Samband mellan HER-2 /neu (erbB-2) expressionsnivån och terapeutiska effekten av kombinationsbehandling med Herceptin och cytostatika i magcancer cell lines

korrelation mellan HER-2 /neu (erbB-2) expressionsnivån och terapeutiska effekten av kombinationsbehandling med Herceptin och cytostatika i gastric cancercellinjer Bild Sammanfattning
Introduktion
Även avancerad magsäckscancer har många begränsningar och svarsfrekvensen är marginell vid kemoterapi. Överexpression av human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER-2 /neu-
) genen och dess protein är associerade med ökad celldelning och en hög hastighet av tumörtillväxt och har rapporterats i flera maligniteter. Speciellt, ungefär 30% av bröstcancerpatienter har överuttryck av HER-2 /neu-
proteinet och överuttryck metastasera snabbare, inducerar resistans kemoterapi och nedreglera funktion av östrogenreceptorn. Rekombinant humaniserad anti-HER2-antikropp (Herceptin) inhiberar proliferation av HER-2 /neu och användning av detta i kombination i metastaserande bröstcancer som överuttrycker
tumörceller har ökad cytotoxicitet hos kemoterapeutiska medel.
Metoder
Vi utvärderade uttrycket av HER-2 /neu
protein i gastriska cellinjer genom FACS och sedan jämföra den cytotoxicitet i kemoterapeutika (doxorubicin, cisplatin, paclitaxel, 5-FU) för sig och i kombination med Herceptin enligt uttrycket av HER-2 /neu
protein med MTT-analys.
Resultat
1. NCI-N87 (88%) magcancer-cellinjen och SK-BR-3 (89%) bröstcancercellinje med stark positivitet av HER- 2 /neu
uttryck. YBC-2 (55%) och YBC-3 (48%) magcancer-cellinjen med förmedlade, svag positivitet respektive. Negativ kontroll U-87 MG (6%) hjärncancer-cellinjen var visade lågt uttryck av HER-2 /neu. 2. Celltillväxt dosberoende hämmade i HER-2 /neu
positiv, kontroll cellinje SK-BR-3 av Herceptinbehandling, men inte observerats i HER-2 /neu
negativ kontroll cellinje U-87 MG. Effektiv tillväxthämning observerades inte i magcancer cellinjer med enda behandling med Herceptin, alla cellinjer observerade dosberoende tillväxthämning till kemoterapeutiska medel (doxorubicin, cisplatin, paclitaxel och 5-FU). 3. Kombination av Herceptin med doxorubicin observerade synergistiska effekter i alla cancercellinjer utom YBC-3, kombinationen Herceptin med cisplatin observerade NCI-N87 och SK-BR-3 och kombinationen Herceptin med paklitaxel observerades synergistiska effekter i YBC-2. Kombinationen Herceptin med 5-FU observerade antagonistiska effekter i alla cancercellinjer.
Slutsatser
Enligt HER-2 /neu
expressionsnivå, effekten av anti-cancermedel observerades på olika sätt i kombination med Herceptin med kemoterapeutiska medel. Detta tyder på att HER-2 /neu-
uttrycksnivå kan appliceras standard selektionskombinationsläkemedel i kombination av Herceptin Med kemoterapeutiska medel i magcancer.
Nyckelord
HER-2 /neu-
(erbB- 2) HERCEPTIN Magcancer Kombinationsbehandling behandling~~POS=HEADCOMP CI Inledning
Eftersom känt att signaltransduktionsvägar av tillväxtfaktor och dess receptor spelar en impotent roll i cancerframkallande processen många studier genomförs. HER-2 /neu-
(erbB-2) protein, cellmembran glykoprotein, är en tillväxtfaktorreceptor har aktiviteten av receptor-tyrosinkinas [1]. HER2 har ofta upptäcks i ett brett spektrum av humana tumörer. Normal cellsekre samband med HER-2 /neu-protein, men förstörelsen av normala celler styr orsakar proteinuttryck, ökar graden av celldelning och tillväxt inducerar precancerous förändringar [2].
