Корреляция между HER-2 /Neu (ErbB-2) уровень экспрессии и терапевтический эффект комбинированного лечения с Герцептин и химиотерапевтических средств в клетку рака желудка lines

корреляция между HER-2 /Neu (ErbB-2) уровень экспрессии и терапевтический эффект комбинированного лечения с Герцептин и химиотерапевтических агентов в линиях рака желудка клеточных
Аннотация
Введение
Хотя поздних стадиях рака желудка имеет много ограничений и скорость реакции является маргинальным в химиотерапии. Избыточная экспрессия эпидермального фактора роста человеческого рецептора 2 (HER-2 /Neu
) гена и его белка связаны с повышенным делением клеток и высокими темпами роста опухоли и сообщалось в ряде злокачественных опухолей. В частности, около 30% больных раком молочной железы имеют избыточную экспрессию HER-2 /Neu
белка и гиперэкспрессией метастазированию быстрее, вызывает сопротивление химиотерапии и понижающей регуляции функции рецептора эстрогена. Рекомбинантные гуманизированные антитела к HER2 (Герцептин) ингибирует пролиферацию HER-2 /Neu
с гиперэкспрессией опухолевых клеток и использования, что в комбинации в метастатическим раком молочной железы увеличилась Цитотоксичность химиотерапевтических агентов.
Методы
Мы оценили экспрессия HER-2 /Neu
белка в желудочном клеточных линиях путем FACS, а затем сравнивая цитотоксичность в химиопрепаратов (доксорубицин, цисплатин, паклитаксел, 5-ФУ) в одиночку, так и в комбинации с Герцептином в соответствии с выражением HER-2 /Neu
белка МТТ.
Результаты
1. NCI-N87 (88%) линии клеток рака желудка и SK-BR-3 (89%) клеток рака молочной железы линии с сильной положительности Хермана 2 /Neu
выражение. ЕКЗ-2 (55%) и ЕКЗ-3 (48%) желудка линии раковых клеток с посреднического, слабой позитивности соответственно. Отрицательный контроль U-87 MG (6%) линия клеток рака мозга были показали низкую экспрессию HER-2 /Neu. 2. Рост клеток дозозависимо ингибирует в HER-2 /Neu
положительного, контроль линии клеток SK-BR-3 путем обработки Herceptin, но не наблюдается в HER-2 /Neu
отрицательной линии клеток управления U-87 MG. Эффективное ингибирование роста не наблюдалось в желудочном линиях раковых клеток с однократной обработки Герцептин, все клеточные линии наблюдали зависимое от дозы ингибирование роста к химиотерапевтическим агентам (доксорубицин, цисплатин, паклитаксел и 5-ФУ). 3. Сочетание Герцептин с доксорубицином наблюдали синергический эффект во всех линиях клеток рака за исключением ЕКЗ-3, комбинация Герцептин с цисплатином наблюдали NCI-N87 и SK-BR-3 и комбинация Герцептин с паклитакселом наблюдали синергический эффект в ЕКЗ-2. Комбинация Герцептина с 5-ФУ наблюдается антагонистический эффект во всех линиях клеток рака.
Выводы
Согласно HER-2 /Neu
уровня экспрессии, наблюдался эффект противораковых агентов по-разному в комбинации Герцептина с химиотерапевтические агенты. Это говорит о том, что HER-2 /NEU
уровень экспрессии может быть применен стандарт выбора комбинации лекарственных средств в комбинации Герцептина с химиотерапевтическими агентами при раке желудка.
Ключевые слова
HER-2 /NEU
(erbB- 2) Комбинация Герцептина рак желудка лечение CI Введение
Так как известно, что путей сигнальной трансдукции фактора роста и его рецептор играют импотента роль в канцерогенного процесса многие исследования проводятся. HER-2 /Neu
(ErbB-2) белок, клеточная мембрана гликопротеин, является рецептором фактора роста имеет активность тирозинкиназы рецептора [1]. HER2, было часто обнаруживается в широком диапазоне опухолей человека. секреция Нормальная клетка ассоциируется с HER-2 /Neu белка, но разрушение нормальных контрольных клеток, в результате чего белок гиперэкспрессия, увеличивает скорость деления и роста клеток вызывают предраковые изменения [2].
The HER-2 /Neu
