Endringer i gastrisk enteriske nervesystemet og muskel: En kasuistikk om to pasienter med diabetisk gastroparese

Endringer i gastrisk enteriske nervesystemet og muskel: En rapport om to pasienter med diabetisk gastroparese
Abstract
Bakgrunn
patofysiologiske grunnlag av diabetisk gastroparese er dårlig forstått, i stor grad på grunn av den nesten fullstendig mangel på data om nevropatologiske og molekylære forandringer i magen på pasientene. Eksperimentelle modeller indikerer ulike lesjoner påvirker vagus, muskler, enteriske nerveceller, interstitiell celler av Cajal (ICC) eller andre cellulære komponenter. Hensikten med denne studien var å bruke moderne analysemetoder for å bestemme morfologiske og molekylære endringer i mageveggen hos pasienter med diabetisk gastroparese.
Metoder
Full tykkelse mage biopsier ble oppnådd laparoskopisk fra to gastroparetic pasienter som gjennomgår kirurgiske inngrep og fra sykdomsfrie områder av kontrollpersonene gjennomgår andre former for gastrisk kirurgi. Prøvene ble behandlet for histologisk og immunhistokjemisk undersøkelse
. Resultater
Selv om begge pasientene hadde alvorlige refraktære symptomer med underernæring, som krever plassering av en gastrisk stimulator, en av dem hadde ingen vesentlige avvik sammenlignet med kontroller. Denne pasienten hadde en brå symptomene med en relativt kort varighet av diabetes som er godt kontrollert. Derimot, hadde den andre pasienten lang stående sprø og dårlig kontrollert diabetes med mange episoder av diabetisk ketoacidose og hyppige hypoglykemiske episoder. Histologisk undersøkelse i denne pasient avslørte økt fibrose i muskellagene samt betydelig færre nervefibre og myentericus nevroner som vurderes av PGP9.5 farging. Videre ble det betydelig reduksjon sett i farging for nevronal nitrogenoksid syntase, heme oksygenase-2, tyrosin hydroksylase samt for c-KIT.
Konklusjon
Vi konkluderer med at dårlig metabolsk kontroll forbundet med betydelige patologiske forandringer i gastrisk vegg som påvirker alle viktige komponenter, inkludert muskel, nevroner og ICC. Alvorlige symptomer kan oppstå i fravær av disse endringene, men og kan reflektere vagale, sentrale eller hormonelle påvirkninger. Gastroparesis er derfor sannsynlig å være en heterogen lidelse. Nøye molekylær og patologisk analyse kan gi mer presise fenotypiske differensiering og kaster innsikt i de underliggende mekanismene samt identifisere nye terapeutiske mål.
Bakgrunn
langvarige og dårlig kontrollert diabetes kan føre til mange forstyrrelser i mage-tarmfunksjon gastroparese, som er en av de mer vanlige. I tertiærpoliklinikk gastroparese er sett i 20-55% av pasienter med type I og opptil 30% av pasienter med type II diabetes [1]. Patogenesen av gastroparese er dårlig forstått, delvis på grunn av mangel på prospektive omfattende studier av mage patologi hos disse pasientene. Videre, mens dyremodeller tyder på at patogenesen av diabetisk gastroparese er sannsynlig å være multifaktoriell involverer vagus, iboende nerver, interstitiell celler og glatt muskulatur i magen, den relative betydningen av disse elementene for å forklare variasjoner i klinisk presentasjon og naturhistorie pasienter er fortsatt ukjent [2]. Her rapporterer vi først systematisk analyse av mage patologi i to mennesker med diabetisk gastroparese, ved hjelp av histologiske og immunhistokjemiske teknikker. Våre resultater understreker heterogenitet av dette syndromet, og gi flere hypoteser for fremtidige studier.
Metoder
Pasienter
Begge pasientene rapportert her ble henvist til University of Texas Medical Branch (UTMB) med diagnosen diabetisk gastroparese og ildfaste symptomer. Pasientene samtykket til å delta i en prospektiv studie av full tykkelse gastrisk biopsier erholdt laparoskopisk ved tidspunktet for kirurgisk plassering av en jejunal rør eller gastrisk, elektrisk stimulator plassering. Alle aldre rapporteres her er på den tiden av gastrisk biopsi.
