Correlazione tra HER-2 /neu (2-erbB) livello di espressione e l'effetto terapeutico del trattamento di combinazione con Herceptin e agenti chemioterapici in linee cellulari di cancro gastrico

Correlazione tra HER-2 /neu (erbB-2) livello di espressione e l'effetto terapeutico del trattamento di combinazione con Herceptin e agenti chemioterapici in linee cellulari di cancro gastrico
Abstract
Introduzione
Anche se il cancro gastrico avanzato ha molti limiti e risposta tasso è marginale in chemioterapia. Sovraespressione del fattore di crescita epidermico umano del recettore 2 (HER-2 /neu
) gene e la sua proteina sono associati a una maggiore divisione cellulare e un alto tasso di crescita del tumore e sono stati segnalati in diversi tumori maligni. In particolare, circa il 30% dei pazienti con cancro mammario hanno iperespressione di HER-2 /neu
proteine ​​e la sovraespressione metastatizzare più veloce, induce la resistenza della chemioterapia e la funzione del recettore per gli estrogeni down-regolare. Ricombinante umanizzato contro HER2-anticorpo (Herceptin) inibisce la proliferazione di HER-2 /neu
cellule tumorali che iperesprimono e l'uso di tale in combinazione nel carcinoma mammario metastatico hanno aumentato citotossicità di agenti chemioterapici.
Metodi
abbiamo valutato l'espressione di HER-2 /neu
proteine ​​in linee cellulari gastrico per FACS e poi confrontando la citotossicità in chemioterapici (doxorubicina, cisplatino, paclitaxel, 5-FU) solo e in combinazione con Herceptin secondo l'espressione di HER-2 /neu
proteina mediante saggio MTT.
risultati
1. NCI-N87 (88%) linea gastrico delle cellule tumorali e SK-BR-3 (89%) linea di cellule di cancro al seno con una forte positività di Herman 2 /neu
espressione. YBC-2 (55%) e YBC-3 (48%) linea di cellule cancro gastrico con intermediati, positività deboli rispettivamente. Controllo negativo U-87 mg (6%) linea di cellule di cancro al cervello hanno mostrato una bassa espressione di HER-2 /neu. 2. la crescita delle cellule era dose-dipendente inibito in HER-2 /neu
positivo, linea cellulare di controllo SK-BR-3 per il trattamento con Herceptin, ma non osservato negli HER-2 /neu
linea di cellule di controllo negativo U-87 MG. inibizione della crescita efficace non è stata osservata in linee cellulari di cancro gastrico con singolo trattamento di Herceptin, tutte le linee cellulari hanno osservato l'inibizione della crescita dose-dipendente di agenti chemioterapici (doxorubicina, cisplatino, paclitaxel e 5-FU). 3. La combinazione di Herceptin con doxorubicina osservati effetti sinergici in tutte le linee cellulari di cancro tranne YBC-3, la combinazione di Herceptin con cisplatino osservato NCI-N87 e SK-BR-3 e la combinazione di Herceptin con paclitaxel osservati effetti sinergici in YBC-2. La combinazione di Herceptin con 5-FU osservati effetti antagonistici in tutte le linee di cellule di cancro.
Conclusioni
Secondo HER-2 /neu
livello di espressione, effetto di agenti anti-cancro è stato osservato in modo diverso in combinazione di Herceptin con agenti chemioterapici. Ciò suggerisce che HER-2 /neu
livello di espressione può essere applicato livello di selezione combinazione di farmaci in combinazione di Herceptin con agenti chemioterapici nel cancro gastrico.
Parole
HER-2 /neu
(erbB- 2) il trattamento del cancro gastrico HERCEPTIN Combinazione CI Introduzione
dal noto che le vie di trasduzione del segnale da parte del fattore di crescita e del suo recettore gioca un ruolo impotenti nel processo cancerogeno molti studi sono stati condotti. La proteina HER-2 /neu
(erbB-2), glicoproteina di membrana cellulare, è un recettore del fattore di crescita ha l'attività della tirosin-chinasi del recettore [1]. HER2 è stato spesso rilevato in una vasta gamma di tumori umani. la secrezione delle cellule normali associato proteina HER-2 /neu, ma la distruzione delle cellule normali di controllo provocando iperespressione della proteina, aumenta il tasso di divisione cellulare e la crescita indurre cambiamenti precancerosi [2].
