Korelácia medzi HER-2 /neu (ErbB-2), hladina expresie a terapeutický účinok kombinovanej liečby Herceptinom a chemoterapeutických činidiel v nádorových bunkových línií žalúdočných

Korelácia medzi HER-2 /neu (ErbB-2) hladiny expresie a terapeutický účinok kombinovanej liečby Herceptinom a chemoterapeutických činidiel v bunkových líniách karcinómu žalúdka
abstraktné
Úvod
Hoci rakovina žalúdka má veľa obmedzení a odpoveď rýchlosť je marginálna v chemoterapii. Nadmerná expresia ľudského epidermálneho rastového faktora receptora 2 (HER-2 /neu
) génu a jeho proteínov sú spojené so zvýšeným bunkovým delením a vysokú rýchlosť rastu nádoru a boli opísané v niekoľkých nádorových ochorení. Najmä približne 30% pacientov s rakovinou prsníka majú zvýšenú expresiu HER-2 /neu proteínu stroje a nadmerné expresie metastázovať rýchlejšie, indukuje odolnosť chemoterapia a down-regulujú funkciu receptor estrogénu. Rekombinantná humanizovaná anti-HER2 protilátka (Herceptin) inhibuje proliferáciu HER-2 /neu
nadmerne exprimujúce nádorové bunky a použitia, ktoré v kombinácii v metastatického karcinómu prsníka zvýšili cytotoxicita chemoterapeutických činidiel.
Metódy
Hodnotili sme expresie HER-2 /neu proteínu v
žalúdočnej bunkových línií pomocou FACS a potom porovnaním cytotoxicitu chemoterapeutík (doxorubicín, cisplatina, paklitaxel, 5-FU) a v kombinácii s Herceptinom v závislosti na expresiu HER-2 /neu proteínu
MTT testu. Výsledky
1. NCI-N87 (88%), karcinómu žalúdka a bunková línia SK-BR-3 (89%), rakoviny prsníka bunkové línie so silnou pozitivitou her- 2 /neu
výraz. YBC-2 (55%) a YBC-3 (48%), rakovina žalúdka bunková línia s sprostredkovaného, ​​slabá pozitivita v danom poradí. Negatívne kontrolné U-87 MG (6%), rakoviny mozgu bunkové línie boli vykazovali nízku expresiu HER-2 /neu. 2. Rast buniek sa v závislosti od dávky inhibovaný HER-2 /neu
pozitívne, kontrolné bunkové línie SK-BR-3 pôsobením Herceptin, ale neboli pozorované v HER-2 /neu
negatívne kontrolné bunkové línie U-87 MG. inhibícia účinný rast nebol pozorovaný v žalúdočných nádorových bunkových línií s jedinou liečbu Herceptin, všetky bunkové línie pozorovať inhibíciu rastu v závislosti od dávky na chemoterapeutické činidlá (doxorubicín, cisplatina, paklitaxel a 5-FU). 3. Kombinácia Herceptinu s doxorubicínom pozorovalo synergické efekty vo všetkých nádorových bunkových línií s výnimkou YBC-3, kombinácia Herceptin s cisplatinou pozorovalo NCI-N87 a SK-BR-3 a kombinácií Herceptin s paklitaxelom pozorovalo synergické efekty v YBC-2. Kombinácia Herceptinu s 5-FU pozorovalo antagonistické účinky vo všetkých nádorových bunkových línií.
Závery
V súlade s HER-2 /neu
úrovne expresie, bol pozorovaný účinok protirakovinových činidiel inak v kombinácii s Herceptin chemoterapeutiká. To naznačuje, že HER-2 /neu
hladina expresie môže byť použitý štandard výberu kombinácie liečiv v kombinácii Herceptin S chemoterapeutických činidiel v karcinómu žalúdka.