Full tykkelse gastrisk biopsi
full tykkelse stykker av vev (1 x 2 cm i størrelse) ble tatt av kirurgen (GG) over nivået for den incisura i den fremre vegg av midtdelen av magen. Kontrollprøver (n = 2) ble oppnådd fra det tilsvarende område i ikke-diabetiske fete pasienter som gjennomgår mage-bypass kirurgi ved den samme kirurgen.
Patologisk og immunhistokjemisk undersøkelse av vev
For immunhistokjemi studier, biopsiprøver ble fiksert i 4 % paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 1 x fosfatbufferoppløsning, skylles i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) og neddykket over natten i 1 x PBS-oppløsning inneholdende 30% sukrose (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO). Alle inkubasjoner ble utført ved 4 ° C. De biopsier ble kuttet i tverrsnitt og frosset i Tissue-Tek oktober forbindelsen (elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA). 12 mikrometer tykke kryostatsnitt ble kuttet. En standard H & E og Trichrome flekk protokollen ble gjennomført på seksjonene. Tilstedeværelsen av fibrose ble vurdert ved hjelp Masson er Trichrome flekken. For immunhistokjemi seks forskjellige antistoffer ble anvendt ved å følge samme protokoll som er beskrevet nedenfor. Antistoffene som ble brukt var et polyklonalt kanin-anti-human-protein-genproduktet 9,5 (PGP 9,5) (1: 2000, ABD Serotec, Oxford, UK), polyklonalt kanin-anti-human nevronal nitrogenoksid syntase (nNOS) (1: 4000, Chemicon, Temecula, CA), polyklonalt sau anti-rotte-tyrosin hydroksylase (TH) (1: 200), polyklonalt kanin-anti-substans P (1: 1200, Chemicon, Temecula, CA), kanin anti-humant heme oksygenase II (HO-2- ) (1: 10000, kind gave fra Dr. Snyder, Johns Hopkins University, Baltimore, MA), polyklonale kanin anti-human c-Kit (2 ng /mL, MBL, Nagoya, Japan). Platene ble først skylt to ganger i 1 x PBS, etterfulgt av et blokkeringstrinn for ikke-spesifikk sekundært antistoff binding ved inkubering av vevet med et 1 x PBS, 10% normalt esel serum (NDS; Jackson Immunoresearch Lab, Inc., West Grove, PA) og 0,3% Triton × -100 (Pierce, Rockford, IL) løsning for en time. Den passende primært antistoff ble deretter fortynnet i 1 x PBS, 5% NDS, 0,3% Triton × -100 og inkubert over natten ved 4 ° C. En Cy3 konjugert esel anti-kanin sekundært antistoff eller en Cy3 konjugert esel anti-sau sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch Lab, Inc., West Grove, PA) fortynnet i en x PBS, 2,5% NDS, 0,3% Triton × -100 løsning var brukes til å visualisere immun-positive strukturer.
Institutional godkjenning
Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Texas Medical Branch og Mayo Clinic College of Medicine. Informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og kontroller.
Resultater
Kliniske presentasjoner
Tilfelle 1
Dette var en 37 år gammel hvit kvinne som utviklet type 1 diabetes ca 3 år før biopsi. Gastroparetic symptomer på kvalme og oppkast var til stede for omtrent samme varighet. Til tross for ulike behandlinger, fortsatte hun å ha alvorlig kvalme og oppkast, sammen med vekttap. Men hennes diabetes forble godt kontrollert hele med en HbA1c på 6,2% ved første presentasjonen.
Tilfelle 2
Dette var en 32 år gammel hvit kvinne med en historie med type I diabetes for omtrent et tiår. Den diabetes var relativt vanskelig å kontrollere med en rekke episoder av diabetisk ketoacidose og hyppige hypoglykemiske episoder. På tidspunktet for presentasjon hennes HbA1c varierte mellom 6,6 til 7%. For mer enn et år før plassering av en mage elektrisk stimulator, pasienten hadde problematiske symptomer på kvalme, oppkast og smerter med hyppige sykehusinnleggelser.
