Korrelation mellem HER-2 /neu (erbB-2) ekspressionsniveau og terapeutiske virkning af kombinationsbehandling med HERCEPTIN og kemoterapeutiske midler i gastrisk cancercellelinie lines

korrelation mellem HER-2 /neu (erbB-2) ekspressionsniveau og terapeutiske virkning af kombinationsbehandlingen med Herceptin og kemoterapeutika i gastrisk cancer cellelinjer
Abstrakt
Introduktion
Selvom fremskreden mavekræft har mange begrænsninger og svarprocent er marginal i kemoterapi. Overekspression af human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER-2 /neu
) genet og dets protein er forbundet med øget celledeling og en høj tumorvækst og er blevet rapporteret i flere maligniteter. Især, ca. 30% af brystkræftpatienter har overekspression af HER-2 /neu
protein og overekspressionen metastaserer hurtigere, inducerer modstand af kemoterapi og nedregulere funktionen af ​​østrogenreceptoren. Rekombinant humaniseret anti-HER2-antistof (Herceptin) inhiberer proliferation af HER-2 /neu
overudtrykkende tumorceller og anvendelsen af ​​denne i kombination i metastatisk brystcancer har øget cytotoksicitet af kemoterapeutiske midler. Salg Metoder
Vi evaluerede ekspressionen af ​​HER-2 /neu
protein i gastriske cellelinjer ved FACS og derefter sammenligne cytotoksiciteten i kemoterapeutika (doxorubicin, cisplatin, paclitaxel, 5-FU) alene og i kombination med Herceptin ifølge ekspressionen af ​​HER-2 /neu
protein ved MTT-assayet.
Resultater Salg 1. NCI-N87 (88%) gastrisk cancercellelinie og SK-BR-3 (89%) brystcancercellelinie med stærk positivitet af HER- 2 /neu
ekspression. YBC-2 (55%) og YBC-3 (48%) gastrisk cancercellelinie med formidlere, svag positivitet hhv. Negativ kontrol U-87 MG (6%) hjernekræft cellelinie var viste lav ekspression af HER-2 /neu. 2. Cellevækst blev dosisafhængigt inhiberet i HER-2 /neu
positiv, kontrol cellelinje SK-BR-3 ved Herceptin behandling men ikke observeret i HER-2 /neu
negativ kontrol cellelinje U-87 MG. Effektiv vækstinhibering blev ikke observeret i gastrisk cancer cellelinjer med enkelt behandling med Herceptin, alle cellelinjer observerede den dosisafhængige vækstinhibering til kemoterapeutiske midler (doxorubicin, cisplatin, paclitaxel og 5-FU). 3. Kombination af Herceptin med doxorubicin observerede synergistiske virkninger i alle cancer cellelinjer undtagen YBC-3, en kombination af Herceptin med cisplatin observeret NCI-N87 og SK-BR-3 og kombinationen af ​​Herceptin med paclitaxel observeret synergistiske virkninger i YBC-2. Kombination af Herceptin med 5-FU observeret antagonistiske virkninger i alle cancer cellelinjer.
Konklusioner
Ifølge HER-2 /neu
udtryk plan blev observeret effekt af anti-cancer forskelligt i kombination med Herceptin med kemoterapeutiske midler. Dette antyder, at HER-2 /neu
ekspressionsniveau kan anvendes standard for udvælgelse kombination lægemiddel i kombination med Herceptin med kemoterapeutiske midler i gastrisk cancer. Salg Nøgleord
HER-2 /neu
(erbB- 2) HERCEPTIN Gastrisk kræft Kombinationsbehandling CI Introduktion
Siden kendt at signaltransduktionsveje af vækstfaktor og dens receptor spiller en impotent rolle i den kræftfremkaldende proces mange undersøgelser bliver gennemført. HER-2 /neu
(erbB-2) protein, cellemembran glycoprotein, er en vækstfaktor-receptor har aktiviteten af ​​receptortyrosinkinase [1]. HER2 er ofte blevet detekteret i en lang række humane tumorer. Normal celle sekretion forbundet med HER-2 /neu protein, men destruktion af normale celler styrer forårsager proteinoverekspression, forøger celledeling og vækst inducerer præcancer ændringer [2].