HER-2 /neu
( erbB-2) -genen, som är belägen på den humana kromosomen 17q21 [3], som har en partiell homologi med den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR) [4, 5]. EGF (epidermal tillväxtfaktor) receptorfamiljen har aktiviteten av receptor-tyrosinkinas och bestod av EGF-receptor, c-erbB-2, c-erbB-3 och c-erbB-4 [6-8]. HER-2 /neu-onkoproteinet, kodar för ett p185kD membranglykoprotein, receptor som är inblandad i tillväxten och diffentiation av tumörcellerna och 25 ~ 30% överuttryckt i bröst-, äggstocks- och gastriska karcinom [9-12] och prognosen av dessa patienter är dålig [13-15] Överexpression av HER-2 /neu-
genen.
och det är protein är associerade bröstcancer patientens prognos och terapi [16-18] och uttryck av HER-2 /neu
är starkt krävs för tumörtillväxt [19]. De tyder på att HER-2 /neu
involverad i bröstcancer förekomsten, progression och maligna och HER-2 /neu
uttryck är viktigare än hormonreceptorer på patienter med lymfkörtelmetastaser [9]. Därför är dessa terapeutiska mål HER-2 /neu
proteinläkemedel, rekombinant humaniserad anti-HER-2 /neu
antikropp - Herceptin, effektiva vid behandling av bröstcancer har rapporterats [20] Gastric
. cancer är den vanligaste cancern i Kina. Förekomsten av magcancer är flerstegscancerframkallande processen med variation genetiska mutationer. HER-2-status är korrelerad med djupet av invasion, TNM skede, lymfkörtel och avlägsna metastaser av magcancer [21]. HER-2 /neu överuttryck är relaterad till dålig prognos av magcancer, men har en blygsam effekt på överlevnaden i magcancer som en oberoende prognos faktor [22]. Herceptin som ett cytostatiskt medel, inte kan förväntas mono terapi effektivt av antitumöreffekter, men en hel del forskning pågår för kombinationsterapi med andra cytostatika eller biologiska medel. Men fortfarande inte exakt studie av kombinationsbehandling med Herceptin med cytostatika i gastric cellinjer [13]. Därför, i denna studie undersöker vi den effektiva kombinationen av Herceptin (trastuzumab Genentech Inc., CA, USA) [23-25], inriktning för HER-2 /neu
onkoprotein, med cytostatika i gastric cancercellinjer , beroende på HER-2 /neu
onkoprotein expression.
Material och metoder
Celler
magcancer cellinjer användes YBC-2, YBC-3 och NCI-N 87 cellinjer. De YBC-2 och YBC-3-cellinjer etablerades från intraperitoneal magsäckscancer av Department of Pathology, Yanbian University. NCI-N 87 cellinje hemmahörande i Förenade staten NCI (National Cancer Institute, CRL5822, USA). U-87 MG (ATCC, HTB14) hjärntumör cell-linje och SK-BR-3 (ATCC, HTB30) bröstcancercellinje användes för HER-2 /neu
proteinuttryck positiv och negativ kontroll, respektive.
Dessa cellinje odlades användning minimum essential media (MEM, GINCO BRL, Grand Island, NY, USA), som innehåller inaktiv (vid 56 ° C under 30 min) 10% fetalt bovint serum (FBS, GINCO BRL, Grand Island , NY, USA), 100 enheter /ml penicillin och 0,1 mg /ml streptomycin. Alla odlings inkubationer utfördes i en fuktad 37 ° C, 5% CO <sub>2 inkubator.
Drugs
Herceptin, Humanoid rekombinant HER-2 /neu-antikropp, var från USA (Trastuzumab, 440 mg /20 ml , Genentech Inc., San Francisco, CA, USA), och erkända anticancerläkemedel, effekt i magcancer, Adriamycin (Doxorubicin, 10 mg /5 ml), Cisplatin (Cisplatin, 10 mg /flaska), Taxol (Paclitaxel, 30 mg /flaska) och 5-FU (5-fluorouracil 250 mg /5 ml) var från Kina. När man gör experiment varje läkemedel används utspädd i cellodlingsmedia.
