologia gástrica em dois seres humanos com gastroparesia diabética, usando histológica e técnicas de imuno-histoquímica. Os resultados enfatizam a heterogeneidade desta síndrome e fornecer várias hipóteses para estudos futuros.
Métodos
Pacientes
Ambos os pacientes aqui relatados foram encaminhados para a Universidade do Texas Medical Branch (UTMB) com diagnóstico de gastroparesia diabética e sintomas refratários. Os pacientes consentiram em participar de um estudo prospectivo de biópsias gástricas de espessura total obtidos por via laparoscópica no momento da colocação cirúrgica de um tubo de jejuno ou colocação estimulador elétrico gástrico. Todas as idades são relatadas aqui no momento da biópsia gástrica.
Biópsia gástrica espessura completa
pedaços de espessura total de tecido (1 × 2 cm de tamanho) foram tomadas pelo cirurgião (GG) acima do nível da incisura na parede anterior do meio do corpo do estômago. amostras de controlo (n = 2) foram obtidos a partir da área correspondente em pacientes obesos não diabéticos submetidos a cirurgia de bypass gástrico pelo mesmo cirurgião.
exame anatomopatológico e imuno-histoquímico de tecido
Para estudos de imuno-histoquímica, biópsias foram fixadas em 4 % de paraformaldeído (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em 1 × solução de tampão fosfato, lavadas em 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS) e imersas durante a noite em 1 × solução de PBS contendo 30% de sacarose (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO). Todas as incubações foram realizadas a 4 ° C. As biópsias foram cortadas em secção transversal e congelados em Tissue-Tek outubro composto (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). 12 um secções criostáticas de espessura foram cortadas. A H Standard & E e protocolo mancha Tricromio foi concluída em seções. A presença de fibrose foi avaliada usando o tricrômico de Masson. Para imuno-histoquímica de seis anticorpos diferentes foram usados ​​seguindo o mesmo protocolo descrito abaixo. Os anticorpos utilizados foram um produto do gene da proteína anti-humano policlonal de coelho 9,5 (PGP 9.5) (1: 2000, AbD Serotec, Oxford, Reino Unido), anticorpo policlonal de coelho anti-humano de óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) (1: 4000, Chemicon, Temecula, CA), policlonal de ovelha anti-rato a tirosina hidroxilase (TH) (1: 200), anticorpo policlonal de coelho anti-substância P (1: 1200, Chemicon, Temecula, CA), de coelho anti-humano de heme oxigenase II (HO-2 ) (1: 10.000, amável do Dr. Snyder, Johns Hopkins University, Baltimore, MA), policlonal de coelho anti-humano c-Kit (2 ng /mL, MBL, Nagoya, Japão). As lâminas foram primeiro lavadas duas vezes em 1 x PBS, seguido por um passo de bloqueamento para o anticorpo secundário a ligação não específica por incubação do tecido com um 1 × PBS, 10% de soro de burro normal (NDS; Jackson ImmunoResearch Lab, Inc., West Grove, PA) e 0,3% de Triton x (Pierce, Rockford, IL) -100 solução durante uma hora. O anticorpo primário adequado foi então diluído em 1 × PBS, 5% NDS, 0,3% de Triton × -100 e incubou-se durante a noite a 4 ° C. Um burro conjugado anticorpo secundário anti-coelho Cy3 ou um burro conjugado anti-ovelha anticorpo secundário Cy3 (Jackson ImmunoResearch Lab, Inc., West Grove, PA) diluído em 1 × PBS, 2,5% NDS, 0,3% Triton × -100 solução foi usado para visualizar as estruturas imuno-positivo.
aprovação Institucional
Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board da Universidade do Texas Medical Branch ea Mayo Clinic College of Medicine. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes e controles. Os resultados
apresentações clínicas
caso 1 | Esta foi uma mulher branca de 37 anos que desenvolveram diabetes tipo 1 cerca de 3 anos antes da biópsia. sintomas Gastroparetic de náuseas e vômitos estiveram presentes aproximadamente a mesma duração. Apesar de várias terapias, ela continuou a ter náuseas e vómitos severos, junto com a perda de peso. No entanto, seus diabetes permaneceu bem controlada durante todo com uma HbA1c de 6,2% na apresentação inicial.