HER-2 /neu
( erbB-2) -genet, som er placeret på humant kromosom 17q21 [3], som har delvis homologi med den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR) [4, 5]. EGF (epidermal vækstfaktor) receptorfamilien har aktiviteten af ​​receptortyrosinkinase og bestod af EGF-receptor, c-erbB-2, c-erbB-3 og c-erbB-4 [6-8]. HER-2 /neu oncoprotein, koder for et p185kD membranglycoprotein, receptor, der er involveret i væksten og diffentiation af tumorcellerne og 25 ~ 30% overudtrykkes i bryst-, ovarie- og gastriske carcinomer [9-12] og prognosen af ​​disse patienter er fattige [13-15].
Overekspression af HER-2 /neu
genet og det er protein er associeret brystkræft patientens prognose og terapi [16-18] og ekspression af HER-2 /neu
er stærkt påkrævet for tumorvækst [19]. De, tyder på, at HER-2 /neu
involveret i brystcancer forekomst, udvikling og maligne og HER-2 /neu
overekspression er vigtigere end hormonreceptorer på patienter med lymfeknudemetastaser [9]. Derfor er disse terapeutiske mål HER-2 /neu
proteinlægemidler, rekombinant humaniseret anti HER-2 /neu
antistof - Herceptin, effektiv i behandlingen af ​​brystcancer er blevet rapporteret [20]
Gastrisk. kræft er den mest udbredte cancer i Kina. Forekomsten af ​​mavekræft er den flertrinsproces kræftfremkaldende proces med forskellige genetiske mutationer. HER-2-status er korreleret med dybden af ​​invasion, TNM stadie, lymfeknude og fjernt metastase af gastrisk cancer [21]. HER-2 /neu overekspression er relateret til dårlig prognose af gastrisk cancer, men har en beskeden effekt på overlevelse i gastrisk cancer som en uafhængig prognose faktor [22]. Herceptin® som et cytostatisk middel, ikke kan forventes mono terapi effektive af antitumor virkninger, men en masse forskning er i gang for kombinationsbehandling med andre anticancer lægemidler eller biologiske midler. Men stadig ikke præcist studere af kombinationsbehandling Herceptin med anticancer narkotika i gastrisk cellelinjer [13]. Derfor, i dette studie undersøger vi den effektive kombination af Herceptin (trastuzumab Genentech Inc., CA, USA) [23-25], målretning for HER-2 /neu
oncoprotein, med anti-cancer medicin i gastrisk cancer cellelinjer afhængigt af HER-2 /neu
oncoproteinaktivitet ekspression. Salg Materialer og metoder
Celler
gastrisk cancer cellelinier blev anvendt YBC-2, YBC-3 og NCI-N 87 cellelinjer. De YBC-2 og YBC-3 cellelinier blev etableret fra intraperitoneal metastatisk gastrisk kræft ved Patologisk Institut, Yanbian Universitet. Den NCI-N 87 cellelinje blev etableret i Det Forenede stat af NCI (National Cancer Institute, CRL5822, USA). U-87 MG (ATCC, HTB14) hjernetumor cellelinie og SK-BR-3 (ATCC, HTB30) brystcancercellelinie blev anvendt til HER-2 /neu
proteinekspression positiv og negativ kontrol hhv.
Disse cellelinie blev dyrket brug minimum essentielt medium (MEM, GINCO BRL, Grand Island, NY, USA), som er indeholdende inaktiveret (ved 56 ° C i 30 min) 10% føtalt bovint serum (FBS, GINCO BRL, Grand Island , NY, USA), 100 enheder /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin. Alle kultur inkubationer blev udført i en fugtig 37 ° C, 5% CO <sub>2 incubator.
Drugs Salg Herceptin, Humanoid rekombinant HER-2 /neu-antistof, var fra USA (Trastuzumab, 440 mg /20 ml , Genentech Inc., San Francisco, CA, USA), og anerkendte anticancerlægemidler, virkning i gastrisk cancer, Adriamycin (doxorubicin, 10 mg /5 ml), cisplatin (Cisplatin, 10 mg /hætteglas), Taxol (Paclitaxel, 30 mg /hætteglas) og 5-FU (5-fluoruracil, 250 mg /5 ml) var fra Kina. Når man gør eksperiment hvert lægemiddel blev anvendt fortyndet i celledyrkningsmedier.
