Corrélation entre HER-2 /neu (erbB-2) le niveau d'expression et l'effet thérapeutique du traitement combiné avec HERCEPTIN et agents chimiothérapeutiques dans des lignées cellulaires de cancer gastrique

Corrélation entre HER-2 /neu (erbB-2) le niveau d'expression et l'effet thérapeutique du traitement combiné avec HERCEPTIN et agents chimiothérapeutiques dans des lignées cellulaires de cancer gastrique
Résumé Introduction
Bien que le cancer gastrique avancé a de nombreuses limites et la réponse taux est marginal en chimiothérapie. La surexpression du récepteur de croissance épidermique humain du facteur 2 (HER-2 /neu
), le gène et sa protéine est associée à la division cellulaire accrue et un taux élevé de croissance de la tumeur et ont été signalées dans plusieurs tumeurs malignes. En particulier, environ 30% des patients atteints de cancer du sein ont surexpression de HER-2 /neu
protéine et la surexpression métastaser plus rapide, induit une résistance à la chimiothérapie et à réguler négativement la fonction du récepteur des oestrogènes. Recombinant anti-HER2 anticorps humanisé (Herceptin) inhibe la prolifération de HER-2 /neu
cellules tumorales surexprimant et l'utilisation de ce en combinaison dans le cancer du sein métastatique ont augmenté la cytotoxicité d'agents chimiothérapeutiques.
Méthodes
Nous avons évalué l'expression de HER-2 /neu
protéines dans des lignées de cellules gastriques par FACS, puis en comparant la cytotoxicité des agents chimiothérapeutiques (doxorubicine, le cisplatine, le paclitaxel, le 5-FU) seul et en combinaison avec l'Herceptin selon l'expression de HER-2 Résultats de /neu
protéines par dosage MTT.
1. NCI-N87 (88%) lignée cellulaire de cancer gastrique et SK-BR-3 (89%) de la lignée cellulaire de cancer du sein avec une forte positivité de HER l'expression de 2 /neu. YBC-2 (55%) et YBC-3 (48%) de la lignée cellulaire de cancer gastrique avec intermédié, faible positivité respectivement. Contrôle négatif U-87 MG (6%) lignée cellulaire de cancer du cerveau ont été montré une faible expression de HER-2 /neu. 2. La croissance cellulaire a été dose-dépendante inhibée en positif, la lignée cellulaire de contrôle HER-2 /neu SK-BR-3 par traitement Herceptin mais pas observée dans HER-2 /lignée cellulaire de contrôle neu
négatif U-87 MG. une inhibition efficace de la croissance n'a pas été observée dans les lignées cellulaires de cancer gastrique avec un seul traitement de l'Herceptin, toutes les lignées cellulaires ont observé l'inhibition de la croissance dépendante de la dose à des agents chimiothérapeutiques (doxorubicine, le cisplatine, le paclitaxel et le 5-FU). 3. Combinaison d'Herceptin doxorubicine a observé un effet synergique dans toutes les lignées de cellules cancéreuses à l'exception JQC-3, la combinaison du traitement par Herceptin avec le cisplatine a observé NCI-N87 et SK-BR-3 et la combinaison de l'Herceptin avec le paclitaxel a observé un effet synergique dans JQC-2. Combinaison de Herceptin avec le 5-FU a observé des effets antagonistes dans toutes les lignées cellulaires de cancer.
Conclusions
Selon HER-2 /niveau d'expression
neu, effet des agents anti-cancer a été observée différemment en combinaison d'Herceptin avec agents chimiothérapeutiques. Cela suggère que HER-2 /niveau d'expression
neu peut être le niveau de sélection combinaison de médicaments appliqué en combinaison d'Herceptin avec des agents chimiothérapeutiques dans le cancer gastrique.