Caso 2
Esta era uma mulher branca de 32 anos com história de diabetes tipo I por cerca de uma década. A diabetes foi relativamente difícil de controlar com vários episódios de cetoacidose diabética e episódios de hipoglicemia frequentes. No momento da apresentação do seu HbA1c variou entre 6,6 a 7%. Por mais de um ano antes da colocação de um estimulador elétrico gástrica, o paciente teve sintomas intratáveis ​​de náuseas, vómitos e dor com hospitalizações frequentes.
Ambos os pacientes tiveram evidência radiológica e /ou cintilografia de esvaziamento gástrico severamente atrasado. Embora testes formais do sistema nervoso autónomo não foi realizado, ambos os pacientes também tinha taquicardia em repouso quando eram relativamente bem, na ausência de desidratação evidente. Finalmente, a longo prazo (> 1 ano) a resposta à estimulação eléctrica gástrica foi marcadamente diferente com o paciente 1 relatar uma melhoria superior a 50% nos sintomas em comparação com a linha de base, enquanto o paciente dois não apresentaram qualquer alteração significativa no seu curso clínico as alterações patológicas no estômago
Avaliação da fibrose (Figura 1)
Figura 1 coloração para a fibrose e para estruturas neuronais. Painéis A-C. Tricromo. O controlo (A) e secções do exemplo 1 (B) não mostrou nenhum aumento na fibrose, enquanto secções do exemplo 2 (C) apresentou uma aumento de fibrose em ambas as camadas musculares e ao longo do plexo mientérico. A barra de escala 200? M. Painéis D-F. PGP 9.5 imunorreactividade. PGP9.5 imunorreactividade como um marcador para as estruturas neuronais de controlo foi normal em (D) e no caso de um (E). Houve uma diminuição da imunorreactividade PGP 9.5 em ambos as camadas musculares e o plexo mientérico, em secções de caixa 2 (F), sugerindo uma perda de estruturas neuronais. Painéis de L-I. Tirosina imuno-hidroxilase. Tirosina hidroxilase imunorreactividade foi normal no controlo (G). Secções do exemplo 1 (h), que mostra o Normal imunoreactividade da tirosina-hidroxilase em torno do plexo mientérico com uma diminuição na imuno-reactividade lsight tirosina hidroxilase nas camadas musculares. As secções de caixa 2 (I) mostraram uma acentuada perda de imunorreactividade de tirosina-hidroxilase em todas as regiões sugerindo uma perda de fibras nervosas extrínsecos. A barra de escala 100? M. músculo circular (CM), plexo mioentérico (MP), músculo longitudinal (LM).
caso 1 | Secções do paciente com diabetes bem controlados mostraram um padrão normal de coloração, sem evidência de aumento da fibrose nas camadas musculares.
Caso 2
em contraste, as secções de tecido obtido a partir do paciente com diabetes mal controlada mostrou um aumento marcado na fibrose em ambas as camadas musculares e em torno do plexo mientérico.
sistema nervoso entérico (Figura 1)
o número de corpos de células nervosas e fibras foi avaliada utilizando anticorpos contra a fabricante pan-neuronal PGP 9.5.
caso 1 | o número de fibras nervosas nas camadas musculares circular e longitudinal foi normal em secções do paciente com Alterações bem controlados diabetes, quando comparados com os controlos.
Caso 2
Houve uma diminuição de 40-50% no número de fibras nervosas no paciente com diabetes mal controlada, em comparação com os controlos.
na expressão de neurotransmissores e proteínas relacionadas (Figura 2) Figura 2
Immunoreactiivty para nNOS, SP e HO2 como marcadores para corpos de células nervosas inibitórios e excitatórios e fibras. Painéis A-C. imunorreatividade normal para nNOS no controle (A) e caso 1 (B). nNOS imunorreactividade foi marcadamente diminuída no caso de 2 (C). Painéis D-F. expressão substância P foi normal em controle (D), caso 1 (E), e caso 2 (F). Painéis de L-I. O heme oxigenase II (HO-2) imunoreactividade foi normal em controlo (G) e um caso (H). Secções de Caso 2 (I) mostraram uma perda da imunorreactividade HO-2 que, em conjunto com a diminuição da nNOS immunoreactivty sugere uma perda de entrada inibitório do músculo liso OT. A barra de escala 100? M. músculo circular (CM), o músculo longitudinal (LM).
