Korrelasjon mellom HER-2 /neu (erbB-2) uttrykk nivå og terapeutisk effekt av kombinasjonsbehandling med Herceptin og kjemoterapeutiske midler i mage kreft cellelinjer

Korrelasjon mellom HER-2 /neu (erbB-2) uttrykk nivå og terapeutisk effekt av kombinasjonsbehandling med Herceptin og kjemoterapeutiske midler i magekreftcellelinjer
Abstract
Innledning
Selv avansert magekreft har mange begrensninger og svar hastigheten er marginal i kjemoterapi. Overekspresjon av human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER-2 /neu
) genet og dets protein er assosiert med økt celledeling og en høy grad av tumorvekst, og har blitt rapportert i flere ondartede sykdommer. Spesielt, ca 30% av brystkreftpasienter har overekspresjon av HER-2 /neu protein og
overekspresjon metastasere raskere, induserer motstand av kjemoterapi og funksjon av østrogen reseptor ned-regulere. Rekombinant humanisert anti-HER2-antistoff (Herceptin) hemmer spredning av HER-2 /neu
overekspresjon kreftceller og bruken av det i kombinasjon ved metastatisk brystkreft har økt cytotoksisitet av kjemoterapeutika.
Metoder
Vi evaluerte uttrykket av HER-2 /neu
protein i magecellelinjer ved FACS og deretter sammenligne cytotoksisitet i kjemoterapeutika (doxorubicin, cisplatin, paclitaxel, 5-FU) alene og i kombinasjon med Herceptin i henhold til uttrykk av HER-2 /neu protein
ved MTT-assay.
Resultater
1. NCI-N87 (88%) magekreft cellelinje og SK-BR-3 (89%) brystcancer cellelinje med sterk positivitet av her- 2 /neu
uttrykk. YBC-2 (55%) og YBC-3 (48%) magekreft cellelinje med intermediated, svak positivitet respektivt. Negativ kontroll U-87 MG (6%) hjernekreft cellelinje var viste lavt uttrykk av HER-2 /neu. 2. Cellevekst ble doseavhengig hemmet i HER-2 /neu
positiv, kontroll cellelinje SK-BR-3 av Herceptin behandling, men ikke observert i HER-2 /neu
negativ kontroll cellelinje U-87 MG. Effektiv veksthemming ble ikke observert i mage kreft cellelinjer med enkel behandling av Herceptin, alle cellelinjer observert doseavhengig veksthemming til kjemoterapeutika (doxorubicin, cisplatin, paclitaxel og 5-FU). 3. Kombinasjon av Herceptin med doxorubicin observert synergieffekter i alle kreftcellelinjer bortsett YBC-3, kombinasjonen Herceptin med cisplatin observert NCI-N87 og SK-BR-3 og kombinasjonen Herceptin med paclitaxel observert synergieffekter i YBC-2. Kombinasjon av Herceptin med 5-FU observert antagonistiske effekter i alle kreftcellelinjer.
Konklusjoner
Ifølge HER-2 /neu
uttrykk nivå, ble effekten av kreftlegemidler observert annerledes i kombinasjon med Herceptin med kjemoterapeutika. Dette tyder på at HER-2 /neu
uttrykk nivå kan brukes standard kombinasjon narkotika utvalg i kombinasjon med Herceptin Med kjemoterapeutika i magekreft.
Nøkkelord
HER-2 /neu plakater (erbB- 2) HERCEPTIN Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP Kombinasjonsbehandling behandling~~POS=HEADCOMP CI Innledning
Siden kjent at signaltransduksjonsveier av vekstfaktor og dens reseptor spiller en impotent rolle i kreftfremkallende prosessen mange studier blir utført. HER-2 /neu plakater (erbB-2-protein), cellemembran-glykoprotein, er en vekstfaktor-reseptor har aktiviteten av reseptor-tyrosin-kinase [1]. HER2 er ofte detektert i et vidt spekter av humane tumorer. Normal celle sekresjon assosiert med HER-2 /neu protein, men ødeleggelse av normale celler kontroll forårsaker protein overekspresjon, øker frekvensen av celledeling og vekst indusere forstadier endringer [2].