Il HER-2 /neu
( erbB-2) gene che si trova sul cromosoma umano 17q21 [3], che ha parziale omologia con il fattore di crescita epidermico (EGFR) [4, 5]. EGF (fattore di crescita epidermico) famiglia dei recettori ha l'attività del recettore tirosin-chinasi e consisteva di recettore EGF, c-erbB-2, c-erbB-3 e c-erbB-4 [6-8]. Il HER-2 /neu oncoprotein, codifica per una glicoproteina di membrana p185kD, recettore che è coinvolto nella crescita e diffentiation delle cellule tumorali e il 25 ~ 30% sovraespresso in seno, alle ovaie e carcinomi gastrici [9-12] e la prognosi di questi pazienti è scarsa [13-15]
. sovraespressione di HER-2 /neu
gene e della proteina sono associati la prognosi e la terapia [16-18] e l'espressione del paziente di cancro al seno HER-2 /neu
è fortemente richiesto per la crescita tumorale [19]. Coloro suggeriscono che HER-2 /neu
coinvolto nella comparsa del cancro al seno, la progressione e maligna e HER-2 /neu
sovraespressione è più importante di recettori ormonali sui pazienti con metastasi linfonodali [9]. Pertanto, questi bersagli terapeutici HER-2 /neu
farmaci proteici, ricombinante umanizzato anti-HER-2 /neu
anticorpo - Herceptin, efficaci nel trattamento del cancro al seno è stato riportato [20]
gastrica. il cancro è il tumore più diffuso in Cina. L'insorgenza di cancro gastrico è il processo cancerogeno più fasi con varietà mutazioni genetiche. HER-2 stato è correlata con la profondità di invasione, stadio TNM, linfonodi e metastasi a distanza di cancro gastrico [21]. HER-2 /neu sovraespressione è relativa a prognosi infausta del cancro gastrico ma ha un modesto effetto sulla sopravvivenza nel cancro gastrico come fattore prognosi indipendente [22]. Herceptin come agente citostatico, la terapia mono efficiente di effetti antitumorali non può essere previsto, ma un sacco di ricerca è in corso per la terapia di combinazione con altri farmaci antitumorali o agenti biologici. Tuttavia, ancora non in modo accurato lo studio della terapia di combinazione di Herceptin con farmaci antitumorali in linee cellulari gastrica [13]. Pertanto, in questo studio indaghiamo l'efficace combinazione di Herceptin (Trastuzumab, Genentech Inc, CA, USA) [23-25], il targeting per HER-2 /neu
oncoprotein, con farmaci anti-cancro in linee cellulari di cancro gastrico , a seconda del HER-2 /neu
oncoprotein espressione.
Materiali e metodi
cellule
linee cellulari di cancro gastrico sono stati utilizzati linee 87 cellule YBC-2, YBC-3 e NCI-N. Le linee di cellule YBC-2 e YBC-3 sono state stabilite da carcinoma gastrico metastatico intraperitoneale dal Dipartimento di Patologia, Università di Yanbian. La linea 87 di cellule NCI-N è stata fondata negli Stati Stato da NCI (National Cancer Institute, CRL5822, Stati Uniti d'America). L'U-87 MG (ATCC, HTB14) linea di cellule tumorali del cervello e SK-BR-3 (ATCC, HTB30) linea di cellule di cancro al seno sono stati utilizzati per HER-2 /neu
espressione della proteina di controllo positivo e negativo, rispettivamente.
Queste linee cellulari sono stati minimo l'uso colto supporto essenziale (MEM, GINCO BRL, Grand Island, NY, USA), che è contenenti inattivato (a 56 ° C per 30 minuti) di siero 10% fetale bovino (FBS, GINCO BRL, Grand Island , NY, USA), 100 unità /ml penicillina e 0,1 mg /ml di streptomicina. Tutte le incubazioni cultura sono stati eseguiti in un umidificata 37 ° C, 5% di CO <sub>2 incubatore.
Droga
Herceptin, ricombinante Humanoid HER-2 /neu anticorpi, era da Stati Uniti d'America (Trastuzumab, 440 mg /20 ml , Genentech Inc., San Francisco, CA, USA), e farmaci antitumorali riconosciute, effetto di cancro gastrico, Adriamicina (doxorubicina, 10 mg /5 ml), cisplatino (cisplatino 10 mg /flacone), Taxol (paclitaxel, 30 mg /flacone) e 5-FU (5-Flourouracil, 250 mg /5 ml) erano dalla Cina. Quando si fa esperimento ciascun farmaco è stato utilizzato diluito in mezzi di coltura cellulare.
FACS analisi (HER-2 /neu proteine)
HER-2 /neu
(erbB-2) espressione oncoprotein è stato fatto utilizzando Fluorescence- cellulare attivato Sorter (FACS, Becton Dickinson, USA) eseguita immunofenotipizzazione in superficie delle cellule. cellule di coltura (1 × 10 <sup>6) sono state raccolte dopo il trattamento con tripsina-EDTA (GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA) e incubate con l'anticorpo primario, anti-HER-2 /neu
anticorpo (monoclonale di topo anticorpo, Lab Vision, CA, USA), in una diluizione 1: 200 e 50 ml per 1 ora a 4 ° C. cellule colorate sono state lavate due volte con PBS freddo. La colorazione e lavaggio sono state eseguite in PBS (soluzione di fosfato-buffer, pH 7,6 Ca ++ Mg ++ gratis, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 2% FBS. Dopo aver lavato due volte un anticorpo FITC-antitopo secondario (anticorpo anti-topo FITC-coniugato, Novocastra, USA) è stato utilizzato in una diluizione 1:40 e 50 microlitri sono state incubate per 40 minuti a 4 ° C, poi lavato due volte con fredda PBS. Dopo aver completato la colorazione, soluzione di cellule di filtrazione sono stati utilizzati 40 um rete di nylon ottenere la singola cellula sostanze in sospensione e l'analisi facendo in.