Kľúčové
HER-2 /neu (
erbB- 2) rakovina žalúdka Herceptin Kombinovaná liečba CI Úvod
od známe, že signálnych dráh rastovým faktorom a jeho receptor hrajú impotentný úlohu v procese karcinogénne mnohé štúdie sú vykonávané. HER-2 /neu
(ErbB-2) proteín, glykoproteín bunkovej membrány, je receptor rastového faktoru má aktivitu receptora tyrozínkinázy [1]. HER2 bola často zistená v celej rade ľudských nádorov. Sekrécia normálne bunky spojené s HER-2 /neu proteín, ale zničenie normálnych bunkách dohľadom spôsobuje nadmernú expresiu proteínu, zvyšuje rýchlosť bunkového delenia a rastu indukovať prekancerózne zmeny [2].
HER-2 /neu
( ErbB-2) gén, ktorý je umiestnený na ľudskom chromozóme 17q21 [3], ktorý má čiastočnú homológie s receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR) [4, 5]. EGF (epidermálny rastový faktor), rodina receptorov má aktivitu receptora tyrozínkinázy a pozostával z EGF receptor, c-ErbB-2, c-ErbB-3 a c-ErbB-4 [6-8]. HER-2 /neu onkoproteínov, kóduje membránový glykoproteín p185kD, receptor, ktorý sa podieľa na raste a diffentiation nádorových buniek a 25 ~ 30% nadmerne exprimované v prsníku, vaječníkov a karcinómov žalúdka [9-12] a prognózou pacienti je zlá [13-15].
že nadmerná expresia HER-2 neu
génu /a je to proteín sú spojené prognózu a terapiu [16-18] a expresie s karcinómom prsníka pacienta HER-2 /neu
je silne potrebný pre rast nádorov [19]. Tie, naznačujú, že HER-2 /neu
podieľa na vzniku rakoviny prsníka, progresie a malígne a HER-2 /neu
nadmernej expresie je dôležitejšie ako receptorov hormónov na pacientov s lymfatických uzlín [9]. Preto sa tieto terapeutické ciele HER-2 /neu
proteínových liekov, rekombinantná humanizovaná anti-HER-2 /neu protilátky
- Herceptinu, ktoré sú účinné pri liečbe rakoviny prsníka bola označená [20]
žalúdka. rakovina je najčastejšou rakovinou v Číne. Výskyt rakoviny žalúdka je niekoľkostupňový proces karcinogénne s rôznymi genetickými mutáciami. HER-2 stav je v korelácii s hĺbkou invázie, TNM štádiu, lymfatické uzliny a vzdialené metastázy karcinómu žalúdka [21]. HER-2 /neu nadmerná expresia je spojená so zlou prognózou rakoviny žalúdka, ale má mierny účinok na prežitie u rakoviny žalúdka ako nezávislý faktor prognóza [22]. Herceptin® ako cytostatiká, mono terapia účinné protirakovinových účinkov nemožno očakávať, ale veľa výskumu je v plnom prúde pre kombinovanú terapiu s inými protirakovinovými liekmi alebo biologickými látkami. Avšak, stále ešte nie je presne štúdie kombinovanej liečby Herceptinu s protirakovinovými liekmi v žalúdku bunkové línie [13]. Preto sa v tejto štúdii skúmame efektívnu kombináciu Herceptin (Trastuzumab, Genentech Inc., CA, USA) [23-25], zacielenie pre HER-2 /neu onkoproteínov
s liekmi proti rakovine žalúdka v rakovinových bunkových línií , v závislosti na HER-2 /neu onkoproteínov
výraz.
materiály a metódy Bunky
karcinómu žalúdka bunkových línií boli použité YBC-2, 3-YBC a NCI-N 87 bunkové línie. Tieto bunkové línie YBC-2 a YBC-3 boli stanovené od intraperitoneálnej karcinómom žalúdka oddelením patológie, Yanbian univerzity. 87. bunková línia NCI-N bola založená v Spojených štátu podľa NCI (National Cancer Institute, CRL5822, USA). U-87 MG (ATCC, HTB14) mozgový nádor a bunková línia SK-BR-3 (ATCC, HTB30) rakoviny prsníka bunkové línie boli použité pre HER-2 /neu proteín
expresie pozitívne a negatívne kontroly, v danom poradí.