As experiências foram subsequentemente dirigida para determinar se a perda de fibras nervosas visto era específica para um subconjunto particular de fibras nervosas. Os anticorpos contra tirosina-hidroxilase (TH) foram usadas para immunolabel fibras nervosas extrínsecos. Os anticorpos contra a substância P (SP) e óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) foram usadas para immunolabel nervos excitatórios e nervos inibidores, respectivamente. Os anticorpos para oxigenase-2 heme (HO2) foram utilizados para marcar os nervos e ICC que contêm heme oxigenase, a enzima que dá origem a monóxido de carbono, conhecido por regular a neurotransmissão e a membrana do músculo liso potencial [3, 4].
Caso 1
Não há mudanças na expressão de SP, nNOS, H02 (Figura 2) foram observadas em seções do paciente com diabetes bem controlado quando comparados aos controles. Houve um ligeiro decréscimo no número de fibras de TH positivos nas camadas musculares neste paciente; no entanto, TH imunorreatividade torno gânglios era normal, sugerindo uma inervação extrínseca intacta para o sistema nervoso intrínseco (Figura 1).
Caso 2
Nenhuma mudança significativa foi observada com o anticorpo SP, mas imunomarcação para nNOS, H02 (Figura 2 ) e TH (Figura 1) foi diminuída (em 40-50%) em que o paciente com diabetes mal controlada.
células intersticiais de Cajal
ICC gástrico humano são de dois tipos-grande aqueles que estão espalhados por todo o estômago em ambas as camadas de músculo (ICC-IM) e aqueles que estão associados com o plexo mientérico (ICC-MY) no corpo e antro, mas não no estômago mais proximal. Neste estudo, foram immunolabeled ICC utilizando um anticorpo de c-kit. ICC-MY não foram visualizadas tanto no paciente, nem no tecido de controlo nesta região do estômago.
Caso 1
Distribuição de CCI-IM foi normal no doente com diabetes bem controlada com números normais de TPI (figura 3 ). Figura 3 a expressão de c-kit como um marcador para as células intersticiais de Cajal. Control (A) e caso 1 (B) não apresentaram alteração imunorreatividade c-Kit, enquanto no caso 2 (C), houve uma perda de c-Kit imunorreatividade sugerindo uma diminuição do número de ICC. A barra de escala 100? M. músculo circular (CM), músculo longitudinal (LM).
Caso 2
No paciente com diabetes mal controlado o número de c-Kit positiva ICC-IM foi reduzido em ambas as camadas musculares (em 30-40%, Figura 3).
Discussão
Apesar de sua existência como uma síndrome clínica há mais de meio século-[5], a patogênese da gastroparesia diabética permanece desconhecida. Estudos sobre modelos experimentais de diabetes têm sido relativamente estreitamente voltada para os interesses dos laboratórios individuais e indicar o envolvimento de vários tipos de células (neurônios, ICC, músculo), como revisto recentemente [2]. Os dois achados mais consistentes parecem envolver mudanças na expressão neuronal nNOS e ICC. No entanto, um tema de unificação ou hipótese de estas descobertas ainda não surgiu em parte, devido à incapacidade para validar os modelos em seres humanos, nos quais o acesso às estruturas mais profundas intramurais geralmente requer uma cirurgia. Os poucos estudos que obtiveram tecido gástrico desta maneira eram geralmente feito em uma época em que não existia tecnologias de imagem e moleculares sofisticados e têm produzido resultados inconsistentes na melhor das hipóteses. Nós relatamos uma análise sistemática do sistema nervoso entérico gástrico e muscular de dois pacientes com gastroparesia diabética, em comparação com os tecidos correspondentes obtidos a partir de controles obesos. alterações marcantes foram observados em um paciente; estes incluíram um significativo grau de fibrose envolvendo a camada muscular, o que provavelmente reflete as consequências de lesão tecidual grave e talvez repetitivo de metabólica, vascular ou outras complicações da diabetes.