FACS-analys (HER-2 /neu-proteinuttryck)
HER-2 /neu-
(erbB-2) onkoproteinet expression utfördes med användning Fluorescence- aktiverad cellsorterare (FACS, Becton Dickinson, USA) utförde immunfenotypning i cellytan. Kulturceller (1 x 10 <sup>6) skördades efter behandling med trypsin-EDTA (GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) och inkuberades med den primära antikroppen, anti-HER-2 /neu
antikropp (Mouse Monoclonal antikropp, LAB VISION, CA, USA), i en 1: 200 spädning och 50 pl under 1 timme vid 4 ° C. Färgade celler tvättades två gånger med kall PBS. Färgning och tvättning utfördes i PBS (fosfatbuffrad buffertlösning, pH 7,6 Ca ++ Mg ++ fri, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 2% FBS. Efter tvättning två gånger en sekundär FITC-antimus-antikropp (anti-mus FITC-konjugerad antikropp, Novocastra, USA) användes i en 1:40 spädning och 50 pl inkuberades under 40 min vid 4 ° C, efter att sedan tvättas två gånger med kall PBS. Efter avslutad färgning var filtration cellösning begagnade 40 um nylonnät obtain den enda cell suspenderade ämnen och gör analysen i FACS.
MTT-analys (in vitro Herceptin och cytostatika känslighetstest i gastriska cancercellinjer) katalog MTT-analysen har använts för in vitro-
drogkänslighetstest i gastriska cancercellinjer. MTT-färg [3- (4,5-dimetyl tiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid] reduceras till formazan (en mörkt lila vattenolöslig förening) av succinatdehydrogenas systemet av aktivt mitokondrier, och följaktligen, specifikt används för att den optiska densiteten (OD) för brunnarna mättes i en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) läsare Sunrise (TECAN) vid 560 nm. OD korrelerade linjärt med antalet livskraftiga celler. Celler ströks ut med 180 ul media från 1 × 10 4-celler per brunn i en 96 brunnars platta med flera brunnar och inkuberades under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
För enda läkemedel känslighetstest, har två metoder som tillämpas. Först, Herceptin (4,625, 9,25, 18,5, 37 ^ M), doxorubicin (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 ^ M), cisplatin (0,166, 1,666, 16,66, 166,6 ^ M), paklitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 ^ M) och 5-FU (38,43, 384,37, 3843,78, 38437,8 iM) späddes i 20 | il medium och sattes till plattorna och inkuberades under 4 dagar. Kontrollgruppen sattes bara media utan droger och odlades samma löptider. För det andra, den synergistiska effekten av kombinationsbehandling med en kombination av Herceptin + doxorubicin, Herceptin + Cisplatin, Herceptin + Paclitaxel och Herceptin + 5- FU.
När kombinationsbehandling Herceptin och varje läkemedel mot cancer utförs känslighetstest, fast molkoncentration procent av båda läkemedlen, efter sedan tillsätta 50 | il MTT ades MTT löstes i fosfatbuffert till en koncentration av 2 mg /| il, sattes till varje brunn och inkuberades 4 h till. Efter avlägsnande av supernatanten, lämnade 150 pl DMSO (Dimetylsulfoxid, Sigma, USA) i varje brunn och försiktigt skaka ca 15 minuter för upplösning av genererade formazan. Den optiska densiteten (OD) för brunnarna mättes i en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) läsare vid 562 och 720 nm. Den maligna cellöverlevnad beräknades genom ekvationen (OD av läkemedel väl OD av blankbrunnen /medelvärde OD av kontrollbrunn - OD av blankbrunnen) x 100%. MTT-analysen utfördes och upprepades tre gånger för varje dos av läkemedlet (5 brunn) Resultaten analyserades för att erhålla
CI värde beräkning efter kombinationsbehandling
CI (kombination index) genomsnittet. Erhölls genom formeln för chou-Talalay, beräknades från värdet av IC50 (Dm) jämfördes effekten och kurvan kapaciteten~~POS=HEADCOMP (m-värde). Klassiska formeln för isobologrammet (CI = 1) var följande. CI =
D
1
/News Dx 1
+
D
2 Review /News Dx 2 Review nämnare (Dx) 1 och (Dx) 2 var ange hur stor procentandel cytotoxiciteten av när de behandlas med enda läkemedlet ensamt; Täljaren i (D) 1 och (D) 2 var indikerar den procentuella cytotoxiciteten hos vid behandling med båda läkemedlen. Dx =
Dm fa /News 1
-
fa en
m
Dm är medianeffektdosen (IC50), detta beräknade av median-effekt kurva av X-intercept från antilog. X
=
log D
kontra Y
=
log f
en
/News 1
-
f
en
m är lutningen av medianeffekt plot. Multipel läkemedelseffekt analys med hjälp av Calcusyn (Biosoft, Cambridge, UK), beräknades värden på m, Dm, Dx, och CI. (Dx) 1 och (Dx) 2 beräknades med hjälp av Chou-Talalay median-effekt formel. CI < 1, CI = 1, Cl > 1 kallades synergism, summering och antagonism effekter respektive
Statistisk utvärdering
Statistisk analys av data utfördes med hjälp av den tvåsidiga Students t
-testet (SPSS 13,0 programvara, SPSS, Chicago, IL). . p
värden mindre än 0,05 ansågs statistiskt signifikant. Variansanalys (ANOVA) användes för flera gruppjämförelser för att bestämma de potentiella antitumöreffekter mellan grupper.
