Correlação entre HER-2 /neu (-2 erbB) Nível de expressão e o efeito terapêutico do tratamento com Herceptin e agentes quimioterapêuticos, em correlação lines

célula cancerosa gástrica entre HER-2 /neu (-2 erbB) Nível de expressão e o efeito terapêutico do tratamento de combinação com agentes quimioterapêuticos Herceptin e em linhas celulares de cancro gástrico arte abstracta
Introdução
Embora o câncer gástrico avançado tem muitas limitações e taxa de resposta é marginal na quimioterapia. A sobre-expressão do receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2 /neu
) do gene e a sua proteína estão associadas com o aumento da divisão celular e uma elevada taxa de crescimento do tumor e foram relatadas em várias malignidades. Especialmente, aproximadamente 30% dos pacientes com cancro da mama têm sobre-expressão de HER-2 /neu
proteína e a sobre-expressão metástase mais rápido, induz a resistência da quimioterapia e da função de receptor de estrogénio regular negativamente. HER2 recombinante humanizado anti-anticorpo (Herceptin) inibe a proliferação de HER-2 /neu
células tumorais sobre-expressam e o uso de que, em combinação no cancro da mama metastático aumentaram a citotoxicidade dos agentes quimioterapêuticos.
Métodos
Nós avaliadas a expressão de HER-2 /neu
proteínas em linhas de células gástricas por FACS e em seguida, comparando a citotoxicidade em quimioterapêuticos (doxorubicina, cisplatina, paclitaxel, 5-FU) sozinho e em combinação com Herceptin de acordo com a expressão de HER-2 neu
proteína /por ensaio MTT.
resultados
1. NCI-N87 (88%) linhagem celular de câncer gástrico e SK-BR-3 (89%) linhagem de células do cancro da mama com forte positividade de ela- expressão 2 /neu
. YBC-2 (55%) e YBC-3 (48%) linha celular de cancro gástrico com intermediados, positividade fraca, respectivamente. controle negativo U-87 MG (6%) linhagem celular de câncer cerebral foram apresentou baixa expressão de HER-2 /neu. 2. O crescimento celular foi dose-dependente inibida de HER-2 /neu
linha positiva, célula de controlo SK-BR-3 por tratamento com Herceptin, mas não observado em HER-2 neu
linha celular de controlo /negativo U-87 MG. inibição de crescimento eficaz não foi observada em linhas de células de cancro gástrico com um tratamento único de Herceptin, todas as linhas celulares observou-se a inibição do crescimento dependente da dose de agentes quimioterapêuticos (doxorubicina, cisplatina, paclitaxel e 5-FU). 3. Combinação de Herceptin com doxorrubicina observados efeitos sinérgicos em todas as linhas de células de cancro excepto YBC-3, combinação de Herceptin com cisplatina observou NCI-N87 e SK-BR-3 e combinação de Herceptin com paclitaxel observados efeitos sinérgicos em YBC-2. Combinação de Herceptin com 5-FU observados efeitos antagônicos em todas as linhas celulares de cancro.
Conclusões
De acordo com HER-2 /neu
nível de expressão, foi observado efeito de agentes anti-câncer diferente em combinação de Herceptin com agentes quimioterapêuticos. Isto sugere que HER-2 /neu
nível de expressão pode ser aplicada padrão de seleção combinação de drogas na combinação de Herceptin com agentes quimioterápicos em câncer gástrico.
Palavras-chave
HER-2 /neu
(erbB- 2) o tratamento combinado câncer gástrico HERCEPTIN CI Introdução
Desde conhecido que as vias de transdução de sinal pelo fator de crescimento e seu receptor desempenham um papel impotente no processo cancerígeno muitos estudos estão sendo conduzidos. A proteína HER-2 /neu
(erbB-2), a glicoproteína da membrana da célula, é um receptor do factor de crescimento tem a actividade de tirosina-cinase do receptor [1]. HER2 tem sido frequentemente detectadas em uma ampla gama de tumores humanos. secreção de célula normal associada a proteína HER-2 /neu, mas a destruição de células normais controlam causando superexpressão da proteína, aumenta a taxa de divisão celular e crescimento induzir alterações pré-cancerosas [2].