( ErbB-2) гена, который расположен на хромосоме человека 17q21 [3], который имеет частичную гомологию с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) [4, 5]. ЭФР (эпидермальный фактор роста) Семейство рецепторов имеет активность тирозинкиназы рецептора и состояла из EGF-рецептора, с-ErbB-2, С-ErbB-3 и С-ErbB-4 [6-8]. HER-2 /Neu онкобелок, кодирует мембранный гликопротеин p185kD, рецептор, который участвует в росте и diffentiation опухолевых клеток и 25 ~ 30% избыточно экспрессируется в груди, рак яичников и желудка карцином [9-12] и прогноз этих пациенты беден [13-15].
Сверхэкспрессия HER-2 /Neu
гена и его белка связаны прогноз и терапии [16-18] и экспрессию пациента рак молочной железы по HER-2 /Neu
настоятельно требуется для роста опухоли [19]. Те предполагают, что HER-2 /Neu
участвует в возникновении рака молочной железы, прогрессировании и злокачественными и HER-2 /Neu
избыточная экспрессия является более важным, чем гормональные рецепторы на пациентов с метастазами в лимфатических узлах [9]. Таким образом, эти терапевтические мишени HER-2 /Neu
белковых препаратов, рекомбинантные гуманизированные анти-HER-2 /Neu
антитела - Герцептин, эффективных в лечении рака молочной железы сообщалось [20]
Желудочный. рак является наиболее распространенным раком в Китае. Возникновение рака желудка является многоступенчатым процессом с канцерогенными разнообразие генетических мутаций. HER-2 статус коррелирует с глубиной инвазии, TNM стадии, лимфатического узла и отдаленными метастазами рака желудка [21]. HER-2 /Neu избыточная экспрессия связана с неблагоприятным прогнозом развития рака желудка, но имеет скромный эффект на выживаемость при раке желудка, как независимый фактор прогноза [22]. Herceptin® в качестве цитостатика, моно терапия эффективность противоопухолевых эффектов нельзя ожидать, но многие исследования ведутся для комбинированной терапии с другими противоопухолевыми препаратами или биологическими агентами. Тем не менее, до сих пор точно не исследование комбинированной терапии Герцептина с противоопухолевыми препаратами в желудочном клеточных линиях [13]. Поэтому в данном исследовании мы исследуем эффективную комбинацию Герцептин (трастузумаб, Genentech Inc, Калифорния, США) [23-25], для ориентации HER-2 /Neu
онкогена с противораковых препаратов в желудочном линиях раковых клеток , в зависимости от HER-2 /Neu
онкобелок выражение.
материалы и методы
Клетки
желудочной клеточные линии рака предстательной использовали ЕКЗ-2, ЕКЗ-3 и NCI-N 87 клеточных линий. Клеточные линии ЕКЗ-2 и ЕКЗ-3 были созданы с внутрибрюшинного метастатическим раком желудка на отделении патологии, Яньбянь университета. 87 клеточная линия NCI-N была создана в Соединенных государства по NCI (Национальный институт рака, CRL5822, США). U-87 MG (АТСС, HTB14) клеток опухоли головного мозга и линии SK-BR-3 (АТСС, HTB30) клеток рака молочной железы линии были использованы для HER-2 /Neu
экспрессии белка положительного и отрицательного контроля, соответственно.
Эти клеточные линии культивировали использование минимального основного носителя (MEM, гинко BRL, Grand Island, Нью-Йорк, США), которая, содержащая инактивируется (при 56 ° С в течение 30 мин) 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, гинко BRL, Grand Island , Нью-Йорк, США), 100 ед /мл пенициллина и 0,1 мг /мл стрептомицина. Все инкубацию культуры были проведены в увлажненной 37 ° С, 5% СО <югу> 2 инкубатора.
Лекарственные средства
Герцептин, Гуманоид рекомбинантный HER-2 /Neu антитела, был родом из США (трастузумаб, 440 мг /20 мл , Genentech Inc., Сан-Франциско, штат Калифорния, США), и признанные противоопухолевые препараты, эффект при раке желудка, адриамицин (доксорубицин, 10 мг /5 мл), цисплатин (цисплатин, 10 мг /флакон), Таксол (паклитаксел, 30 мг /пробирка) и 5-фторурацила (5-Flourouracil, 250 мг /5 мл) из Китая. При проведении эксперимента каждый препарат был использован разводили в клеточной культуральной среде.