HER-2 /neu product: ( erbB-2) -genet som er plassert på det humane kromosom 17q21 [3], som har delvis homologi med epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) [4, 5]. EGF (epidermal vekstfaktor) reseptor-familien har aktiviteten av reseptor-tyrosin-kinase, og besto av EGF-reseptor, c-erbB-2, c-erbB-3 og c-erbB-4 [6-8]. HER-2 /neu onkoprotein, koder for et p185kD membranglykoprotein, reseptor som er involvert i veksten og diffentiation av tumorcellene og 25 ~ 30% overuttrykt i bryst, eggstokk og gastrisk karsinom [9-12] og prognosen av disse pasienter er dårlig [13-15].
Overuttrykte HER-2 /neu
genet, og det er protein er assosiert brystkreft pasientens prognose og terapi [16-18] og uttrykk av HER-2 /neu
er sterkt påkrevet for tumorvekst [19]. De foreslår at HER-2 /neu
involvert i brystkreft forekomst, progresjon og ondartede og HER-2 /neu
overekspresjon er viktigere enn hormonreseptorer på pasienter med lymfeknutemetastase [9]. Derfor er disse terapeutiske mål HER-2 /neu
protein narkotika, rekombinant humanisert anti-HER-2 /neu
antistoff - Herceptin, effektive i behandlingen av brystkreft har blitt rapportert [20]
Gastric. kreft er den vanligste kreftsykdommen i Kina. Forekomsten av magekreft er den multistep kreftfremkallende prosessen med forskjellige genetiske mutasjoner. HER-2 status er korrelert med dybden av invasjon, TNM stadium, lymfeknute og fjern metastasering av magekreft [21]. HER-2 /neu over-ekspresjon er relatert til dårlig prognose av magekreft, men har en beskjeden effekt på overlevelsen i magekreft som en selvstendig prognose faktor [22]. HERCEPTIN som en cellegift, monoterapi effektive av antitumor effekt kan ikke forventes, men mye forskning er i gang for kombinasjonsbehandling med andre kreft narkotika eller biologiske legemidler. Men fortsatt ikke nøyaktig studie av kombinasjonsbehandling av Herceptin med kreft narkotika i mage cellelinjer [13]. Derfor, i denne studien undersøker vi den effektive kombinasjonen av Herceptin (trastuzumab, Genentech Inc, CA, USA) [23-25], målretting for HER-2 /neu
oncoprotein, med anti-kreft narkotika i mage kreft cellelinjer avhengig av HER-2 /neu
oncoprotein uttrykk.
Materialer og metoder
celler
magekreft cellelinjer ble anvendt YBC-2, YBC-3 og NCI-N 87 cellelinjer. De YBC-2 og YBC-3 cellelinjer ble etablert fra intraperitoneal magekreft med spredning av Avdeling for patologi, Yanbian University. NCI-N 87 cellelinje ble etablert i United State ved NCI (National Cancer Institute, CRL5822, USA). Den U-87 MG (ATCC HTB14) hjernetumorcellelinje og SK-BR-3 (ATCC HTB30) brystkreftcellelinje ble brukt for HER-2 /neu
proteinekspresjon positiv og negativ kontroll, respektivt.
Disse cellelinje, ble dyrket bruk minimum essensielt medium (MEM, GINCO BRL, Grand Island, NY, USA) som inneholdende inaktivert (ved 56 ° C i 30 min) 10% føtalt bovint serum (FBS, GINCO BRL, Grand Island , NY, USA), 100 enheter /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin. Alle kultur inkubasjoner ble utført i en fuktet 37 ° C, 5% CO <sub>2 inkubator.
Drugs
Herceptin, Humanoid rekombinant HER-2 /neu antistoff, var fra USA (Trastuzumab, 440 mg /20 ml , Genentech Inc., San Francisco, CA, USA), og anerkjente kreft narkotika, effekt på magekreft, Adriamycin (doxorubicin, 10 mg /5 ml), cisplatin (cisplatin 10 mg /hetteglass), Taxol (paclitaxel, 30 mg /ampulle) og 5-FU (5-fluorouracil, 250 mg /5 ml) var fra Kina. Når gjør eksperiment hvert medikament ble anvendt fortynnet i cellekulturmediet.