Mots-clés
HER-2 /neu
(erbB- 2) le traitement combiné du cancer gastrique HERCEPTIN CI Présentation
Depuis connu que les voies de transduction du signal par le facteur de croissance et son récepteur jouent un rôle impuissant dans le processus cancérigène de nombreuses études sont en cours. La protéine HER-2 /neu
(erbB-2), une glycoprotéine de membrane cellulaire est un récepteur de facteur de croissance a l'activité de récepteur tyrosine kinase [1]. HER2 a souvent été détecté dans une large gamme de tumeurs humaines. la sécrétion cellulaire normale associée à la protéine HER-2 /neu, mais la destruction des cellules normales commande provoquant surexpression de la protéine, augmente le taux de division cellulaire et la croissance induisent des changements précancéreux [2].
Le HER-2 /neu
( erbB-2), le gène qui est situé sur le chromosome humain 17q21 [3], qui présente une homologie partielle avec le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) [4, 5]. EGF (facteur de croissance épidermique), la famille des récepteurs a l'activité de la tyrosine kinase du récepteur et du récepteur de l'EGF est composée, c-erbB-2, c-erbB-3 et c-erbB-4 [6-8]. HER-2 /neu oncoprotéine, code pour une glycoprotéine membranaire p185kD, un récepteur qui est impliqué dans la croissance et la diffentiation des cellules tumorales et 25 à 30% surexprimé dans le sein, l'ovaire et les cancers gastriques [9-12] et le pronostic de ces derniers patients est médiocre [13-15]
. surexpression de /gène neu
HER-2 et il est la protéine sont associés le pronostic et le traitement [16-18] et l'expression du patient du cancer du sein HER-2 /neu
est fortement nécessaire à la croissance des tumeurs [19]. Ceux suggèrent que HER-2 /neu
impliqué dans la survenue du cancer du sein, la progression et maligne et HER-2 /neu
surexpression est plus important que les récepteurs hormonaux sur les patients atteints de métastases ganglionnaires [9]. Par conséquent, ces cibles thérapeutiques HER-2 /neu
médicaments protéiques, humanisé recombinant anti-HER-2 /neu
anticorps - Herceptin, efficaces dans le traitement du cancer du sein a été rapportée [20]
gastrique. le cancer est le cancer le plus répandu dans la Chine. La survenue d'un cancer gastrique est le processus cancérigène avec plusieurs étapes mutations génétiques de variétés. Statut HER-2 est en corrélation avec la profondeur de l'invasion, le stade TNM, les ganglions lymphatiques et les métastases à distance du cancer gastrique [21]. HER-2 /neu sur-expression est liée à un mauvais pronostic du cancer gastrique, mais a un effet modeste sur la survie dans le cancer gastrique comme un facteur de pronostic indépendant [22]. Herceptin® comme agent cytostatique, la thérapie mono efficace des effets antitumoraux ne peut pas être prévu, mais un grand nombre de recherches sont en cours pour la thérapie de combinaison avec d'autres médicaments anticancéreux ou des agents biologiques. Cependant, toujours pas étudier avec précision de la thérapie de combinaison d'Herceptin avec des médicaments anticancéreux dans des lignées cellulaires gastriques [13]. Par conséquent, dans cette étude, nous étudions la combinaison efficace de Herceptin (trastuzumab, Genentech Inc, CA, USA) [23-25], de ciblage pour HER-2 /neu
oncoprotéine, avec des médicaments anti-cancéreux dans des lignées cellulaires de cancer gastrique , en fonction de la HER-2 /neu
oncoprotéine expression. Matériaux et méthodes
cellules
lignées cellulaires de cancer gastrique ont été utilisés lignes 87 cellulaires YBC-2, YBC-3 et NCI-N. Les lignées de cellules YBC-2 et YBC-3 ont été établies d'un cancer gastrique métastatique intrapéritonéale par le Département de pathologie, Université Yanbian. La ligne 87 cellules NCI-N a été créé aux États-État par le NCI (National Cancer Institute, CRL5822, États-Unis). Le U-87 MG (ATCC, HTB14) lignée cellulaire de tumeur cérébrale et SK-BR-3 (ATCC, HTB30) lignée cellulaire de cancer du sein ont été utilisés pour HER-2 /neu
expression de la protéine contrôle positif et négatif, respectivement.