FACS анализ (HER-2 экспрессии /Neu белка)
HER-2 /Neu
(ErbB-2) онкобелок выражение было сделано с использованием флуоресцентные- активированных клеток сортировщик (FACS, Becton Dickinson, США) проводили иммунофенотипирование в клеточной поверхности. Культуры клеток (1 × 10 6) собирали после лечения с помощью трипсина-ЭДТА (GIBCOBRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) и инкубировали с первичным антителом, анти-HER-2 /Neu
антитела (мышиное моноклональное антитело, ЛАБ ВИДЕНИЕ, CA, США), в разведении 1: 200 и 50 мкл в течение 1 часа при 4 ° с. Окрашенные клетки дважды промывали холодным PBS. Окрашивание и промывание проводили в PBS (фосфатно-буферном растворе, рН 7,6 Ca ++ Mg ++ бесплатно, GIBCO BRL, Grand Island, Нью-Йорк, США) 2% FBS. После двукратной промывки вторичного ФИТЦ-antimouse антитела (анти-мышиных ФИТЦ-конъюгированного антитела, Novocastra, США) использовали в разбавлении 1:40, и 50 мкл, инкубировали в течение 40 мин при 4 ° C, после того затем дважды промывали холодным PBS. После завершения окрашивания раствор фильтрации клеток использовали 40 мкм нейлоновая сетка получить одну ячейку Взвешенные вещества и делать анализ в.
МТТ FACS (in vitro Герцептин и химиотерапевтических агентов чувствительности тест-желудочных в линиях раковых клеток)
анализ МТТ был использован для экстракорпорального
теста лекарственной чувствительности в желудочной линиях раковых клеток. МТТ краситель [3- (4,5-диметил-тиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолия бромид] снижается до формазана (темно-фиолетовый растворимое в воде соединение) с помощью сукцинатдегидрогеназы системы активного митохондрий, и, следовательно, в частности, используется для оптической плотности (OD) лунок измеряли в твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), считывателем Восход (TECAN) при 560 нм. О.Д. коррелируют линейно с числом жизнеспособных клеток. Клетки высевали в 180 мкл сред 1 × 10 4 клеток на лунку в 96-луночный мульти-луночного планшета и инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% CO <суб> 2.
Для одного препарата испытание на чувствительность, были применены два метода. Во-первых, Герцептин (4,625, 9,25, 18,5, 37 мкМ), доксорубицин (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 мкМ), цисплатин (0,166, 1,666, 16,66, 166,6 мкмоль), паклитаксел (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 мкМ) и 5-ФУ (38,43, 384,37, 3843,78, 38437,8 мкМ) разводили в 20 мкл среды и добавляли в планшеты и инкубировали в течение 4-х дней. Контрольная группа были добавлены только те носители без наркотиков и инкубированных же продолжительности. Во-вторых, синергический эффект комбинированной терапии с комбинацией Герцептин + доксорубицин, Герцептин + цисплатин, Герцептин + паклитаксел и Герцептин + 5-ФУ.
Когда комбинированное лечение Герцептин и каждый тест чувствительности проводили противораковые лекарства, фиксированное молярное процентное содержание обоих препаратов, после того, как затем добавлением 50 мкл МТТ МТТ растворяли в фосфатном буфере до концентрации 2 мг /мкл, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 4 часов больше. После удаления надосадочной жидкости помещают в 150 мкл ДМСО (диметилсульфоксид, Sigma, США) в каждую лунку и осторожно встряхивая около 15 минут, чтобы растворить сгенерированного формазана. Оптическая плотность (ОП) лунок измеряли в считывателем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) при 562 и 720 нм. Выживание злокачественная клеток рассчитывали по уравнению (OD препарата хорошо ОП бланка /среднее OD контроля хорошо - ОП = лунке) × 100%. МТТ анализ выполняли и повторяли три раза для каждой дозы препарата (5 хорошо) были проанализированы результаты, чтобы получить