FACS-analyse (HER-2 /neu protein ekspresjon)
HER-2 /neu plakater (erbB-2) oncoprotein ekspresjon ble utført ved anvendelse Fluorescence- -aktivert cellesorteringsåpparat (FACS, Becton Dickinson, USA) utført immunfenotyping i celleoverflaten. Kultur-celler (1 x 10 <sup>6) ble høstet etter behandling med trypsin-EDTA (GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) og inkubert med det primære antistoff, anti-HER-2 /neu
antistoff (monoklonalt antistoff, LAB VISION, CA, USA), i en 1: 200 fortynning og 50 pl i 1 time ved 4 ° C. Fargede celler ble vasket to ganger med kald PBS. Farging og vasking ble utført i PBS (fosfatbufferoppløsning, pH 7,6 Ca ++ Mg ++ fri, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 2% FBS. Etter vasking to ganger i en sekundær FITC-anti-antistoff (anti-muse-FITC-konjugert antistoff, Novocastra, USA) ble anvendt i en 1:40 fortynning, og 50 ul ble inkubert i 40 minutter ved 4 ° C, hvoretter deretter vasket to ganger med kald PBS. Etter endt farging ble filtrering celle løsning som brukes 40 um nylon mesh få én celle suspendert saken og gjøre analyser i FACS.
MTT analysen (in vitro Herceptin og kjemoterapeutika sensitivitet test i mage kreft cellelinjer)
MTT-analysen er blitt anvendt for in vitro
medikamentsensitivitetstesten i magecancercellelinjer. MTT-fargestoff [3- (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazoliumbromid] er redusert til formazan (en mørk lilla vann uoppløselig forbindelse) ved succinatdehydrogenase system av aktiv mitokondrier, og dermed spesielt brukes til den optiske tetthet (OD) av brønnene ble målt i en enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) leser Sunrise (TECAN) ved 560 nm. OD korrelert lineært med antall levedyktige celler. Celler ble sådd ut i 180 ul media av 1 x 10 4 celler per brønn i en 96 brønners plate og inkubert i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
For enkelt medikament sensitivitetstesten, ble to fremgangsmåter anvendt. Først Herceptin (4,625, 9,25, 18,5, 37 mm), doxorubicin (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 mm), cisplatin (0,166, 1,666, 16.66, 166,6 mm), paclitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 mm) og 5-FU (38,43, 384,37, 3843,78, 38437,8 uM) ble fortynnet i 20 ul media og tilsatt til platene og inkubert i 4 dager. Kontrollgruppen ble lagt bare media uten narkotika og ruges samme varighet. For det andre, synergistisk effekt av kombinasjonsbehandling med en kombinasjon av Herceptin + doksorubicin, Herceptin + Cisplatin, Herceptin + paclitaxel og Herceptin + 5- FU.
Når kombinasjonsbehandling Herceptin og hver kreft narkotika gjennomført sensitivitetstest, fast molar konsentrasjon prosent av begge medikamenter, etter deretter å tilsette 50 ul MTT ble MTT oppløst i fosfatbuffer med konsentrasjonen av 2 mg /mL, tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer mer. Etter fjerning av supernatanten, som er lagt inn 150 ul DMSO (dimetylsulfoksid, Sigma, USA) i hver brønn og forsiktig risting ca. 15 minutter for å oppløse den genererte formazan. Den optiske tetthet (OD) av brønnene ble målt i en enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) avleser ved 562 og 720 nm. Den maligne celle overlevelse ble beregnet ved ligningen (OD av legemiddel godt OD blank brønn /gjennomsnitts OD av kontroll i tillegg - OD på blank brønn) x 100%. MTT-analyse ble utført og gjentatt tre ganger for hver dose av medikamentet (5 brønn) resultatene ble analysert for å oppnå den gjennomsnittlige.