Begge pasientene hadde radiologisk og /eller scintigrafer tegn på alvorlig forsinket gastrisk tømming. Selv om formell testing av det autonome nervesystemet ikke ble utført, både pasienter hadde også hvile takykardi da de var relativt godt, i fravær av overt dehydrering. Til slutt, den langsiktige (> 1 år) respons på mage elektrisk stimulering var markert annerledes med pasienten en rapportering en bedring i symptomer mer enn 50% sammenlignet med baseline mens pasienten 2 opplevde ingen signifikant endring i hennes klinisk forløp patologiske forandringer i magen
Vurdering av fibrose (figur 1)
Figur 1 Farging for fibrose og for nevrale strukturer. Paneler A-C. Trichrome farging. Kontrollen (A) og seksjoner fra tilfellet 1 (B) viste ingen økning i fibrose, mens seksjoner fra beholderen 2 (C) viste en økning i fibrose i både muskellagene og langs den myenterisk plexus. Scale bar 200 mikrometer. Panelene D-F. PGP 9.5 immunoreaktivitets. PGP9.5 immunreaktivitet som en markør for nevronale strukturer var normal kontroll (D), og i tilfelle en (E). Det var en nedgang i PGP 9.5 immunoreaktivitets i både muskellagene og myentericus plexus i seksjoner fra sak 2 (F) antyder et tap av nervestrukturer. Paneler G-I. Tyrosin hydroksylase immunoreaktivitets. Tyrosinhydroksylase immunreaktivitet var normal i kontrollen (G). Seksjoner fra tilfelle 1 (H) som viser normal tyrosin hydroksylase immunoreaktivitets rundt myentericus plexus med en lsight nedgang i tyrosin hydroksylase immunoreaktivitets i muskellagene. Seksjoner fra case 2 (I) viste en markant tap av tyrosin hydroksylase immunoreaktivitets i alle regioner som tyder på et tap på ytre nervefibre. Scale bar 100 mikrometer. Rundskriv muskel (CM), myentericus plexus (MP), langsgående muskel (LM).
Sak 1
Seksjoner fra pasienten med godt kontrollert diabetes viste en normal fargemønster uten tegn til økt fibrose i muskellagene.
Tilfelle 2
i motsetning seksjoner fra vevet innhentet fra pasienten med dårlig kontrollert diabetes viste en markant økning i fibrose i både muskellagene og rundt myentericus plexus.
Ente nerver (figur 1)
antall nervecellelegemer og fibre ble vurdert ved hjelp antistoffer mot pan-nevronale maker PGP 9.5.
Tilfelle 1
antall nervefibre i de sirkulære og langsgående muskellagene ble vanlig i deler fra pasienten med velkontrollerte diabetes sammenlignet med kontrollene.
Tilfelle 2
det var en 40-50% reduksjon i antall nervefibre i pasienten med dårlig kontrollert diabetes sammenlignet med kontrollene.
endringer i ekspresjon av nevrotransmittere og relaterte proteiner (figur 2)
Figur 2 Immunoreactiivty for nNOS, SP og HO2 som markører for hemmende og eksitatoriske nervecellelegemer og fiber. Paneler A-C. Normal immunoreaktivitets for nNOS kontroll (A) og sak 1 (B). nNOS immunoreaktivitets ble markert redusert i tilfelle 2 (C). Panelene D-F. Substans P uttrykk var normal kontroll (D), sak 1 (E), og saken 2 (F). Paneler G-I. Hem oksygenase II (HO-2) immunoreaktivitet var normal kontroll (G) og case 1 (H). Seksjoner fra Tilfelle 2 (I) viste et underskudd på HO-2 immunoreaktivitets som sammen med nedgangen i nNOS immunoreactivty antyder et tap av hemmende inngang ot glatt muskulatur. Scale bar 100 mikrometer. Sirkulære muskel (CM), langsgående muskel (LM).