FACS-analyse (HER-2 /neu protein ekspression)
HER-2 /neu
(erbB-2) oncoproteinet ekspression blev udført ved anvendelse Fluorescence- cellesorteringsapparat (FACS, Becton Dickinson, USA) udført immunofænotypebestemmelse i celleoverfladen. Kultur-celler (1 x 10 <sup>6) blev høstet efter behandler med trypsin-EDTA (GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA) og inkuberet med det primære antistof, anti-HER-2 /neu
antistof (monoklonalt muse- antistof, LAB VISION, CA, USA), i en 1: 200 fortynding og 50 pi i 1 time ved 4 ° C. Farvede celler blev vasket to gange med kold PBS. Farvning og vask blev udført i PBS (phosphat-pufferopløsning, pH 7,6 Ca ++ Mg ++ fri, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 2% FBS. Efter vask to gange en sekundær FITC-antimuse-antistof (Anti-Mouse FITC-konjugeret antistof, Novocastra, USA) blev anvendt i en 1:40 fortynding, og 50 pi blev inkuberet i 40 min ved 4 ° C, efter derefter vasket to gange med koldt PBS. Efter endt farvning blev filtrering celle løsning, der bruges 40 um nylon mesh opnå den enkelt celle suspenderet stof og laver analyser i FACS.
MTT assay (in vitro Herceptin og kemoterapeutika følsomhed test i gastrisk cancer cellelinjer)
MTT-assayet er blevet anvendt til in vitro
lægemiddelfølsomhed test i gastriske cancercellelinier. MTT farvestof [3- (4,5-dimethyl thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid] reduceres til formazan (en mørklilla vand uopløselige forbindelse) af succinatdehydrogenase system for aktiv mitokondrier, og dermed specifikt anvendes til den optiske densitet (OD) af brøndene blev målt i et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) læser Sunrise (TECAN) ved 560 nm. OD korrelerede lineært med antallet af levedygtige celler. Celler blev udpladet ved 180 ul medier på 1 × 10 4 celler per brønd i en brønd mikrotiterplade 96 og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2. Hus Til enkelt lægemiddel følsomhed test blev to fremgangsmåder anvendt. Første, Herceptin (4,625, 9,25, 18,5, 37 uM), doxorubicin (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 uM), cisplatin (0,166, 1,666, 16,66, 166,6 uM), paclitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 uM) og 5-FU (38.43, 384,37, 3843,78, 38437,8 uM) blev fortyndet i 20 pi medier og tilsat til pladerne og inkuberet i 4 dage. Kontrolgruppe blev tilsat kun medier uden lægemidlerne og inkuberet samme varighed. For det andet, den synergistiske effekt af kombinationsbehandling med en kombination af Herceptin + doxorubicin, Herceptin + cisplatin, Herceptin + Paclitaxel og Herceptin + 5-FU.
Når kombinationsbehandling Herceptin og hver anticancer narkotika udført følsomhed test, fast molær koncentration procentdel af begge lægemidler, efter derefter tilsætning af 50 pi MTT blev MTT opløst i phosphatbuffer til en koncentration på 2 mg /pl, tilsat til hver brønd og inkuberes 4 timer mere. Efter fjernelse af supernatanten, som er tilføjet 150 pi DMSO (dimethylsulfoxid, Sigma, USA) i hver brønd og forsigtigt at ryste omkring 15 minutter for at opløse den genererede formazan. Den optiske densitet (OD) af brøndene blev målt i et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) læser ved 562 og 720 nm. Den maligne celle overlevelse blev beregnet af ligningen (OD af lægemiddel godt-OD af blindprøvebrønd /gennemsnitlige OD af kontrol samt - OD af tomme brønd) x 100%. MTT assayet blev udført og gentaget tre gange for hver dosis af lægemidlet (5 brønd) resultaterne blev analyseret til opnåelse af gennemsnit.