O HER-2 /neu
( do gene erbB-2), que está localizado no cromossoma humano 17q21 [3], que tem homologia parcial com o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) [4, 5]. EGF (factor de crescimento epidérmico) família de receptores tem a actividade de tirosina-cinase do receptor e consistiu de receptor de EGF, c-erbB-2, c-erbB-3 e c-erbB-4 [6-8]. O HER-2 /neu oncoprotein, codifica uma glicoproteína de membrana p185kD, receptor que está envolvida no crescimento e diffentiation das células tumorais e 25 ~ 30% sobre-expresso nos cancros da mama, do ovário e carcinomas gástricos [9-12] e o prognóstico desses pacientes é pobre [13-15].
superexpressão do gene HER-2 /neu
e é a proteína estão associados prognóstico e terapia [16-18] e expressão do paciente com câncer de mama HER-2 /neu
é altamente necessária para o crescimento tumoral [19]. Aqueles sugerem que HER-2 /neu
envolvidos na ocorrência do cancro da mama, e progressão maligna e HER-2 /neu sobre-expressão
é mais importante do que os receptores de hormonas sobre os pacientes com metástases do linfonodo [9]. Portanto, estes alvos terapêuticos HER-2 /neu
fármacos de proteína, recombinante humanizado anti-HER-2 /neu
anticorpo - Herceptin, eficazes no tratamento de cancro da mama tem sido relatada [20]
gástrico. o cancro é o cancro mais prevalente na China. A ocorrência de câncer gástrico é o processo cancerígeno de várias etapas com mutações genéticas de variedades. HER-2 estatuto é correlacionada com a profundidade de invasão, estágio TNM, linfonodo e metástases à distância do câncer gástrico [21]. HER-2 /neu sobre-expressão está relacionada com mau prognóstico do câncer gástrico, mas tem um efeito modesto sobre a sobrevivência no cancro gástrico como fator prognóstico independente [22]. Herceptin® como um agente citostático, a terapia mono eficiente dos efeitos antitumorais não se pode esperar, mas um monte de investigação está em andamento para a terapia de combinação com outros fármacos anti-cancerígenos ou agentes biológicos. No entanto, ainda não estudar exacta da terapia de combinação de Herceptin com drogas anti-cancro em linhas de células gástricas [13]. Portanto, neste estudo nós investigamos a combinação eficazes de Herceptin (trastuzumab, Genentech Inc, CA, EUA) [23-25], a segmentação para HER-2 /neu oncoprotein
, com drogas anti-cancro em linhas celulares de cancro gástrico , dependendo do HER-2 /neu
oncoproteínas expressão.
Materiais e métodos células

linhas celulares de cancro gástrico foram usadas YBC-2, 3-YBC e NCI-N linhas 87 celulares. As linhas celulares YBC-2 e YBC-3 foram estabelecidas a partir de cancro gástrico metastático intraperitoneal pelo Departamento de Patologia da Universidade Yanbian. A linha de 87 células NCI-N foi estabelecido no Estado Unidos pelo NCI (National Cancer Institute, CRL5822, EUA). O U-87 MG (ATCC, HTB14) linha de células de tumor cerebral e SK-BR-3 (ATCC, HTB30) linha celular de cancro da mama foram usadas para HER-2 /neu
controlo positivo e negativo a expressão da proteína, respectivamente.
Estas linha celular foram utilização mínima cultivadas meio essencial (MEM, GINCO BRL, Grand Island, NY, EUA), que está contendo inactivado (a 56 ° C durante 30 min), 10% de soro fetal bovino (FBS, GINCO BRL, Grand Island , Nova Iorque, EUA), 100 unidades /ml de penicilina e 0,1 mg /ml de estreptomicina. Todas as incubações foram realizadas de cultura numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO <sub>2 incubadora.
Drogas
Herceptin, Humanoid recombinante HER-2 anticorpo /neu, foi de EUA (Trastuzumab, 440 mg /20 ml , a Genentech Inc., San Francisco, CA, EUA), e fármacos anti-cancerígenos reconhecidos, o efeito no cancro gástrico, adriamicina (doxorrubicina, 10 mg /5 ml), a cisplatina (a cisplatina, 10 mg /frasco), Taxol (paclitaxel, 30 mg /frasco) e 5-FU (5-Flourouracil, 250 mg /5 ml) eram da China. Ao fazer cada experimento droga foi usada diluída em meio de cultura celular.