Forsøk ble deretter rettet til å fastslå om tap av nervefibre sett var spesifikke for en bestemt undergruppe av nervefibre. Antistoffer mot tyrosin hydroksylase (TH) ble anvendt for å immunolabel ytre nervefibre. Antistoffer mot substans P (SP) og nevronal nitrogenoksid syntase (nNOS) ble anvendt for å immunolabel eksitatoriske nerver og hemmende nerver respektivt. Antistoffer mot heme oksygenase-2 (HO2) ble anvendt til å merke nerver og ICC som inneholder hem oksygenase, det enzym som gir opphav til karbonmonoksyd, som er kjent for å regulere nevrotransmisjon og glatt muskel membranpotensiale [3, 4].
Eksempel 1
Ingen endringer i ekspresjon av SP, nNOS, H02 (figur 2) ble registrert i seksjoner fra pasienten med godt kontrollert diabetes sammenlignet med kontrollene. Det var en liten reduksjon i antallet TH positive fibre i muskellagene i denne pasient; Men TH immunoreaktivitets rundt ganglia var normalt, noe som tyder på en intakt ytre innervasjon til den iboende nervesystemet (figur 1).
Tilfelle 2
Ingen signifikante endringer ble sett med SP antistoff, men immunolabeling for nNOS, H02 (figur 2 ) og TH (figur 1) ble redusert (med 40-50%) i pasienten med dårlig kontrollert diabetes.
Interstitiale celler av Cajal
Menneskelig gastrisk ICC er av to store typer-de som er spredt over hele magen i begge lag av muskel (ICC-IM) og de som er forbundet med den myenterisk plexus (ICC-MY) i kroppen og antrum, men ikke i den mer proksimale magesekken. I denne studien ble ICC immunolabeled ved bruk av et antistoff til c-kit. ICC-MIN ikke ble visualisert i enten pasienten eller i kontroll vev i denne regionen av magen.
Tilfelle 1
Fordeling av ICC-IM var normal i pasienten med godt kontrollert diabetes med normale mengder ICC (figur 3 ). Figur 3 c-Kit uttrykk som en markør for interstitiell celler av Cajal. Control (A) og sak 1 (B) viste normal c-Kit immunoreaktivitets mens i tilfelle 2 (C) var det et tap av c-Kit immunoreaktivitets tyder på en redusert antall ICC. Scale bar 100 mikrometer. Rundskriv muskel (CM), langsgående muskel (LM).
Tilfelle 2
I pasient med dårlig kontrollert diabetes antall c-Kit positive ICC-IM ble redusert i begge muskellagene (med 30-40%, Figur 3).
diskusjon
tross for sin eksistens som et klinisk syndrom i mer enn et halvt århundre [5], patogenesen av diabetisk gastroparese fortsatt ukjent. Studier på eksperimentelle modeller av diabetes er relativt snevert fokusert på interessene til enkelte laboratorier og indikere involvering av flere celletyper (nevroner, ICC, muskel), som anmeldte nylig [2]. De to mest konsistente funnene synes ikke å medføre endringer i neuronal nNOS uttrykk og ICC. Imidlertid har et samlende tema eller hypotese for disse funnene fortsatt ikke dukket opp delvis på grunn av manglende evne til å validere dem i mennesker, i hvem tilgang til de dypere egenutført strukturer generelt krever kirurgi. De få studiene som har fått mage vev på denne måten ble vanligvis gjort i en tid da avanserte bildebehandlingsprogrammer og molekylære teknologier ikke eksisterer og har gitt resultater som er inkonsekvent i beste fall. Vi rapporterer en systematisk analyse av mageenterisk nervesystem og muskel av to pasienter med diabetisk gastroparese, sammenlignet med tilsvarende vev oppnådd fra overvektige kontroller. Slående endringer ble sett i en pasient; disse inkluderte en betydelig grad av fibrose involverer muskel lag, som trolig gjenspeiler konsekvensene av alvorlig og kanskje repeterende vev skade fra metabolske, vaskulære eller andre komplikasjoner av diabetes.