Ces lignée cellulaire étaient les médias essentiels utilisation de culture minimum (MEM, GINCO BRL, grand Island, NY, USA) qui est contenant inactivé (à 56 ° C pendant 30 min) 10% de sérum de veau fœtal (FBS, GINCO BRL, grand Island , NY, USA), 100 unités /ml de pénicilline et 0,1 mg /ml de streptomycine. Médicaments
Herceptin Tous les incubations de culture ont été effectuées dans un humidifié 37 ° C, 5% de CO <sub>2 incubateur., Recombinant Humanoïde HER-2 /neu anticorps, était des Etats-Unis (Trastuzumab, 440 mg /20 ml , Genentech Inc., San Francisco, CA, USA), et des médicaments anticancéreux reconnus, l'effet dans le cancer gastrique, Adriamycine (doxorubicine, 10 mg /5 ml), cisplatine (cisplatine, 10 mg /flacon), le Taxol (paclitaxel, 30 mg /flacon) et 5-FU (5-Flourouracil, 250 mg /5 ml) provenaient de la Chine. En faisant l'expérience de chaque médicament a été utilisé dilué dans les milieux de culture cellulaire.
FACS analyse (HER-2 expression /protéine neu)
HER-2 /neu
(erbB-2) expression oncoprotéine a été effectuée en utilisant par fluorescence Sorter cellulaire activé (FACS, Becton Dickinson, USA) a réalisé immunophénotypage en surface cellulaire. cellules de culture (1 × 10 <sup>6) ont été récoltées après traitement avec de la trypsine-EDTA (GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA) et incubées avec l'anticorps primaire, anti-HER-2 /neu
anticorps (anticorps monoclonal de souris Anticorps, LAB VISION, CA, USA), dans une dilution de 1: 200 et 50 pi pendant 1 heure à 4 ° C. Les cellules colorées ont été lavées deux fois avec du PBS froid. Coloration et le lavage ont été effectuées dans du PBS (solution tampon phosphate, pH 7,6 Ca ++ Mg ++ libre, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 2% de FBS. Après deux lavages d'un anticorps secondaire anti-souris-FITC (anticorps anti-souris conjugué au FITC, Novocastra, États-Unis) a été utilisé dans une dilution 1:40 et 50 ul ont été incubées pendant 40 minutes à 4 ° C, puis puis lavé deux fois avec du froid PBS. Après avoir terminé la coloration, la solution de cellule de filtration ont été utilisés 40 um maille de nylon obtenir la cellule unique de la matière en suspension et de l'analyse fait dans le
test MTT FACS. (In vitro Herceptin et des agents chimiothérapeutiques sensibilité du test dans des lignées cellulaires de cancer gastrique)
le test MTT a été utilisée in vitro pour
médicament test de sensibilité dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Colorant MTT [3- (4,5-diméthyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphényl tétrazolium] est réduit en formazan (un composé insoluble dans l'eau pourpre foncé) par le système succinate déshydrogénase des mitochondries actif et, par conséquent, spécifiquement utilisé pour la densité optique (DO) des puits a été mesurée dans un dosage immunoenzymatique (ELISA), le lecteur enzyme-linked Sunrise (TECAN) à 560 nm. La DO en corrélation linéaire avec le nombre de cellules viables. Les cellules ont été étalées à 180 médias ul de 1 x 10 4 cellules par puits dans une plaque à puits multiples 96 et incubé pendant 24 h à 37 ° C et 5% de CO 2.