Análise FACS (HER-2 /expressão da proteína neu)
HER-2 /neu
(erbB-2) expressão de oncoproteínas foi feito usando Fluorescence- Classificador de células activadas (FACS, Becton Dickinson, EUA) realizada na imunofenotipagem da superfície celular. Células de cultura (1 × 10 <sup>6) foram recolhidas após tratamento com tripsina-EDTA (GIBCOBRL, Grand Island, NY, EUA) e incubados com o anticorpo primário, anti-HER-2 /neu
anticorpo (monoclonal de ratinho anticorpo, Lab Vision, CA, EUA), numa diluição de 1: 200 e 50 ul de 1 hora a 4 ° C. As células coradas foram lavadas duas vezes com PBS frio. Coloração e lavagem foram realizadas em PBS (solução de tampão fosfato, pH 7,6 Ca Mg ++ ++ livre, GIBCO BRL, Grand Island, NY, EUA) 2% de FBS. Depois de se lavar duas vezes um anticorpo FITC-anti-rato secundário (anticorpo anti-rato conjugado com FITC, Novocastra, EUA) foi utilizado numa diluição de 1:40, e 50 ul foram incubadas durante 40 minutos a 4 ° C, depois de, em seguida, lavada duas vezes com frio PBS. Depois de completar a coloração, solução de célula de filtração foram utilizados 40 hum malha de nylon obter a única matéria em suspensão de células e análise fazendo no ensaio MTT FACS.
(In vitro Herceptin e agentes quimioterápicos teste de sensibilidade em linhas celulares de cancro gástrico)
o ensaio MTT foi utilizado para o teste in vitro
sensibilidade ao fármaco em linhas celulares de cancro gástrico. Corante MTT [3- (4,5- dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio] é reduzido a formazano (um composto insolúvel água roxo escuro) pelo sistema de succinato desidrogenase das mitocôndrias activa, e, por conseguinte, especificamente usado para a densidade óptica (dO) dos poços foi medida num ensaio imunoabsorvente (ELISA) leitor ligado a enzima do nascer do sol (TECAN) a 560 nm. O OD correlacionada linearmente com o número de células viáveis. As células foram plaqueadas em 180 ul de meios de comunicação 1 × 10 4 células por poço numa placa de 96 multi-poços e incubou-se durante 24 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Compra de droga única teste de sensibilidade, foram aplicados dois métodos. Em primeiro lugar, Herceptin (4,625, 9,25, 18,5, 37? M), doxorrubicina (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 ^ M), cisplatina (0,166, 1,666, 16,66, 166,6 mM), o paclitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 ^ M) e 5-FU (38,43, 384,37, 3843,78, 38437,8 uM) foram diluídos em 20 ul meios e adicionados às placas e incubados durante 4 dias. grupo de controle foram adicionados apenas mídia sem as drogas e incubadas mesmas durações. Em segundo lugar, o efeito sinérgico da terapia combinada com uma combinação de Herceptin + doxorrubicina, Herceptin + Cisplatina, Herceptin + paclitaxel e Herceptin + 5- FU. Quando o tratamento
combinação Herceptin e cada fármaco anticancerígeno teste de sensibilidade realizado, fixo percentagem concentração molar de ambas as drogas, após a adição, em seguida, 50 ul de MTT, MTT foi dissolvido em tampão de fosfato com a concentração de 2 mg /mL, adicionou-se a cada poço e incubou-se mais 4 horas. Depois de remover o sobrenadante, colocado 150 uL de DMSO (sulfóxido de dimetilo, Sigma, EUA) em cada poço e agitando a cerca de 15 minutos para dissolver o formazano gerado. A densidade óptica (DO) dos poços foi medida num leitor de ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) a 562 e 720 nm. A sobrevivência da célula maligna foi calculada pela equação (OD de drogas bem-OD de bem em branco /média OD de controlo do poço - OD de bem branco) × 100%. ensaio de MTT foi realizada e repetida três vezes para cada dose de fármaco (5 poço) os resultados foram analisados ​​para se obter o
cálculo da média. valor CI após a terapia de combinação
CI (índice de combinação) foi obtido pela fórmula de Chou-Talalay, foi calculada a partir do valor de IC50 (Dm) comparou a eficácia e a curva de capacidade (o valor m). fórmula clássica do isobolograma (IC = 1) foi como se segue. CI =
D
1 | /Tablet Dx 1 | +
D
2
/Tablet Dx 2
Denominador da (Dx) 1 e (Dx) 2 foram indicar o percentual citotoxicidade de quando tratados apenas com única droga; numerador de (D) 1 e (D) 2 foram indicam a percentagem de citotoxicidade quando tratados com ambos os fármacos. Dx =
Dm fa /Tablet 1 | -
fa 1 | m
Dm é a dose do efeito mediano (IC50), este calculado por parcela do efeito mediano do X-intercepção do antilog. X
=
log D
contra Y
=
log f
um
/Tablet 1 | -
f
um
m é a inclinação do gráfico do efeito mediano. análise múltipla efeito da droga usando CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK), foram calculados os valores de m, Dm, Dx, e CI. (Dx) 1 e (Dx) 2 foram calculadas usando a fórmula do efeito mediano de Chou-Talalay. CI < 1, CI = 1, CI > 1 foram chamados sinergismo, somatório e efeitos antagonismo respectivamente analisa avaliação
Estatística
estatística dos dados foram realizados usando o Student bicaudal t
-test (SPSS 13.0; SPSS, Chicago, IL). . p
valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise de variância (ANOVA) foi utilizado para as comparações múltiplas de grupo para determinar os efeitos potenciais antitumorais entre os grupos.