Resultat
HER-2 /neu-uttryck i gastriska cancercellinjer genom FACS
uttryck av HER2 /neu protein analyserades i tre olika magcancer cellinjer (YBC-2, YBC-3 och NCI-N87). Uttrycket av detta proteinis 48% (svag), 55% (medium) och 88% (stark) i YBC-2, YBC-3 och NCI-N87, respektive. Uttrycket av detta protein var 89% i positiv bröstcancer-cellinjen SK-BR-3, och 6% i negativt hjärntumör cellinjen U-87 MG (Figur 1). Figur 1 HER-2 /neu-uttryck i gastriska cancercellinjer. Uttrycket av HER2 /neu-protein i alla cellinjer cancer mättes genom fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys. HER2 /neu-uttryck i tre gastriska cancercellinjer (YBC-2, YBC-3 och NCI-N87) var 48% (svag), 55% (medium) och 88% (stark), respektive. Alla grupper av isotypisk kontroll var inte mer än 0,5% (data inte visade). Som positiv kontroll, är SK-BR-3 av HER2 /neu uttryck 89%. U-87 MG uppvisade lägre uttryck av HER2 /neu (6%) som negetive kontroll.
Känslighet magcancer cellinje för att Herceptin och anti-cancerläkemedel och analys av känsligheten för enstaka läkemedelsbehandling in vitro
Vid engångsbruk av Herceptin, gripandet av celltillväxt var svag och IC 50 var inte detekterbar in vitro med magcancer cellinje (Figur 2). Däremot fyra olika cytostatika (doxorubincin, cisplatin, paklitaxel och 5-FU) visade dosberoende hämning av celltillväxt och IC 50 detekterades (tabell 1, figur 2). Figur 2 Chemosensitivity av Herceptin och fyra anti-cancerläkemedel i gastric cancercellinjer. Vid engångsbruk av Herceptin, gripandet av celltillväxt var svag och IC50 var inte detekterbar in vitro med magcancer cellinje. I motsats härtill fyra olika anticancerläkemedel (doxorubincin, cisplatin, paklitaxel och 5-FU) visade dosberoende inhibering av celltillväxt och IC50 detekterades.
Tabell 1 IC30 och IC50 av fem anticancermedel mot YBC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG och SK-BR-3 cellinjer
Cytostatika
Cellinjer (IC30) iM
YBC-2

YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
Anticancermedel
Cellinjer (IC 50) iM
YBC-2 Review YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
Effekten av kombinationen av Herceptin och anticancerläkemedel
I kombinationen av Herceptin och doxorubincin behandlingen bedömdes synergistisk effekt observeras i YBC-2 och NCI-N87-celler, men inte i YBC-3-cellinjen, som har svag uttryck av HER2 /neu
protein (tabell 2, figur 3a, P
< 0,05). I kombinationen av Herceptin och cisplatin, var de synergieffekter som observerats i SK-BR-3, NCI-N87 och YBC-3-cellinjer (CI < 1, P Hotel < 0,05). Emellertid var de hämmande effekterna som observerats i YBC-2 och U-87 MG-cellinjer (Kombination indexera > 1, P
< 0,05) (tabell 3, figur 3b). Behandlingen av Herceptin och paklitaxel, i YBC-3 och U-87 MG-cellinjer, var de hämmande effekter som observerats (Cl > 1), dock i YBC-3-cellinjen, synergieffekten observerades (Cl < 1 P Hotel < 0,05). I SK-BR-3 och NCI-87 cellinjer, var effekterna annorlunda beror på den dos av de läkemedel (tabell 4, figur 3c). I kombinationen av Herceptin och 5-FU, var den hämmande effekten observerades i alla cellinjer (CI > 1, P Hotel < 0,05) (tabell 5, figur 3d) .table två beräknade värden för kombinationen Index som en tillväxthämmande effekt av kombinationsbehandling med Herceptin och doxorubicin i magcancer cellinjer
YBC-2
kombination indexvärde