Pour seul médicament test de sensibilité, deux méthodes ont été appliquées. Tout d'abord, Herceptin (4,625, 9,25, 18,5, 37 uM), la doxorubicine (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 uM), le cisplatine (0,166, 1,666, 16,66, 166,6 uM), le paclitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 uM) et 5-FU (38,43, 384,37, 3843,78, 38437,8 M) ont été dilués dans 20 ul de milieux et ajoutés aux plaques et incubés pendant 4 jours. Groupe de contrôle ont été ajoutés seulement les médias sans les médicaments et les mêmes durées incubés. En second lieu, l'effet synergique de la combinaison thérapeutique avec une combinaison d'Herceptin + Doxorubicine, Herceptin + Cisplatine, Herceptin + Paclitaxel et d'Herceptin + 5-FU.
Lorsque le traitement combiné Herceptin et chaque test de la sensibilité effectuée médicament anticancéreux, fixe le pourcentage de la concentration molaire des deux médicaments, à la suite en ajoutant ensuite 50 ul de MTT MTT a été dissous dans un tampon phosphate à la concentration de 2 mg /ul ajoutés à chaque puits et on a incubé 4 heures de plus. Après élimination du surnageant, 150 pi placé du DMSO (Diméthylsulfoxyde, Sigma, USA) dans chaque puits et en agitant doucement à environ 15 minutes pour dissoudre le formazan produit. La densité optique (DO) des puits a été mesurée dans un dosage immuno-enzymatique (ELISA) lecteur à 562 et 720 nm. La survie des cellules malignes a été calculé par l'équation (OD de médicament bien OD du puits blanc OD du contrôle /signifie bien - OD de puits blanc) × 100%. un test MTT a été effectuée et répétée trois fois pour chaque dose de médicament (5 puits), les résultats ont été analysés afin d'obtenir le calcul de la valeur d'IC ​​moyenne.
après la thérapie de combinaison
IC (indice de combinaison) a été obtenu par la formule Chou-Talalay, a été calculée à partir de la valeur de l'IC50 (Dm) a comparé l'efficacité et la courbe de la capacité (la valeur m). formule classique de l'isobologramme (CI = 1) se présente comme suit. CI =
D
1
/Dx 1
+
D
2
/Dx 2
Dénominateur (Dx) 1 et (Dx) 2 étaient indiquer le pourcentage de cytotoxicité des lorsqu'ils sont traités avec un seul médicament seul; numérateur de (D) 1 et (D) 2 ont indiqué que le pourcentage de cytotoxicité lors d'un traitement avec les deux médicaments. Dx =
Dm fa /
1
-
fa 1
m
Dm est la dose d'effet médian (IC50), ce calculé par parcelle effet médian du X à l'origine de l'antilog. X
=
log D
contre de Y =
log f
un
/ 1
-
f
un
m est la pente de la courbe d'effet médian. Analyse de l'effet du médicament multiple en utilisant le logiciel CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK) ont été calculées à des valeurs de m, Dm, Dx, et CI. (Dx) 1 et (Dx) 2 ont été calculées en utilisant la formule d'effet médian de Chou-Talalay. CI < 1, CI = 1, CI > 1 ont été appelés synergisme, sommation, et les effets d'antagonisme respectivement évaluation
statistique statistique de l'analyse des données ont été effectuées en utilisant le Student bilatéral t
-test (SPSS 13.0 logiciel; SPSS, Chicago, IL). . p
valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Résultats L'analyse de variance (ANOVA) a été utilisé pour les comparaisons multiples de groupe afin de déterminer les effets antitumoraux potentiels entre les groupes.