Resultados
HER-2 expressão /neu em linhas celulares de cancro gástrico por FACS
A expressão de HER2 /neu proteína foi analisada em três linhas celulares de cancro de estômago diferentes (YBC-2, YBC-3 e NCI-N87). A expressão deste proteinis 48% (fraco), 55% (média) e 88% (forte) em YBC-2, 3-YBC e NCI-N87, respectivamente. A expressão desta proteína foi de 89% na linha celular de cancro da mama positivo SK-BR-3, e 6%, em linha de células de tumor cerebral negativo U-87 MG (Figura 1). A Figura 1 HER-2 /neu de expressão em linhas celulares de cancro gástrico. A expressão da proteína HER2 /neu em todas as linhas celulares de cancro foram medidos por análise de triagem de células activadas por fluorescência. A expressão de HER2 /neu em três linhas de células de cancro gástrico (YBC-2, 3-YBC e NCI-N87) foram de 48% (fraco), 55% (média) e 88% (forte), respectivamente. Todos os grupos de controlo de isotipo não eram mais do que 0,5% (dados não mostrados). Como controlo positivo, SK-BR-3 de expressão de HER2 /neu é de 89%. U-87 MG mostraram menor expressão de HER2 /neu (6%) como controle negetive.
A sensibilidade da linha de células de cancro do estômago ao Herceptin e drogas anti-câncer e a análise de sensibilidade ao tratamento único medicamento in vitro
em uma única utilização de Herceptin, a prisão de crescimento celular era fraco e IC 50 não era detectável in vitro com a linha de células de câncer de estômago (Figura 2). Em contraste, a quatro diferentes drogas anti-cancro (doxorubincin, cisplatina, paclitaxel e 5-FU) mostrou inibição dependente da dose do crescimento das células e IC 50 foi detectada (Tabela 1, Figura 2). Figura 2 Chemosensitivity de Herceptin® e quatro drogas anti-cancro em linhas celulares de cancro gástrico. Em uma única utilização de Herceptin, a prisão de crescimento celular era fraco e IC50 não foi detectada in vitro com a linha de células de câncer de estômago. Em contraste, a quatro diferentes drogas anti-cancro (doxorubincin, cisplatina, paclitaxel e 5-FU) mostrou inibição dependente da dose do crescimento das células e IC50 foi detectado.
Tabela 1 IC30 e IC50 de cinco agentes anti-cancro contra YBC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG e SK-BR-3 linhas celulares
agentes anticâncer
As linhas celulares
(IC30)? M
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
agentes anticancerígenos
linhas celulares (IC 50)? M
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
O efeito da combinação de Herceptin e drogas anti-cancro
Na combinação de Herceptin e doxorubincin tratamento, observou-se o efeito sinergético em YBC-2 e células NCI-N87, mas não na linha celular YBC-3, que tem fraca expressão de HER2 /neu
proteína (Tabela 2, Figura 3a, P
< 0,05). Na combinação de Herceptin e cisplatina, observaram-se os efeitos sinergéticos em linhas celulares YBC-3 SK-BR-3, NCI-N87 e (CI < 1, P
< 0,05). No entanto, foram observados os efeitos inibidores em YBC-2 e as linhas de células MG 87 L (índice de combinação > 1, P
< 0,05) (Tabela 3, Figura 3b). O tratamento de Herceptin e paclitaxel, em YBC-3 e U-87 linhas de células MG, foram observados os efeitos inibidores (CI > 1), no entanto, na linha celular YBC-3, observou-se o efeito sinérgico (CI < 1 , P
< 0,05). Em linhas SK-BR-3 NCI-87 e células, os efeitos eram diferentes depende da dose dos medicamentos (Tabela 4, Figura 3c). Na combinação de Herceptin e 5-FU, foram observados os efeitos inibidores em todas as linhas de células (CI > 1, P
< 0,05) (Tabela 5, Figura 3d) .table dois valores calculados para a combinação índice como um efeito inibidor do crescimento do tratamento de combinação com Herceptin® e doxorrubicina em linhas celulares de cancro gástrico