Tieto bunkové línie boli kultivované použitie minimálne nevyhnutné média (MEM, Ginco BRL, Grand Island, NY, USA), ktorý je obsahujúci inaktivuje (pri teplote 56 ° C počas 30 minút), 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS, Ginco BRL, Grand Island , NY, USA), 100 jednotiek /ml penicilínu a 0,1 mg /ml streptomycínu. Všetky inkubácie kultúry boli vykonané vo zvlhčenej 37 ° C, 5% CO <sub>2 inkubátora.
Liekov
Herceptin, Humanoid rekombinantný HER-2 /neu protilátky, bolo z USA (trastuzumabu, 440 mg /20 ml , Genentech Inc., San Francisco, CA, USA), a uznávané protinádorové látky, účinok u karcinómu žalúdka, adriamycín (doxorubicín, 10 mg /5 ml), cisplatina (cisplatina, 10 mg /fľaštička), Taxol (Paclitaxel, 30 mg /fľaštička) a 5-FU (5-Flourouracil, 250 mg /5 ml), boli z Číny. Pri experimente každej liečivo bol použitý zriedil v médiu na bunkovú kultiváciu.
FACS analýzy (HER-2 expresie /neu proteín)
HER-2 /neu
(ErbB-2) onkoproteínov expresie bolo vykonané pomocou fluorescencie aktivovanej triedenia buniek (FACS, Becton Dickinson, USA) vykonáva imunofenotypizace v bunkovom povrchu. Kultúra bunky (1 x 10 <sup>6) boli zozbierané po liečbe s trypsín-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) a inkubované s primárnou protilátkou, anti-HER-2 /neu
protilátky (monoklonálne myšou protilátka, LAB VISION, CA, USA), v riedení 1: 200 a 50 ul po dobu 1 hodiny pri 4 ° C. Zafarbené bunky boli dvakrát premyté studeným PBS. Farbenie a premývanie boli vykonávané v PBS (roztok s fosfátovým pufrom, pH 7,6 Ca ++ Mg ++ zadarmo, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 2% FBS. Po premytí dvakrát sekundárne FITC-anti-myšou protilátky (anti-myší protilátka konjugovaná s FITC, Novocastra, USA) bola použitá v riedení 1:40, a 50 ul sa inkubujú po dobu 40 min pri 4 ° C, načo sa dvakrát premyje za studena PBS. Po dokončení farbenie, riešenie filtrácie bunka bola použitá 40 um nylon mesh získať jedinú bunku plavenín a robí analýzu v Libereckom kraji.
MTT testom FACS (in vitro Herceptin a chemoterapeutiká citlivosť testu v žalúdočných rakovinových bunkových línií)
MTT test bol použitý pre in vitro
teste citlivosti liečivá v žalúdku nádorových bunkových línií. Farbivo MTT [3- (4,5-dimetyl-thiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromid] sa redukuje na formazánu (tmavofialová vode nerozpustné zlúčeniny) podľa sukcinát dehydrogenázy systému aktívne mitochondrií, a tým, používa predovšetkým na optickú hustotu (OD) každej jamky bola meraná v enzýmu-linked ImmunoSorbent assay (ELISA), čítačky Sunrise (Tecan) pri 560 nm. OD koreluje lineárne s počtom životaschopných buniek. Bunky boli nanesené v 180 ul média z 1 x 10 4 buniek na jamku v 96-jamkové multi-jamkové doštičky a inkubované po dobu 24 hodín pri teplote 37 ° C a 5% CO 2.
U jedného lieku skúška citlivosti, boli použité dva spôsoby. Po prvé, Herceptin (4,625, 9,25, 18,5, 37 uM), doxorubicín (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 uM), cisplatina (0,166, 1,666, 16,66, 166,6 uM), paclitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 uM) a 5-FU (38,43, 384,37, 3843,78, 38437,8 uM) boli zriedené v 20 ul média a pridané k doštičkám a inkubované počas 4 dní. Kontrolná skupina bola pridaná iba tie médiá, bez liekov a inkubovaných rovnakým trvania. Druhý synergický efekt kombinovanej terapie s kombináciou Herceptin + doxorubicín, Herceptin + cisplatina Herceptin + paklitaxelom a Herceptin + 5 FU.