расчета значения CI после комбинированной терапии
CI (Комбинированный индекс) в среднем. Был получен по формуле Chou-Талалай, рассчитывалась из значения IC 50 (Dm) сравнивали эффективность и кривой мощности (значение м). Классическая формула изоболограммы (CI = 1) следующим образом. CI <мо> =
<ми> D
<тп> 1
/
Dx <тп> 1
<Мо> +
<мили> D
<тп> 2
/
Dx <тп> 2
знаменателе (Dx) <суб> 1 и (Dx) <суб> 2 были указать процент цитотоксичности при обработке только одного препарата; числитель (D) <суб> 1 и (D) <суб> 2 были указать процент цитотоксичности при обработке обоих препаратов. Dx <мо> =
Dm фа /
<тп> 1
<мо> -
фа 1
м
Dm является медиана-эффект доза (IC 50), это рассчитано по срединно-графике эффекта Х-перехватом от антилогарифма. X
<Мо> =
войти <ми> D
по сравнению с Y
<Мо> =
войти
е <ми> а
/
<тп> 1
<мо> -
е
<ми> а
м является наклон медиана-графике эффекта. Множественный анализ эффекта лекарственного средства с использованием Calcusyn (Биософт, Кембридж, Великобритания), были вычислены значения м, дм, Dx и CI. (Dx) 1 и (Dx) 2 были рассчитаны с использованием медианного эффекта формулу Chou-Талалай. CI &л; 1, CI = 1, CI > 1 назывались синергизм, суммирование и антагонизм эффектов соответственно
Статистическая оценка
Статистический анализ данных проводили с использованием двух Стьюдента т
-test (SPSS 13,0 программного обеспечения, SPSS, Чикаго, Иллинойс). , р
значения менее 0,05 считались статистически значимыми. Дисперсионный анализ (ANOVA) был использован для множественных сравнений групп для определения потенциальных эффектов противоопухолевых между группами.
Результаты
HER-2 /Neu выражение в желудочном линий раковых клеток с помощью FACS
Экспрессию HER2 /Neu белок анализировали в трех различных клеточных линий рака желудка (ЕКЗ-2, ЕКЗ-3 и NCI-N87). Выражение этого proteinis 48% (слабый), 55% (средний) и 88% (сильные) в ЕКЗ-2, ЕКЗ-3 и NCI-N87 соответственно. Экспрессия этого белка была 89% в положительном клеток рака молочной железы линии SK-BR-3, и 6% в отрицательной клеточной линии опухоли головного мозга U-87 MG (рисунок 1). Рисунок 1 HER-2 /Neu выражение в желудочном линиях раковых клеток. Экспрессия HER2 /NEU белка во всех линиях раковых клеток измеряли с помощью анализа сортировочного флуоресценция активированных клеток. Выражение HER2 /Neu в трех желудочных линий раковых клеток (ЕКЗ-2, ЕКЗ-3 и NCI-N87) были 48% (слабый), 55% (средний) и 88% (сильные), соответственно. Все группы контроля изотипа составляли не более 0,5% (данные не показали). В качестве положительного контроля, SK-BR-3 экспрессии /Neu HER2 составляет 89%. U-87 MG показали более низкую экспрессию HER2 /Neu (6%) в качестве negetive контроля.
Чувствительность желудка линии раковых клеток к Герцептин и лекарства против рака и анализ чувствительности к одной лекарственной терапии в пробирке
в одном применении Герцептина, арест клеточного роста была слабой и IC <суб> 50 не был обнаружен в пробирке с клеточной линии рака желудка (рис 2). В отличие от этого, четыре различных противораковых препаратов (doxorubincin, цисплатин, паклитаксел и 5-ФУ) показал дозозависимое ингибирование клеточного роста и ИК <суб> 50 было обнаружено (Таблица 1, рисунок 2). Рисунок 2 химиочувствительность Herceptin® и четыре противораковых препаратов в желудочном линиях раковых клеток. В одном применении Герцептина, арест клеточного роста была слабой и IC 50 не был обнаружен в пробирке с клеточной линии рака желудка. В отличие от этого, четыре различных противораковых препаратов (doxorubincin, цисплатин, паклитаксел и 5-ФУ) показал дозозависимое ингибирование роста клеток и IC 50, был обнаружен.
Таблица 1 IC30 и IC50 пяти противораковых агентов против ЕКЗ -2, ЕКЗ-3, NCI-N87, U-87 MG и SK-BR-3 клеточных линий
агенты Противораковые