CI værdi beregningen efter kombinationsbehandling
CI (Combination index) blev opnået ved formlen for Chou-Talalay, blev beregnet ud fra værdien af ​​IC50 (Dm) sammenlignede virkningen og kapacitet kurven (m-værdi). Klassiske formel af Isobologram (Cl = 1) var som følger. CI =
D
1
/
Dx 1
+
D
2
/
Dx 2
nævneren i (Dx) 1 og (Dx) 2 var indikerer den procentvise cytotoksicitet af, når de behandles med enkelt lægemiddel alene; Tælleren i (D) 1 og (D) 2 var indikerer den procentvise cytotoksicitet af, når de behandles med begge lægemidler. Dx =
Dm fa /
1
-
fa en
m
Dm er medianen-effekt dosis (IC50), dette beregnes ved median-effekt plot af X-skæringspunkt fra antilogaritmen. X
=
logge D
versus Y
=
logge f
en
/
1
-
f
en
m er hældningen af ​​median-effekt plot. Multipel stof effekt analyse ved hjælp CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK), blev beregnet værdier af m, Dm, Dx, og CI. (Dx) 1 og (Dx) 2 blev beregnet ved anvendelse af Chou-Talalay median-effekt formel. CI < 1, CI = 1, CI > 1 blev kaldt synergi, summation, og antagonisme effekter henholdsvis
Statistisk vurdering
statistiske analyser af data blev udført ved hjælp af tosidede Student t
-test (SPSS 13.0 software, SPSS, Chicago, IL). . p
værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til multiple gruppesammenligninger at bestemme de potentielle antitumorvirkninger mellem grupper.
Resultater
HER-2 /neu-ekspression i gastrisk cancer cellelinjer ved FACS
Ekspressionen af ​​HER2 /neu protein blev analyseret i tre forskellige mavekræft cellelinier (YBC-2, YBC-3 og NCI-N87). Ekspressionen af ​​dette proteinis 48% (svag), 55% (medium) og 88% (stærk) i YBC-2, YBC-3 og NCI-N87 hhv. Ekspressionen af ​​dette protein var 89% i positiv brystcancer cellelinje SK-BR-3, og 6% i negativ hjernetumor cellelinje U-87 MG (figur 1). Figur 1 HER-2 /neu-ekspression i gastriske cancercellelinier. Ekspressionen af ​​HER2 /neu protein i alle cancercellelinier blev målt ved fluorescens-aktiveret cellesortering analyse. HER2 /neu-ekspression i tre gastriske cancercellelinier (YBC-2, YBC-3 og NCI-N87) var 48% (svag), 55% (medium) og 88% (stærk), hhv. Alle grupper af isotypekontrol var ikke mere end 0,5% (data ikke vist). Som den positive kontrol, SK-BR-3 i HER2 /neu-ekspression er 89%. U-87 MG viste lavere ekspression af HER2 /neu (6%) som negetive kontrol.
Følsomhed mavekræft cellelinje til Herceptin og anticancerlægemiddel og analysen af ​​følsomhed over for enkelt lægemiddel behandling in vitro
i engangsbrug Herceptin, anholdelsen af ​​cellevækst var svag og IC 50 ikke kunne påvises in vitro med mavekræft cellelinje (figur 2). I modsætning hertil fire forskellige anti-cancer-lægemidler (doxorubincin, cisplatin, paclitaxel og 5-FU) viste dosisafhængig inhibering af cellevækst og blev påvist IC 50 (tabel 1, figur 2). Figur 2 kemosensitivitet af Herceptin® og fire kræftlægemidler i gastrisk cancer cellelinjer. I engangsbrug Herceptin, anholdelsen af ​​cellevækst var svag og IC50 var ikke påvises in vitro med mavekræft cellelinje. I modsætning hertil fire forskellige anti-cancer-lægemidler (doxorubincin, cisplatin, paclitaxel og 5-FU) viste dosisafhængig inhibering af cellevækst og IC50 blev detekteret.