CI verdiberegningen etter kombinasjonsterapi
CI (Kombinasjonsindeks) ble oppnådd ved formelen Chou-Talalay, ble beregnet fra verdien av IC50 (Dm) sammenlignet effekten og kapasitetskurven (m verdien). Klassiske formel av isobologram (CI = 1) var som følger. CI =
D
en Twitter /
Dx 1
+
D
2 Twitter /
Dx 2
Nevner av (Dx) 1 og (Dx) 2 var indikerer hvor stor andel cytotoksisitet av når de ble behandlet med ett medikament alene; telleren (D) 1, og (D) 2 var viser den prosentvise cytotoksisitet av når de ble behandlet med begge legemidler. Dx =
Dm FA /
1
-
fa en
m
Dm er median effektdose (IC50), dette beregnes av median-effekt plottet på X-aksen fra antilog. X
= Innlogging D
versus Y
= Innlogging f
en Twitter /
1
-
f
en
m er skråningen av median-effekt plot. Blandingseffekt analyse ved hjelp av Calcusyn (Biosoft, Cambridge, UK), ble beregnet verdier av m, Dm, Dx, og CI. (Dx) 1 og (Dx) 2 ble beregnet ved bruk av Chou-Talalay median-effekt formel. CI < 1, CI = 1, CI > 1 ble kalt henholdsvis synergisme, summering, og antagonisme effekter
Statistiske evaluering
Statistiske analyser av dataene ble utført ved hjelp av den tosidige Student t
-test (SPSS 13.0 programvare; SPSS, Chicago, IL). . p
verdier som er mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Analyse av varians (ANOVA) ble brukt for multiple gruppesammenligninger for å bestemme den potensielle antitumoreffekter mellom gruppene.
Resultater
HER-2 /neu-ekspresjon i magecancercellelinjer ved FACS
ekspresjon av HER2 /neu protein ble analysert i tre forskjellige magecancercellelinjer (YBC-2, YBC-3 og NCI-N87). Ekspresjonen av dette proteinis 48% (svak), 55% (medium) og 88% (sterk) i YBC-2, YBC-3 og NCI-N87, respektivt. Ekspresjon av dette protein var 89% i positiv brystkreft cellelinjen SK-BR-3, og 6% i negativ hjernetumorcellelinje U-87 MG (figur 1). Figur 1 HER-2 /neu-ekspresjon i magecancercellelinjer. Ekspresjonen av HER2 /neu-protein i alle kreftcellelinjer ble målt ved fluorescens-aktivert cellesorteringsanalyse. HER2 /neu-ekspresjon i tre magecancercellelinjer (YBC-2, YBC-3 og NCI-N87) var 48% (svak), 55% (medium) og 88% (sterk), respektivt. Alle grupper av isotypekontroll var ikke mer enn 0,5% (data ikke vist). Som den positive kontroll, SK-BR-3 av HER2 /neu uttrykk er 89%. U-87 MG viste lavere ekspresjon av HER2 /neu (6%) som negetive kontroll.
Følsomhet for magekreft cellelinje for å Herceptin og anti-kreft legemiddel og analysen av sensitivitet overfor enkeltmedikamentbehandling in vitro
i enkelt bruk av Herceptin, arrestasjonen av cellevekst var svak og IC 50 var ikke påvises in vitro med magekreft cellelinje (figur 2). I motsetning til fire forskjellige anti-kreft legemidler (doxorubincin, cisplatin, paclitaxel og 5-FU) viste doseavhengig inhibisjon av cellevekst og IC 50 ble påvist (tabell 1, figur 2). Figur 2 kjemosensitivitet av HERCEPTIN og fire anti-kreft narkotika i mage kreft cellelinjer. I enkelt bruk av Herceptin, arrestasjonen av cellevekst var svak og IC50 var ikke påvises in vitro med magekreft cellelinje. I motsetning til fire forskjellige anti-kreft legemidler (doxorubincin, cisplatin, paclitaxel og 5-FU) viste doseavhengig inhibisjon av cellevekst og IC50 ble detektert.