Estas mudanças estão de acordo com um relatório anterior que mostra a deposição de colágeno grave fibrose e em 4 pacientes com gastroparesia diabética refractário [6, 7]. Por outro lado, outro estudo de 16 pacientes com diabetes de longa duração (cinco dos quais tinham gastroparesia) não mostraram alterações no músculo liso (ou outras estruturas) [8]. Além disso, nenhum desses estudos encontraram quaisquer alterações significativas no plexo mioentérico, que está em contraste com nossos achados no caso 2, onde uma grande redução na coloração neuronal myenteric foi visto juntamente com uma redução dos marcadores para neurotransmissores inibitórios. Embora nós não estudar marcadores de apoptose ou morte celular no presente estudo, o achado de rotulagem PGP9.5 diminuiu sugere que estas alterações reflectem um grau de perda neuronal e não simplesmente meramente a perda de expressão da enzima sintética ou neurotransmissor. No entanto, a evidência de perda neuronal gástrica real na diabetes não tem sido relatada em animais ou pacientes [2], embora um estudo único caso de um paciente com gastroparesia idiopática revelou marcadamente reduzida números de PGP 9.5-positivas neurónios mientéricos [9].
o óxido nítrico é um dos neurotransmissores mais importantes para a manutenção da motilidade gástrica normal e existe literatura experimental considerável implicando um papel para a sua perda na patogénese de esvaziamento gástrico retardado [10-19]. Mais recentemente, um estudo de 36 pacientes diabéticos do sexo masculino submetidos a ressecção gástrica mostraram perda significativa de nNOS, bem como expressão SP; no entanto, não havia nenhuma informação sobre se esses pacientes eram sintomáticos ou tinham prejudicado a motilidade gástrica [20]. No nosso paciente com diabetes mal controlada, a redução na coloração neuronal global foi acompanhada por uma perda significativa de nNOS, mas não SP expressão, sugerindo lesão relativamente específico para neurónios inibitórios. Neste contexto, nosso estudo também é o primeiro a relatar mudanças no HO-2, a forma constitutiva da enzima heme oxigenase que é em grande parte responsável pela produção de monóxido de carbono, um outro neuromodulador gasoso endógeno de importância considerável no controle inibitório da motilidade gastrointestinal [3 , 21-25]. A perda combinada de ambas as moléculas inibidoras, portanto, é capaz de causar uma profunda perturbação da fisiologia gástrica como foi visto em nosso paciente (Caso 2). Este caso também ilustra as diferenças e semelhanças entre as mudanças em gastropatia diabética, em comparação com enteropatia diabético. Este último também está associada com perda de nNOS e expressão TH, mas por outro lado, apresenta-se com aumento da expressão de SP [26], sugerindo variações regionais nos efeitos do diabetes no sistema nervoso entérico.
Finalmente, também olhou para mudanças no ICC usando c-Kit como um marcador. ICC desempenhar vários papéis críticos na fisiologia gastrointestinal incluindo a definição do ritmo de marcapasso, e participação na neurotransmissão e mecanosensibilidade [21, 27-29]. Tanto in vivo e in vitro de depleção experimental relatório diabetes ICC, talvez secundária a perda de insulina /IGF e /ou de óxido nítrico ou outro, como ainda indeterminado, factores de sobrevivência [7, 30-32]. As nossas descobertas de perda significativa da expressão de c-kit no caso 2 são consistentes com outras alterações observadas neste paciente, bem como com relatórios emergentes em seres humanos. Assim, quatro dos nove pacientes com gastroparesia diabética refratário foram encontrados para ter perda significativa de ICC [33]. Uma redução na coloração c-Kit também foi observado no estudo em pacientes diabéticos submetidos a ressecção gástrica para o câncer [20].