HER-2 /expression neu dans gastriques lignées cellulaires de cancer par FACS
L'expression de HER2 /neu la protéine a été analysée dans trois lignées cellulaires du cancer de l'estomac différents (JQC-2, JQC-3 et NCI-N87). L'expression de cette proteinis 48% (faible), 55% (moyenne) et 88% (forte) en YBC-2, YBC-3 et NCI-N87, respectivement. L'expression de cette protéine était de 89% en positif lignée cellulaire de cancer du sein SK-BR-3 et 6% en ligne négative de la cellule de tumeur cérébrale U-87 MG (figure 1). La figure 1 HER-2 /neu expression dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. L'expression de la protéine HER2 /neu dans toutes les lignées cellulaires cancéreuses ont été mesurées par une analyse de tri cellulaire activé par fluorescence. L'expression HER2 /neu dans trois lignées cellulaires de cancer gastrique (YBC-2, YBC-3 et NCI-N87) étaient 48% (faible), 55% (moyenne) et 88% (forte), respectivement. Tous les groupes de contrôle isotypique ne sont pas plus de 0,5% (données non montré). Comme le contrôle positif, SK-BR-3 de HER2 /neu expression est de 89%. U-87 MG a montré une plus faible expression de HER2 /neu (6%) que le contrôle negetive.
La sensibilité de la lignée cellulaire de cancer de l'estomac à Herceptin et médicament anti-cancer et l'analyse de la sensibilité au traitement médicamenteux in vitro unique
Lors de l'utilisation unique de Herceptin, l'arrêt de la croissance cellulaire était faible et IC 50 n'a pas été détectable in vitro avec la lignée cellulaire de cancer de l'estomac (figure 2). En revanche, les quatre médicaments anticancéreux différents (doxorubincin, le cisplatine, le paclitaxel et le 5-FU) a montré une inhibition dose-dépendante de la croissance cellulaire et IC 50 a été détectée (Tableau 1, Figure 2). La figure 2 chimiosensibilité des Herceptin® et quatre médicaments anti-cancéreux dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Lors de l'utilisation unique de Herceptin, l'arrêt de la croissance cellulaire était faible et IC50 était pas détectable in vitro avec la lignée cellulaire de cancer de l'estomac. En revanche, les quatre médicaments anticancéreux différents (doxorubincin, le cisplatine, le paclitaxel et le 5-FU) a montré une inhibition dose-dépendante de la croissance cellulaire et IC50 a été détectée.
Tableau 1 IC30 et IC50 de cinq agents anticancéreux contre JQC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG et SK-BR-3 lignes
cellulaires agents anticancéreux

lignées cellulaires (IC30) uM
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
agents anticancéreux
lignées cellulaires (IC 50) uM
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
L'effet de la combinaison d'Herceptin et de médicaments anti-cancéreux
Dans la combinaison d'Herceptin et doxorubincin traitement, l'effet synergique a été observée dans YBC-2 et les cellules NCI-N87, mais pas dans YBC-3 lignée cellulaire qui a un faible expression de HER2 /neu
protéines (Tableau 2, Figure 3a, P
< 0,05). Dans la combinaison de l'herceptine et le cisplatine, les effets synergiques ont été observés dans JQC-3 lignées de cellules SK-BR-3, et NCI-N87 (CI < 1, P
< 0,05). Cependant, les effets inhibiteurs ont été observés dans JQC-2 et les lignes U-87 MG cellules (indice de combinaison > 1, P
< 0,05) (tableau 3, figure 3b). Le traitement de l'Herceptin et le paclitaxel, dans JQC-3 et de U-87 lignées de cellules MG, les effets inhibiteurs ont été observés (IC > 1), cependant, dans JQC-3 lignée cellulaire, l'effet synergique a été observé (CI < 1 , P
< 0,05). Dans les lignées SK-BR-3 et de cellules NCI-87, les effets sont différents dépend de la dose des médicaments (tableau 4, figure 3C). Dans la combinaison d'Herceptin et de 5-FU, les effets inhibiteurs ont été observés dans toutes les lignées cellulaires (CI > 1, P