клеточных линий (IC30) мкМ

ЕКЗ-2

ЕКЗ-3

NCI-N87

SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
Противоопухолевые агенты
Клеточные линии (IC 50) мкМ
ЕКЗ-2
ЕКЗ-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
Эффект комбинации Герцептин и противораковых препаратов
В комбинации Герцептина и doxorubincin лечения, синергетический эффект наблюдался в ЕКЗ-2 и клетках NCI-N87, но не в клеточной линии ЕКЗ-3, который имеет слабый экспрессия HER2 /Neu
белка (таблица 2, рис 3а, P
&ЛТ; 0,05). В комбинации Герцептина и цисплатин, наблюдались синергетические эффекты в SK-BR-3, NCI-N87 и ЕКЗ-3 клеточных линий (CI &Лт; 1, P &
ЛТ; 0,05). Тем не менее, наблюдались ингибирующие эффекты в ЕКЗ-2 и U-87 MG клеточных линий (комбинация Index &GТ; 1, P
&л; 0,05) (таблица 3, 3б). Лечение Герцептин и паклитаксел, в ЕКЗ-3 и U-87 линий МГ клеток, наблюдались ингибирующие эффекты (CI > 1), однако, в клеточной линии ЕКЗ-3, наблюдался синергетический эффект (CI &л; 1 , Р
≪ 0,05). В SK-BR-3 и NCI-87 клеточных линий, эффекты были разными в зависимости от дозы лекарственных средств (таблица 4, рис 3в). В комбинации Герцептина и 5-FU, наблюдалось ингибирующее действие во всех клеточных линиях (CI > 1, Р
≪ 0,05) (таблица 5, Рис 3) .table 2 Расчетные значения для комбинации Индекс в качестве тормозящего рост эффекта комбинированной терапии с Herceptin® и доксорубицина в линиях рака желудка клеточных
ЕКЗ-2

комбинация Индекс Значение

Параметр (мкм)

Drug

ED50

ED75

ED90

Dm

м

г

DOX
2,93
0,54
0,98

HER 1201,02
0,32
0,91
DOX + HER
0,09
0,05
0,03
0,25
0,74
0,96
Диагноз комбинированный эффект синергии

синергии
синергия
ЕКЗ-3
Комбинация Индекс Значение параметра
(мкМ)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
м
г
DOX
2.310
0,768
0,946

HER 46.063
0,623
0,970
DOX + HER
0,266
0,598
1,377
0,406
0,469
0,925
Диагноз комбинированный эффект синергии