Tabel 1 IC30 og IC50 på fem anticancermidler mod YBC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG og SK-BR-3 cellelinjer
Anticancermidler

cellelinier (IC30) iM
YBC-2

YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
Anticancermidler
Cellelinjer (IC 50) iM
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
Effekten af ​​kombinationen af ​​Herceptin og anti-cancer medicin
I kombinationen af ​​Herceptin og doxorubincin behandling blev synergieffekt observeret i YBC-2 og NCI-N87 celler, men ikke i YBC-3 cellelinie, som har svage ekspression af HER2 /neu
protein (tabel 2, figur 3a, P
< 0,05). I kombinationen af ​​Herceptin og cisplatin, blev der observeret de synergieffekter i SK-BR-3, NCI-N87 og YBC-3 cellelinier (CI < 1, P
< 0,05). Imidlertid blev de inhibitoriske virkninger observeret i YBC-2 og U-87 MG cellelinier (kombination indeks > 1, P
< 0,05) (tabel 3, figur 3b). Behandlingen af ​​Herceptin og paclitaxel, i YBC-3 og U-87 MG-cellelinier blev de inhibitoriske virkninger observeret (Cl > 1), men i YBC-3 cellelinie den synergiske virkning blev observeret (Cl < 1 , P
< 0,05). I SK-BR-3 og NCI-87 cellelinjer, virkningerne var forskellige afhænger af den dosis af lægemidlerne (tabel 4, figur 3C). I kombinationen af ​​Herceptin og 5-FU blev de hæmmende virkninger observeret i alle de cellelinjer (CI > 1, P
< 0,05) (tabel 5, figur 3d) .table 2 Beregnet værdier for kombination Indeks som en væksthæmmende effekt af kombinationsbehandling med Herceptin® og doxorubicin i gastrisk cancer cellelinjer
YBC-2
kombination Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2,93
0,54
0,98
HENDES
1201,02
0,32
0,91
DOX + HENDES
0,09
0.05
0.03
0.25
0,74
0.96
Diagnose kombineret effekt
synergi
synergi
synergi
YBC-3
kombination Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2.310
0,768
0,946
HENDES
46,063
0,623
0.970
DOX + HENDES
0,266
0,598
1,377
0,406
0,469
0,925
Diagnose kombineret effekt
synergi
synergi
antagonisme
NCI-N87
Kombination Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,070
0,398
0,864
HENDES
113.350
0,191
0,635
DOX + HENDES
0.005
0.004
0.003
0.000
0,437
0,995
Diagnose kombineret effekt
synergi
synergi
synergi
U-87 MG
kombination Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,295
0.620
0,997
HER
1845,5
0,457
0,860
DOX + HENDES
0,441
0,435
0,448
0,101
0,589
0,992
Diagnose kombineret effekt
synergi
synergi
synergi
SK-BR-3
Kombination Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,103
0,832
0,998
HENDES
1.424.000
0,046
0,435
DOX + HENDES
0,046
0,074
0,117
0,005
0,616
0,985
Diagnose kombineret effekt
synergi
synergi
synergi
DOX
, doxorubicin; HENDES
, Herceptin.
Figur 3 Kombination indekset så en væksthæmmende effekt af kombinationsbehandling med Herceptin® og anti-cancer. en. I kombinationen af ​​Herceptin og doxorubincin behandling blev observeret synergistiske virkning i YBC-2 og NCI-N87-celler, men ikke i YBC-3 cellelinie. b. I kombinationen af ​​Herceptin og cisplatin, blev der observeret de synergieffekter i SK-BR-3, NCI-N87 og YBC-3 cellelinier (CI < 1). Imidlertid blev de inhibitoriske virkninger observeret i YBC-2 og U-87 MG-cellelinier (CI > 1). c. Behandlingen af ​​Herceptin og paclitaxel, i YBC-3 og U-87 MG-cellelinier blev de inhibitoriske virkninger observeret (Cl > 1), men i YBC-3 cellelinie den synergiske virkning blev observeret (Cl < 1 ). I SK-BR-3 og NCI-87 cellelinjer, virkningerne var forskellige afhænger af den dosis af lægemidlerne. d. I kombinationen af ​​Herceptin og 5-FU blev de hæmmende virkninger observeret i alle de cellelinjer (CI > 1).
Tabel 3 Beregnede værdier for Combination Index som væksthæmmende effekt af kombinationsbehandling med Herceptin® og cisplatin i gastrisk cancer cellelinjer
YBC-2
Kombination Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50

ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
4,512
0,921
0,882
HER
1201,0
0,316
0,915
CDDP + HENDES
1,375
2,707
5,337
2,232
0,587
0,965
Diagnose kombinerede effekt
antagonisme
antagonisme
antagonisme
YBC-3
Kombination Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
30,733
2,227
0,929
HER
46,063
0,623
0.970
CDDP + HER
0,274
0,110
0,054
12,091
1,472
0,998
Diagnose kombineret effekt
synergi
synergi
synergi
NCI-N87
Kombination Indeks Værdi
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
45,86
0,53
0,93
HENDES
1.13E + 05
0,19
0,63
CDDP + HENDES
0,03
0.01
0.01
0,83
0,88
0.96
Diagnose kombineret effekt
synergi
synergi
synergi
U-87 MG
kombination Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
5,65
1,08
0,98
HENDES
1845,53
0,46
0,86
CDDP + HENDES
9.18
9,85
10,58
2,56
1.01
0.99
Diagnose kombineret effekt
antagonisme
antagonisme
antagonisme
SK-BR-3
Kombination Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r</sup></sub>