Keď kombinovaná liečba Herceptinom a každá skúška vykonaná citlivosti liek proti rakovine, fixné molárna percento koncentrácie z oboch liekov, po potom sa pridá 50 ul MTT, MTT bol rozpustený vo fosfátovom pufri na koncentráciu 2 mg /ml, pridá sa do každej jamky a inkubuje sa 4 hodiny viac. Po odstránení supernatantu, ktoré 150 ul DMSO (dimetylsulfoxid, Sigma, USA) do každej jamky a jemným pretrepaním asi 15 minút, aby sa rozpustil generovaný formazánu. Optická hustota (OD) každej jamky bola meraná v enzyme-linked ImmunoSorbent assay (ELISA), čítačkou pri 562 a 720 nm. Prežitie malígnych buniek bola vypočítaná z rovnice (OD liečivá dobre OD prázdne jamky /priemerná OD kontrolnej jamky - OD prázdne jamky) x 100%. MTT test bol vykonaný a trikrát opakuje pre každú dávku lieku (5 i) výsledky boli analyzované, aby sa získala priemerná.
Výpočet hodnoty CI po kombinovanej liečbe
CI (kombinačného indexu) bola získaná vzorcom chou-Talalay, bola vypočítaná z hodnoty IC50 (DM) porovnávala účinnosť a krivky kapacity (m hodnota). Klasický vzorec isobologramu (CI = 1), je nasledujúci. CI =
D
1
/
Dx 1
+
D
2
/
Dx 2
Menovateľ (DX) 1 a (DX) 2 boli indikujú percentuálne cytotoxicitu pri liečbe samotným jedinou drogou; čitateľ (D) 1 a (D) 2 sa označujú percento cytotoxicity pri liečbe oboma liekmi. Dx =
Dm fa /
1
-
fa 1
m
Dm je medián-účinok dávka (IC 50), toto vypočíta podľa medián-účinok pozemku X-zachytiť z antilog. X
=
prihlásiť D
proti Y
=
log f
a
/
1
-
f
a
m je sklon medián-účinok pozemku. Viacnásobná analýza účinok liečiva s použitím CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK), boli vypočítané hodnoty m, dm, DX a CI. (DX) 1 a (DX) 2 boli vypočítané s použitím medián-účinok formula Chou-Talalay. CI < 1, CI = 1, CI > 1 boli volány synergizmus, zhrnutie a antagonizmus účinkov, respektíve
Štatistické vyhodnotenie
štatistickej analýzy dát boli vykonané pomocou dvojchvostý Student t-test
(SPSS softvér 13,0; SPSS, Chicago, IL). , p
hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné. Analýza rozptylu (ANOVA) bol použitý pre viacnásobné porovnávania skupín na určenie potenciálne protinádorové účinky medzi skupinami.
Výsledky
HER-2 /neu expresie v žalúdočných nádorových bunkových línií pomocou FACS
expresie HER2 /neu proteín bol analyzovaný v troch rôznych rakovina žalúdka bunkových líniách (YBC-2, 3-YBC a NCI-N87). Expresia tohto proteinis 48% (slabé), 55% (stredná) a 88% (silný) v YBC-2, YBC-3 a NCI-N87, resp. Expresia tohto proteínu bola v pozitívnom karcinómom prsníka bunkové línie SK-BR-3 89% a 6% v negatívnej nádor na mozgu bunkové línie U-87 MG (obrázok 1). Obrázok 1 HER-2 /neu expresie v žalúdočných nádorových bunkových línií. Expresia HER2 /neu proteínu vo všetkých bunkových líniách rakovinových boli merané pomocou fluorescenčne aktivovanej triedenia buniek analýzou. HER2 /neu expresie v troch žalúdočných nádorových bunkových línií (YBC-2, 3-YBC a NCI-N87) bolo 48% (slabé), 55% (stredná) a 88% (silný), v danom poradí. Všetky skupiny izotypovo kontroly boli nie viac ako 0,5% (dáta nie sú ukázal). Ako pozitívna kontrola, SK-BR-3 HER2 /neu expresie je 89%. U-87 MG vykazovali zníženú expresiu HER2 /neu (6%) ako negetive kontrolou.