синергия
антагонизм
NCI-N87
Комбинация Индекс Значение параметра
(мкМ)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
м
г
DOX
0,070
0,398
0,864
HER
113350
0,191
0,635
DOX + HER
0.005
0,004
0,003
0,000
0,437
0,995
Диагноз комбинированный эффект синергии

синергии
синергия
U-87 MG
Комбинация Индекс Значение параметра
(мкМ)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
м
г
DOX
0,295
0.620
0,997
HER <бр> 1845,5
0,457
0,860
DOX + HER
0,441
0,435
0,448
0,101
0,589
0,992
Диагноз комбинированный эффект синергии

синергия
синергия
SK-BR-3
Комбинация Индекс Значение параметра
(мкМ)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm <бр> м
г
DOX
0,103
0,832
0.998
HER
1424000
0,046
0,435
DOX + HER
0,046
0,074
0,117
0.005
0,616
0,985
Диагноз комбинированный эффект синергии

синергии
синергия
DOX
, доксорубицин; HER
, Герцептин. Рисунок 3
Комбинированный индекс в качестве ингибирующего рост эффекта комбинированной терапии с Herceptin® и противораковые агенты. а. В комбинации Герцептина и doxorubincin лечения, синергетический эффект наблюдался в ЕКЗ-2 и NCI-N87 клетках, но не в клеточной линии ЕКЗ-3. б. В комбинации Герцептина и цисплатин, наблюдались синергетические эффекты в SK-BR-3, NCI-N87 и ЕКЗ-3 клеточных линий (CI < 1). Тем не менее, наблюдались ингибирующие эффекты в ЕКЗ-2 и U-87 MG клеточных линий (CI > 1). гр. Лечение Герцептин и паклитаксел, в ЕКЗ-3 и U-87 линий МГ клеток, наблюдались ингибирующие эффекты (CI > 1), однако, в клеточной линии ЕКЗ-3, наблюдался синергетический эффект (CI &л; 1 ). В SK-BR-3 и NCI-87 клеточных линий, эффекты были разными в зависимости от дозы препаратов. d. В комбинации Герцептина и 5-FU, наблюдалось ингибирующее действие во всех клеточных линиях (CI > 1).
Таблица 3 Расчетные значения для комбинации индекса как ингибитор роста эффекта комбинированной терапии с Herceptin® и цисплатин при раке желудка клеточные линии
ЕКЗ-2

Комбинация Индекс Значение

Параметр (мкм)

Drug

ED50

ED75

ED90

Dm

м

г

CDDP
4,512
0,921
0.882
HER
1201,0
0,316
0,915
CDDP + HER
1,375
2,707
5,337
2,232
0,587
0,965
Диагностика Комбинированный эффект
антагонизм
антагонизм
антагонизм
ЕКЗ-3
Комбинация Индекс Значение параметра
(мкМ)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
м
г
CDDP
30.733
2,227
0,929
НЕЕ
46.063
0,623
0,970
CDDP + HER
0,274
0,110
0,054
12,091
1,472
0,998
Диагноз комбинированный эффект синергии

синергии
синергия
NCI-N87
Комбинация Индекс Значение параметра изображения (мкМ)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
м
г
CDDP
45.86
0,53
0,93
HER
1.13E + 05
0,19
0,63
ЦДДП + HER
0,03
0,01
0.01
0,83
0,88
0,96
Диагноз комбинированный эффект синергии

синергии
синергия
U-87 MG
Комбинация Индекс Значение параметра
(мкМ)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
м
г
CDDP
5,65
1,08
0,98

HER 1845,53
0,46
0,86
CDDP + HER
9,18
9,85
10,58
2,56
1.01
0.99
Диагноз комбинированный эффект
антагонизм
антагонизм
антагонизм
SK-BR-3
Комбинация Индекс Значение параметра
(мкМ)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
м
г <бр

• Функциональные изменения, связанные с желудочно-кишечного тракта органогенеза во время метаморфоза в Атлант…
• Идентификация и проверка генов, участвующих в желудочном онкогенеза