YBC-2
combinação índice de Valor
Parâmetro (M)
drogas
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2,93
0,54
0,98
HER
1.201,02
0,32
0,91
DOX + HER
0,09
0,05
0,03
0,25
0,74
0,96
Diagnóstico efeito combinado
sinergia
sinergia
sinergia
YBC-3
Combinação Índice de Valor
Parâmetro (M)
drogas
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2.310
0,768
0,946
HER
46,063
0,623
0,970
DOX + HER
0,266
0,598
1.377
0,406
0,469
0,925
Diagnóstico efeito combinado
sinergia
sinergia
antagonismo
NCI-N87
Combinação Índice de Valor
Parâmetro (m)
drogas
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,070
0,398
0,864
HER
113350
0,191
0,635
DOX + HER
0,005
0,004
0,003
0.000
0,437
0,995
Diagnóstico combinado efeito
sinergia
sinergia
sinergia
U-87 MG
Combinação Índice de Valor
Parâmetro (M)
drogas
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,295
0.620
0,997
HER
1.845,5
0,457
0,860
DOX + HER
0,441
0,435
0,448
0,101
0,589
0,992
Diagnóstico combinado efeito
sinergia
sinergia
sinergia
SK-BR-3
Combinação Índice de Valor
Parâmetro (M)
drogas
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,103
0,832
0,998
HER
1.424.000
0,046
0,435
DOX + HER
0,046
0,074
0,117
0,005
0,616
0,985
Diagnóstico combinado efeito
sinergia
sinergia
sinergia
DOX
, doxorrubicina; , Herceptin. SEU
Figura 3 Índice de combinação como um efeito inibidor do crescimento do tratamento de combinação com Herceptin® e agentes anti-cancro. uma. Na combinação de Herceptin e doxorubincin tratamento, observou-se o efeito sinergético em células YBC-2 e NCI-N87, mas não na linha celular YBC-3. b. Na combinação de Herceptin e cisplatina, observaram-se os efeitos sinergéticos em linhas celulares YBC-3 SK-BR-3, NCI-N87 e (CI < 1). No entanto, foram observados os efeitos inibidores em YBC-2 e L-87 linhas celulares mg (CI > 1). c. O tratamento de Herceptin e paclitaxel, em YBC-3 e U-87 linhas de células MG, foram observados os efeitos inibidores (CI > 1), no entanto, na linha celular YBC-3, observou-se o efeito sinérgico (CI < 1 ). Em linhas SK-BR-3 NCI-87 e células, os efeitos eram diferentes depende da dose dos medicamentos. d. Na combinação de Herceptin e 5-FU, foram observados os efeitos inibidores em todas as linhas de células (CI > 1).
Tabela 3 Os valores calculados para o índice de combinação, tal como um efeito inibidor do crescimento do tratamento de combinação com Herceptin® e cisplatina no câncer gástrico linhas celulares
YBC-2
Combinação Índice de Valor
Parâmetro (M)
drogas
ED50

ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
4.512
0,921
0,882
seu
1.201,0
0,316
0,915
CDDP + HER
1,375
2.707
5.337
2.232
0,587
0,965
Diagnóstico efeito combinado
antagonismo
antagonismo
antagonismo
YBC-3
Combinação Índice de Valor
Parâmetro (M)
drogas
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
30,733
2.227
0,929
HER
46,063
0,623
0,970
CDDP + HER
0,274
0,110
0,054
12,091
1.472
0,998
Diagnóstico efeito combinado
sinergia
sinergia
sinergia
NCI-N87
combinação Índice de Valor
Parâmetro (m)
drogas
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
45,86
0,53
0,93
HER
1.13E + 05
0,19
0,63
CDDP + HER
0,03
0,01
0,01
0,83
0,88
0,96
Diagnóstico efeito combinado
sinergia
sinergia
sinergia
U-87 MG
Combinação Índice de Valor
Parâmetro (M)
drogas
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
5,65
1,08
0,98
HER
1.845,53
0,46
0,86
CDDP + HER
9,18
9,85
10,58
2,56
1,01
0,99
Diagnóstico efeito combinado
antagonismo
antagonismo
antagonismo
SK-BR-3
Combinação Índice de Valor
Parâmetro (m)
drogas
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r</sup></sub>