Citlivosť žalúdočné rakovina bunkové línie k Herceptinu a protirakovinového liečiva a analýzy citlivosti na jedinom protidrogovej liečby in vitro
v jednom použití Herceptinu je zastavenie rastu buniek bol slabý a IC 50 nebola detekovateľná v in vitro s rakovinou žalúdka bunkové línie (obrázok 2). Na rozdiel od toho štyri rôzne lieky proti rakovine (doxorubincin, cisplatina, paklitaxel a 5-FU) ukázala na dávke závislú inhibíciu bunkového rastu a IC bolo zistené 50 (tabuľka 1, obrázok 2). Obrázok 2 chemosensitivity z HERCEPTINU® a štyri liekov proti rakovine žalúdka nádorových bunkových línií. Pri jednorazové použitie Herceptinu je zastavenie rastu buniek bol slabý a IC50 nebola detegovať in vitro s rakovinou žalúdka bunkové línie. Na rozdiel od toho štyri rôzne lieky proti rakovine (doxorubincin, cisplatina, paklitaxel a 5-FU) ukázala na dávke závislú inhibíciu bunkového rastu a IC 50 bola detekovaná.
Tabuľka 1 IC30 a IC50 piatich protirakovinové činidlá proti YBC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG a SK-BR-3 bunkových línií
protirakovinové látky
bunkových líniách (IC30) um
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
Protirakovinové látky
bunkové línie (IC 50) um
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
Účinok kombinácie Herceptin a lieky proti rakovine
v kombinácii Herceptin a doxorubincin spracovanie sa synergický účinok bol pozorovaný u YBC-2 a NCI-N87 buniek, ale nie v YBC-3 bunkovú líniou, ktorá má slabý expresia HER2 /neu
proteínu (tabuľka 2, obrázok 3a, P
menšie ako 0,05). V kombinácii Herceptin a cisplatiny, že synergické efekty boli pozorované u SK-BR-3, NCI-N87 a YBC-3 bunkových línií (CI < 1, str Hotel &0,05). Avšak, inhibičné účinky boli pozorované v YBC-2 a U-87 MG bunkových línií (kombinácia indexovať > 1, P Hotel &0,05) (Tabuľka 3, Obrázok 3b). Liečba Herceptin a paklitaxelu, vo YBC-3 a U-87 bunkových línií mg, boli pozorované inhibičné účinky (CI > 1), ale v YBC-3 bunkové línie, bol pozorovaný synergický efekt (CI < 1 , P Hotel &0,05). V SK-BR-3 a NCI-87 bunkových línií, účinky sa líšia, závisí od dávky liečiv (tabuľka 4, obrázok 3C). V kombinácii Herceptin a 5-FU, inhibičné účinky boli pozorované u všetkých bunkových línií (CI > 1, P Hotel &0,05) (tabuľka 5, obrázok 3d) .Table 2 Vypočítané hodnoty pre kombinácie index ako efekt rast inhibičný kombinačné liečby s HERCEPTINU® a doxorubicín v bunkových líniách rakoviny žalúdka
YBC-2
kombinácia hodnota indexu
parametra (um)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2,93
0,54
0,98
HER
1201,02
0,32
0,91
DOX + HER
0,09
0,05
0,03 0,25

0,74
0,96
Diagnóza kombinovaný účinok
synergia
synergia
synergie
YBC-3
Kombinácia hodnota indexu
parametrov (um)
Drug
ED 50
ED75 ED90
Dm
m
r
DOX
2.310
0,768 0,946
HER
46.063
0,623 0,970
DOX + HER
0,266 0,598
1,377 0,406
0,469 0,925
Diagnóza kombinovaný účinok
synergia
synergia
antagonizmus
NCI-N87
Kombinácia hodnota indexu
parametrov (um)
Drug
ED50 ED75
ED90
Dm
m r

DOX
0,070 0,398
0,864
HER
113.350
0,191 0,635
DOX + HER
0,005
0,004 0,003

0,000 0,437
0,995
Diagnóza kombinovaný účinok
synergia
synergia
synergie
U-87 MG
Kombinácia hodnota indexu
parametrov (um)
Drug
ED50
ED75 ED90
Dm
m
r
DOX
0,295
0,620 0,997
HER
1845,5
0,457 0,860
DOX + HER
0,441 0,435
0,448 0,101
0,589 0,992
Diagnóza kombinovaný účinok
synergia
synergia
synergie
SK-BR-3
Kombinácia hodnota indexu
parametrov (um)
Drug
ED50 ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,103 0,832
0,998
HER
1424000
0,046 0,435
DOX + HER
0,046
0,074 0,117
0,005 0,616
0,985
Diagnóza kombinovaný účinok
synergia
synergia
synergia
DOX
, doxorubicín; HER
, Herceptin.