Disse endringene er i tråd med en tidligere rapport som viser alvorlig kollagen deponering og fibrose i 4 pasienter med ildfast diabetisk gastroparese [6, 7]. På den annen side, en annen studie av 16 pasienter med langvarige diabetes (fem av dem hadde gastroparese) viste ingen abnormaliteter i glatt muskulatur (eller andre strukturer) [8]. Videre, ingen av disse studiene funnet noen vesentlige endringer i myentericus plexus, som er i motsetning til våre funn i sak 2, hvor en stor reduksjon i myentericus neuronal farging ble sett sammen med en reduksjon i markører for hemmende signalstoffer. Selv om vi ikke studerer markører for apoptose eller celledød i denne studien funn av redusert PGP9.5 merking tyder på at disse endringene reflekterer en grad av neuronal tap og ikke rett og slett bare tap av ekspresjon av det syntetiske enzym eller nevrotransmitter. Imidlertid har bevis for selve gastrisk nevronale tap i diabetes ikke blitt rapportert i enten dyr eller pasienter [2], selv om en enkelt tilfelle studie av en pasient med idiopatisk gastroparese avslørte betydelig redusert antall av PGP 9,5-positive myentericus nevroner [9].
Nitrogenoksid er en av de viktigste nevrotransmittere for vedlikehold av normal gastrisk motilitet og det er betydelig eksperimentelt litteratur impliserer en rolle for dets tap i patogenesen av forsinket gastrisk tømming [10-19]. Nå nylig, en studie av 36 mannlige diabetespasienter som gjennomgår gastrisk reseksjon viste signifikant tap av nNOS samt SP uttrykk; Det var imidlertid ingen informasjon om hvorvidt disse pasientene var symptomatisk eller hadde svekket gastrisk motilitet [20]. I vår pasient med dårlig kontrollert diabetes, ble reduksjonen i total neuronal farging ledsaget av et betydelig tap av nNOS, men ikke SP-ekspresjon, noe som tyder på relativt spesifikk skade på inhibitoriske neuroner. I denne sammenheng er vårt studium også den første til å rapportere endringer i HO-2, den konstitutive form av heme oksygenase som er i stor grad ansvarlig for produksjon av karbonmonoksyd, en annen endogene gassformig neuromodulator av stor betydning i den inhiberende kontroll av gastrointestinal motilitet [3- , 21-25]. Den samlede tap av både hemmende molekyler dermed forventes å føre til en dyptgripende forstyrrelse av mage fysiologi som ble sett i vår pasient (sak 2). Denne saken illustrerer også forskjeller og likheter mellom endringer i diabetes gastropathy sammenlignet med diabetiker enteropati. Sistnevnte er også forbundet med tap av nNOS og TH uttrykk, men derimot, presenterer med økt ekspresjon av SP [26], som tyder på regionale variasjoner i effekten av diabetes på den enterisk nervesystem.
Slutt vi også sett på endringer i ICC bruker c-Kit som en markør. ICC spiller flere viktige roller i mage fysiologi inkludert innstilling av pacemaker rytme, og deltakelse i nevrotransmisjon og mechanosensitivity [21, 27-29]. Både in vivo og in vitro studier av eksperimentell diabetes rapport ICC uttømming, kanskje sekundært til tap av insulin /IGF og /eller nitrogenoksid eller annet, som ennå ikke bestemt, overlevelsesfaktorer [7, 30-32]. Våre funn av betydelig tap av c-Kit uttrykk i Tilfelle 2 er i samsvar med andre endringer som angis i denne pasienten, samt med nye rapporter i mennesker. Således fire av ni pasienter med ildfast diabetisk gastroparese ble funnet å ha signifikant tap av ICC [33]. En reduksjon i c-Kit farging ble også bemerket i studien på diabetespasienter som gjennomgår gastrisk reseksjon for kreft [20].