< 0,05) (tableau 5, figure 3d) .Table 2 valeurs calculées pour la combinaison Index comme un effet inhibiteur de croissance du traitement de combinaison avec Herceptin® et doxorubicine dans des lignées cellulaires de cancer gastrique
la combinaison de YBC-2 Index des Valeur
Paramètre (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2,93
0,54
0,98
HER
1.201,02
0,32
0,91
DOX + SA
0,09
0,05
0,03
0,25
0,74
0,96
Diagnostic effet combiné
synergie
synergie
synergie
YBC-3
Combinaison de paramètres (uM)
Drug Value Index
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2.310
0,768
0,946
HER
46,063
0,623
0,970
DOX + SA
0,266
0,598
1.377
0,406
0,469
0,925
Diagnostic effet combiné
synergie
synergie
antagonisme
Combinaison de NCI-N87 Paramètre (uM)
Drug Value Index
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,070
0,398
0,864
HER
113350
0,191
0,635
DOX + SA
0,005
0,004 0,003

0.000
0,437
0,995
Diagnostic effet combiné
synergie
synergie
synergie
U-87 MG
Combinaison Paramètre Index Valeur (M)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,295
0,620
0,997
SA
1845,5
0,457
0,860
DOX + SA
0,441
0,435
0,448
0,101
0,589
0,992
synergie
Diagnostic effet combiné
synergie
synergie
SK-BR-3
Combinaison Paramètre Index Valeur (M)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,103
0,832
0,998
HER
1424000
0,046
0,435
DOX + SA
0,046
0,074
0,117
0,005
0,616
0,985
Diagnostic effet combiné
synergie
synergie
synergie
DOX
, doxorubicine; HER
, Herceptin.
Figure 3 indice de combinaison comme un effet inhibiteur de croissance du traitement de combinaison avec Herceptin® et agents anti-cancéreux. une. Dans la combinaison d'Herceptin et doxorubincin traitement, l'effet synergique a été observé dans les cellules YBC-2 et NCI-N87, mais pas dans YBC-3 lignée cellulaire. b. Dans la combinaison de l'herceptine et le cisplatine, les effets synergiques ont été observés dans JQC-3 lignées de cellules SK-BR-3, et NCI-N87 (CI < 1). Cependant, les effets inhibiteurs ont été observés dans JQC-2 et de U-87 lignées de cellules MG (CI > 1). c. Le traitement de l'Herceptin et le paclitaxel, dans JQC-3 et de U-87 lignées de cellules MG, les effets inhibiteurs ont été observés (IC > 1), cependant, dans JQC-3 lignée cellulaire, l'effet synergique a été observé (CI < 1 ). Dans les lignées SK-BR-3 et de cellules NCI-87, les effets sont différents dépend de la dose des médicaments. ré. Dans la combinaison d'Herceptin et de 5-FU, les effets inhibiteurs ont été observés dans toutes les lignées cellulaires (CI > 1).
Tableau 3 valeurs calculées pour l'indice de combinaison comme un effet inhibiteur de croissance du traitement de combinaison avec Herceptin® et cisplatine dans le cancer gastrique lignées cellulaires
YBC-2
Combinaison Value Index
Paramètre (uM)
Drug
ED50

ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
4.512
0,921 0,882

HER
1201,0
0,316
0,915
CDDP + SA
1.375
2.707
5.337
2.232
0,587
0,965
Diagnostic effet combiné
antagonisme
antagonisme
antagonisme
YBC-3
Combinaison Paramètre Index Valeur (M)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
30,733
2.227
0,929
HER
46,063
0,623
0,970
CDDP + SA
0,274
0,110
0,054
12,091
1.472
0,998
Diagnostic effet combiné
synergie
synergie
synergie
NCI-N87
Indice Combinaison Valeur
Paramètre (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
45,86
0,53
0,93
HER
1.13E + 05
0,19
0,63
CDDP + SA
0,03
0,01
0,01
0,83
0,88
0,96
Diagnostic effet combiné
synergie
synergie
synergie
U-87 MG
Combinaison Paramètre Index Valeur (M)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
5,65
1,08
0,98
HER
1.845,53
0,46
0,86
CDDP + SA
9.18
9,85
10,58
2,56
1.01
0.99
Diagnostic effet combiné
antagonisme
antagonisme
antagonisme
SK-BR-3
Combinaison Paramètre Index Valeur (m)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r</sup></sub>