Nosso estudo é importante, pois fornece uma rara visão sobre o patológico, bem como alterações moleculares da importância potencial em a patogénese de gastroparesia diabética. Além disso, existem várias lições notáveis ​​destes casos. Para começar, parecia haver uma clara correlação entre as alterações histológicas observadas e a evolução clínica de diabetes, talvez indicando a importância do controle glicêmico inadequado em seu desenvolvimento. A prevalência de esvaziamento gástrico retardado correlaciona fracamente com a duração da diabetes [34]. fatores relacionados, como a extrema hiper ou hipoglicemia, mesmo que de curta duração, pode ser ainda mais importante como ambas as condições têm sido demonstrado experimentalmente para causar lesão e morte neuronal (embora hiperglicemia não foi mostrado para afetar ICC em um modelo animal) [31, 35, 36]. Por isso, é possível que o paciente 1 foi poupado grandes mudanças na patologia gástrica porque ela experimentou um curso mais curto e metabolicamente mais estáveis ​​de diabetes do que paciente 2. O único achado digno de nota no tecido deste paciente foi uma ligeira diminuição da TH imunorreatividade na camada muscular circular, mas não no plexo mientérico. Visto que o sistema nervoso extrínseca não directamente inervam o músculo liso, estas fibras poderiam representar nervos que atravessa o seu caminho para o plexo submucosa. Alternativamente, estes também podem ser processos de neurónios intrínsecos como há um subconjunto de nervos entéricos que também expressa TH [37]. Independentemente disso, a implicação correlação clínica deste achado ainda não está claro.
Muito mais notável do que a observação acima, no entanto, foi o fato de que as mudanças na parede do estômago parecia não ter relação com a sintomatologia clínica. Assim, apesar da gravidade clínica comparável, os dois pacientes tinham dramaticamente diferenças na patologia gástrica, com uma sendo essencialmente normal e a outra exibindo um espectro de anormalidades que afectam nervos, músculos e ICC. Estes resultados fornecem espaço para várias especulações diferentes. Em primeiro lugar, é possível que as alterações no caso 2 representam patologia "em fase terminal" resultante de insultos metabólicos cumulativos e repetitivas. Como tal, a sua grande importância clínica pode ser de prever intratabilidade em vez de causalidade, o que sem dúvida é sugerida pelo fracasso deste paciente para responder a todas as intervenções, incluindo a estimulação elétrica gástrica. Se isto é verdade, então sintomas gastroparesia próprios pode ser devido a alterações que ou ocorrem mais cedo (tais como, talvez, a ligeira perda de fibras imunorreactivas TH na camada muscular circular) ou são demasiado subtil para ser detectado pelas técnicas já usadas (por exemplo, anormalidades nas vias de sinalização subcelulares, na ausência de alterações morfológicas, como foi descrito no músculo gástrico de animais diabéticos [38].
em segundo lugar, pode-se argumentar que os sintomas dos nossos pacientes mecanismos que nós não investigar, como envolvidos disfunção vagal (sugerido pela presença de taquicardia de repouso em ambos os casos). Alterações na função vagal têm sido tradicionalmente implicados na patogênese da gastroparesia, apesar de evidências sólidas de falta e a correlação entre disfunção autonômica e atrasou esvaziamento gástrico é modesto na melhor das hipóteses [2 , 34]. Finalmente, é possível que gastroparesia diabética é verdadeiramente um distúrbio heterogéneo e que, embora alguns pacientes têm patologia gástrica óbvio (como no caso 2), outros podem desenvolver uma forma fisiopatologicamente distinta de gastroparesia resultante circula factores auto-imunes que podem causar disfunção mas não perturbações dos nervos ou músculos, tal como foi descrito [39, 40].

conclusão Em conclusão, nós descrevemos um exame patológico dos dois pacientes com gastroparesia diabética. Embora seja difícil generalizar com base em um número tão pequeno, estes casos não oferecer alguns insights sobre a patogênese da gastroparesia e também fornecer a base para várias hipóteses importante para estudos futuros
abreviações
nNOS:.
óxido nítrico sintase neuronal
HO-2:
heme oxigenase-2
ICC: células intersticiais de Cajal

SP:
substância P.
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte pelo NIDDK U01 DK073983-01 ( PJP, GF) e DK DK68055 e DK57061 (GF)
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