Vår studie er viktig fordi det gir et sjeldent innblikk i den patologiske samt molekylære endringer av potensielle betydning i patogenesen av diabetisk gastroparese. I tillegg er det flere bemerkelsesverdige lærdom fra disse tilfellene. Til å begynne med, det syntes å være en klar sammenheng mellom de histologiske forandringer bemerket og det kliniske forløpet av diabetes, kanskje noe som indikerer viktigheten av dårlig glykemisk kontroll i deres utvikling. Forekomsten av forsinket tømming korrelerer svakt med varigheten av diabetes [34]. Beslektede faktorer, slik som ekstrem hyper- eller hypoglykemi, selv om kortvarig, kan være enda mer viktig ettersom begge betingelser har vist seg eksperimentelt å forårsake neuronal skade og død (selv om hyperglykemi ikke har vist seg å påvirke ICC i en dyremodell) [31, 35, 36]. Det er derfor mulig at pasienten 1 ble spart store endringer i mage patologi fordi hun opplevde en kortere og metabolsk mer stabil løpet av diabetes enn pasient 2. Den eneste funn av notat i vev fra denne pasienten var en svak nedgang i TH immunoreaktivitets i sirkulær muskel lag, men ikke i den myenterisk plexus. Siden ytre nervesystemet ikke direkte innerverer glatt muskulatur, kan disse fibrene representere nervene krysser deres vei til submucosal plexus. Alternativt kan disse også være prosesser fra iboende neuroner som det er en undergruppe av enteriske nerver som også uttrykker TH [37]. Uansett, clinicopathological implikasjon av dette funnet er fortsatt uklart.
Mer bemerkelsesverdig enn de ovennevnte observasjon, var imidlertid at endringene i magesekken syntes å ha noe forhold til klinisk symptomatologi. Derfor, til tross sammenlignbar klinisk alvorlighetsgrad, de to pasientene hadde dramatisk forskjeller i mage patologi, med ett å være i hovedsak normal mens det andre viser et spekter av misdannelser som påvirker nerve, muskel og ICC. Disse funnene gir rom for flere ulike spekulasjoner. For det første er det mulig at endringene i Tilfelle 2 representerer "end-stage" patologi som følge av kumulative og repeterende metabolske fornærmelser. Som sådan, kan deres større klinisk betydning er å forutsi intractability heller enn årsakssammenheng, som sikkert foreslått av svikt i denne pasient å svare på alle intervensjoner inkludert mage elektrisk stimulering. Hvis dette er sant, så gastroparese symptomer selv kan skyldes endringer som enten oppstår tidligere (som kanskje lite tap av TH immunreaktive fibre i sirkulære muskellaget) eller er for subtile å bli oppdaget av de teknikkene vi har brukt (f.eks unormalt i subcellulære signalveier i fravær av morfologiske endringer, som har blitt beskrevet i magemuskelen fra diabetiske dyr [38].
Dernest kan det hevdes at pasientenes symptomer involvert mekanismer som vi ikke undersøke, for eksempel vågal dysfunksjon (foreslått av tilstedeværelsen av hvile takykardi i begge tilfeller). endringer i vagal funksjon har tradisjonelt vært innblandet i patogenesen av gastroparese, selv om solid dokumentasjon mangler, og sammenhengen mellom autonom dysfunksjon og forsinket ventrikkeltømming er beskjeden i beste [2 , 34]. til slutt, er det mulig at diabetiker gastroparese er virkelig en heterogen lidelse og at mens noen pasienter har tydelig mage patologi (som i tilfellet to), mens andre kan utvikle en patofysiologisk distinkt form for gastroparese som følge av sirkulerende autoimmune faktorer som kan forårsake dysfunksjon, men ikke forstyrrelse av nerver eller muskler, som har blitt beskrevet [39, 40].
Konklusjon
Avslutningsvis har vi beskrevet en detaljert patologisk undersøkelse av to pasienter med diabetisk gastroparese. Selv om det er vanskelig å generalisere basert på et så lite antall, disse tilfellene tilby noen innsikt i patogenesen av gastroparese og også gi grunnlag for flere viktige hypotese for fremtidige studier
Forkortelser
nNOS.
neuronal nitrogenoksid syntase
HO-2:
heme oxygenase-2
ICC:
interstitielle celler av Cajal
SP:
substans P.
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet delvis av NIDDK U01 DK073983-01 ( PJP, GF) og DK DK68055 og DK57061 (GF)
forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder. 12876_2007_254_MOESM1_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 1 12876_2007_254_MOESM2_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 2 12876_2007_254_MOESM3_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 3 konkurrerende interesser
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.

• Verdien av serumpepsinogen nivåer for diagnose av gastriske sykdommer i kinesisk Han personer i MidSouth Kina
• Marginal grumset band og lyseblå kam, skilt observert i forstørrelses smale bånd bildebehandling endoskopi, er tegn på mage tarm metaplasia