Tabell 1 IC30 og IC50 på fem anti-kreft midler mot YBC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG og SK-BR-3 cellelinjer
cytostatika Book celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP (IC30) mikrometer
YBC-2 <.no> YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
Cytostatika
Cellelinjer (IC 50) iM
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
Effekten av kombinasjonen av Herceptin og anti-kreft medikamenter
I kombinasjonen Herceptin og doxorubincin behandling, den synergistiske effekten ble observert i YBC-2 og NCI-N87-celler, men ikke i YBC-3 cellelinjen, som har svak ekspresjon av HER2 /neu
protein (tabell 2, figur 3a, P
< 0,05). I kombinasjonen Herceptin og cisplatin, ble synergieffekter observert i SK-BR-3, NCI-N87 og YBC-3 cellelinjer (CI < 1, P
< 0,05). Men den hemmende effekter ble observert i YBC-2 og U-87 MG-cellelinjer (Kombinasjonsindeks > 1, P
< 0,05) (tabell 3, figur 3b). Behandlingen av Herceptin og paklitaxel, i YBC-3 og U-87 MG-cellelinjer, ble det observert inhibitoreffektene (CI > 1), men i YBC-3 cellelinjen, ble det observert en synergistisk effekt (CI < 1 P
< 0,05). I SK-BR-3 og NCI-87 cellelinjene, effektene var forskjellig avhengig av dosen av legemidler (tabell 4, figur 3c). I kombinasjonen av Herceptin og 5-FU, ble den hemmende effekter observert i alle cellelinjene (CI > 1, P
< 0,05) (tabell 5, figur 3d) .table to beregnede verdier for Kombinasjon indeksen som en veksthemmende virkning av kombinasjonsbehandling med HERCEPTIN og doxorubicin i magekreftcellelinjer
YBC-2
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm product: m
r
DOX
2.93
0,54
0,98
HER
1201,02
0,32
0,91
DOX + HER
0,09
0,05
0,03
0,25
0,74
0,96
Diagnose kombinert effekt
synergi
synergi
synergi
YBC-3
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2.310
0,768
0,946
HER
46,063
0,623
0,970
DOX + HER
0,266
0,598
1,377
0,406
0,469
0,925
Diagnose kombinert effekt
synergi
synergi
antagonisme
NCI-N87
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,070
0,398
0,864
HER
113350
0,191
0,635
DOX + HER
0,005
0,004
0,003
0.000
0,437
0,995
Diagnose kombinert effekt
synergi
synergi
synergi
U-87 MG
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,295
0,620
0,997
HER
1845,5
0,457
0.860
DOX + HER
0,441
0,435
0,448
0,101
0,589
0,992
Diagnose kombinert effekt
synergi
synergi
synergi
SK-BR-3
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,103
0,832
0,998
HER
1.424.000
0,046
0,435
DOX + HER
0,046
0,074
0,117
0,005
0,616
0,985
Diagnose kombinert effekt
synergi
synergi
synergi
DOX
, Doxorubicin; HER
, Herceptin.
Figur 3 Kombinasjon indeksen så en vekst hemmende effekt av kombinasjonsbehandling med legemidler mot kreft HERCEPTIN og. en. I kombinasjonen av Herceptin og doxorubincin behandling, ble den synergistiske effekt som observeres i YBC-2 og NCI-N87-celler, men ikke i YBC-3 cellelinje. b. I kombinasjonen Herceptin og cisplatin, ble synergieffekter observert i SK-BR-3, NCI-N87 og YBC-3 cellelinjer (CI < 1). Men den hemmende effekter ble observert i YBC-2 og U-87 MG-cellelinjer (CI > 1). c. Behandlingen av Herceptin og paklitaxel, i YBC-3 og U-87 MG-cellelinjer, ble det observert inhibitoreffektene (CI > 1), men i YBC-3 cellelinjen, ble det observert en synergistisk effekt (CI < 1 ). I SK-BR-3 og NCI-87 cellelinjene, effektene var forskjellig avhengig av dosen av narkotika. d. I kombinasjonen av Herceptin og 5-FU, ble den hemmende effekter observert i alle cellelinjene (CI > 1).
Tabell 3 Beregnede verdier for Kombinasjon indeks som en veksthemmende virkning av kombinasjonsbehandlingen med HERCEPTIN og Cisplatin i magekreft cellelinjer
YBC-2
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50

ED75
ED90
Dm product: m
r
CDDP
4,512
0,921
0,882
HER
1201,0
0,316
0,915
CDDP + HER
1,375
2,707
5,337
2,232
0,587
0,965
Diagnose kombinerte effekten
antagonisme
antagonisme
antagonisme
YBC-3
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
30,733
2,227
0,929
HER
46,063
0,623
0,970
CDDP + HER
0,274
0,110
0,054
12,091
1,472
0,998
Diagnose kombinert effekt
synergi
synergi
synergi
NCI-N87
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
45.86
0,53
0.93
HER
1.13E + 05
0,19
0,63
CDDP + HER
0,03
0,01
0,01
0,83
0,88
0,96
Diagnose kombinert effekt
synergi
synergi
synergi
U-87 MG
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
5,65
1,08
0,98
HER
1845,53
0,46
0.86
CDDP + HER
9.18
9,85
10.58
2,56
1.01
0.99
Diagnose kombinert effekt
antagonisme
antagonisme
antagonisme
SK-BR-3
kombinasjon indeksverdi
Parameter (mm)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r</sup></sub>