Obrázok 3 kombinačného indexu ako účinkom inhibujú rast kombinačné liečby s HERCEPTINU® a protirakovinové činidlá. a. V kombinácii Herceptin a doxorubincin spracovanie sa synergický účinok bol pozorovaný v YBC-2 a NCI-N87 buniek, ale nie v YBC-3 bunkové línie. b. V kombinácii Herceptin a cisplatiny, že synergické efekty boli pozorované u SK-BR-3, NCI-N87 a YBC-3 bunkových línií (CI < 1). Avšak, inhibičné účinky boli pozorované v YBC-2 a U-87 MG bunkových línií (CI > 1). c. Liečba Herceptin a paklitaxelu, vo YBC-3 a U-87 bunkových línií mg, boli pozorované inhibičné účinky (CI > 1), ale v YBC-3 bunkové línie, bol pozorovaný synergický efekt (CI < 1 ). V SK-BR-3 a NCI-87 bunkových línií, účinky sa líšia, závisí od dávky liekov. d. V kombinácii Herceptin a 5-FU, inhibičné účinky boli pozorované u všetkých bunkových línií (CI > 1). Tabuľka 3
Vypočítané hodnoty pre kombinačného indexu ako účinkom inhibujú rast kombinačné liečby s HERCEPTINU® a cisplatinou u karcinómu žalúdka bunkové línie
YBC-2
Kombinačné hodnota indexu
parameter (um)
Drug
ED50

ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
4.512
0,921 0,882

HER
1201,0
0,316 0,915
CDDP + HER
1,375 2,707
5,337 2,232
0,587 0,965
Diagnosis kombinovaný účinok
antagonizmus
antagonizmus
antagonizmus
YBC-3
Kombinácia hodnota indexu
parametrov (um)
Drug
ED50 ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
30.733
2,227 0,929
HER
46.063
0,623 0,970
CDDP + HER
0,274 0,110
0,054
12,091
1,472 0,998
Diagnóza kombinovaný účinok
synergia
synergia
synergie
NCI-N87
kombinácia hodnota indexu
parametrov (um)
Drug
ED50
ED75 ED90
Dm
m
r
CDDP
45.86
0,53
0,93
HER
1.13 + 05
0,19
0,63
CDDP + HER
0,03
0,01
0,01
0,83
0,88
0,96
Diagnóza kombinovaný účinok
synergia
synergia
synergie
U-87 MG
Kombinácia hodnota indexu
parametrov (um)
Drug
ED50
ED75 ED90
Dm
m
r
CDDP
5,65
1,08
0,98
HER
1845,53
0,46
0,86
CDDP + HER
9,18
9,85
10,58
2,56
1,01
0,99
Diagnóza kombinovaný účinok
antagonizmus
antagonizmus
antagonizmus
SK-BR-3
Kombinácia hodnota indexu
parametrov (um)
Drug
ED50 ED75
ED90
Dm
m
r</sup></sub>