Parameter (M)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2,93
0,54
0,98
HER 1201,02
0,32
0,91
DOX + HER
0,09
0,05
0,03
0,25
0,74
0,96
Diagnos kombinerad effekt
synergi
synergi
synergi
YBC-3
kombination indexvärde
Parameter (M)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2,310
0,768
0,946
HER 46,063

0,623 0,970
DOX + HER
0,266
0,598
1,377
0,406
0,469
0,925
Diagnos kombinerad effekt
synergi
samverkan
antagonism
NCI-N87
Kombination index Värde
Parameter (pM) Review Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,070
0,398
0,864
HER
113.350
0,191
0,635
DOX + HER
0,005
0,004
0,003
0,000
0,437
0,995
Diagnos kombinerad effekt
synergi
synergi
synergi
U-87 MG
kombination index Värde
Parameter (^ M)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,295
0,620
0,997
HER
1845,5
0,457
0,860
DOX + HER
0,441
0,435
0,448
0,101
0,589
0,992
Diagnos kombinerad effekt
synergi
samverkan
synergi
SK-BR-3
Kombination indexvärde
Parameter (iM) Review Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,103
0,832
0,998
HER
1.424.000
0,046
0,435
DOX +
HER 0,046
0,074
0,117
0,005
0,616
0,985
Diagnos kombinerad effekt
synergi
synergi
synergi
DOX
, doxorubicin; HER
, Herceptin.
Figur 3 Kombination index som en tillväxthämmande effekt av kombinationsbehandling med Herceptin® och anti-cancermedel. en. I kombinationen av Herceptin och doxorubincin behandlingen bedömdes synergistisk effekt observeras i YBC-2 och NCI-N87-celler, men inte i YBC-3-cellinjen. b. I kombinationen av Herceptin och cisplatin, var de synergieffekter som observerats i SK-BR-3, NCI-N87 och YBC-3-cellinjer (CI < 1). Emellertid var de hämmande effekterna som observerats i YBC-2 och U-87 MG-cellinjer (Cl > 1). c. Behandlingen av Herceptin och paklitaxel, i YBC-3 och U-87 MG-cellinjer, var de hämmande effekter som observerats (Cl > 1), dock i YBC-3-cellinjen, synergieffekten observerades (Cl < 1 ). I SK-BR-3 och NCI-87 cellinjer, var effekterna olika beroende på dosen av läkemedlen. d. I kombinationen av Herceptin och 5-FU, fick de inhibitoriska effekterna observerades i samtliga cellinjer (Cl > 1).
Tabell 3 Beräknade värden för kombinationsindex som en tillväxthämmande effekt av kombinationsbehandling med Herceptin® och cisplatin i magcancer cellinjer
YBC-2
Kombination indexvärde
Parameter (M)
Drug
ED50

ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
4,512
0,921
0,882
HER
1201,0
0,316
0,915
CDDP + HER
1,375
2,707
5,337
2,232
0,587
0,965
Diagnos kombinerade effekten
antagonism
antagonism
antagonism
YBC-3
Kombination index Värde
Parameter (pM) Review Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
30,733
2,227
0,929
HER
46,063
0,623
0,970
CDDP + HER
0,274
0,110
0,054
12,091
1,472
0,998
Diagnos kombinerad effekt
synergi
synergi
synergi
NCI-N87
kombination index värdet
Parameter (pM) Review Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
45,86
0,53
0,93
HER
1.13E + 05
0,19
0,63
CDDP + HER
0,03
0,01
0,01
0,83
0,88
0,96
Diagnos kombinerad effekt
synergi
synergi
synergi
U-87 MG
kombination indexvärde
Parameter (iM) Review Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
5,65
1,08
0,98
HER 1845,53
0,46
0,86
CDDP + HER
9,18
9,85
10,58
2,56
1,01
0,99
Diagnos kombinerad effekt
antagonism
antagonism
antagonism
SK-BR-3
Kombination indexvärde
Parameter (iM) Review Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r</sup></sub>