Saggio MTT FACS (in vitro Herceptin e agenti chemioterapici test di sensibilità in linee cellulari di cancro gastrico)
Il saggio MTT è stato utilizzato per in vitro
farmaco test di sensibilità in linee cellulari di cancro gastrico. MTT dye [3- (4,5-dimetil tiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromide] è ridotto a formazano (scuro viola acqua composto insolubile) dal sistema succinato deidrogenasi dei mitocondri attiva, e quindi, utilizzate in modo specifico per la densità ottica (OD) dei pozzi è stata misurata in un saggio immunoenzimatico (ELISA) lettore enzyme-linked Alba (TECAN) a 560 nm. La OD correlata linearmente con il numero di cellule vitali. Le cellule sono state piastrate a 180 supporti ul di 1 × 10 4 cellule per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti a più pozzetti e incubate per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
Per singolo farmaco test di sensibilità, sono stati applicati due metodi. In primo luogo, Herceptin (4.625, 9.25, 18.5, 37 micron), doxorubicina (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 micron), cisplatino (0,166, 1,666, 16.66, 166,6 micron), paclitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 micron) e 5-FU (38.43, 384,37, 3843,78, 38437,8 pM) sono stati diluiti in 20 microlitri mezzi ed aggiunto alle piastre e incubate per 4 giorni. gruppo di controllo sono stati aggiunti solo i media, senza la droga e lo stesso durate incubate. In secondo luogo, l'effetto sinergico della terapia di combinazione con una combinazione di Herceptin + doxorubicina, Herceptin + Cisplatino, Herceptin + Paclitaxel e trastuzumab + 5-FU.
Quando il trattamento di combinazione con Herceptin e ogni test sulla sensibilità svolta farmaco antitumorale, fissate percentuale concentrazione molare di entrambi i farmaci, dopo quindi aggiungendo 50 microlitri MTT, MTT è stato sciolto in tampone fosfato alla concentrazione di 2 mg /ml, aggiunto a ciascun pozzetto e incubate 4 ore in più. Dopo aver rimosso il surnatante, posto 150 microlitri DMSO (Dimetilsolfossido, Sigma, USA) in ciascun pozzetto e agitatore circa 15 minuti per sciogliere il formazano generato. La densità ottica (OD) dei pozzetti è stata misurata in un lettore enzimatico test immunoenzimatico (ELISA) a 562 e 720 nm. La sopravvivenza delle cellule maligne è stata calcolata mediante l'equazione (OD di farmaco ben OD del pozzetto del bianco /medio OD del controllo ben - OD del pozzo vuoto) × 100%. saggio MTT è stato eseguito e ripetuto tre volte per ogni dose del farmaco (5 e) i risultati sono stati analizzati per ottenere la media.
calcolo del valore CI dopo terapia di combinazione
CI (indice Combination) è stato ottenuto dalla formula di Chou-Talalay, è stata calcolata dal valore di IC50 (Dm) confrontato l'efficacia e curva di capacità (il valore m). formula classica del Isobologram (CI = 1) è la seguente. CI =
D
1
/
Dx 1
+
D
2
/
Dx 2
denominatore di (DX) 1 e (Dx) 2 erano indicare la percentuale di citotossicità quando trattati con la sola singolo farmaco; numeratore della (D) 1 e (D) 2 erano indica la percentuale di citotossicità quando trattati con entrambi i farmaci. Dx =
Dm fa /
1
-
fa 1
m Dm è la dose media-effetto (IC50), questa calcolato da mediano-effetto trama del X intercetta dalla antilog. X
=
log D
rispetto Y
=
log f

a /
1
-
f

a m è la pendenza del grafico mediana-effetto. Diverse analisi degli effetti della droga usando Calcusyn (Biosoft, Cambridge, UK), sono stati calcolati i valori di m, Dm, Dx, e CI. (Dx) 1 e (Dx) 2 sono stati calcolati utilizzando la mediana-effetto formula Chou-Talalay. CI < 1, CI = 1, CI > 1 sono stati chiamati sinergismo, sommatoria, e gli effetti antagonismo rispettivamente analizza valutazione
statistica
statistica dei dati è stata effettuata utilizzando il Student a due code t
-test (SPSS 13.0 software; SPSS, Chicago, IL). . p
valori inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. L'analisi della varianza (ANOVA) è stato utilizzato per confronti multipli di gruppo per determinare i potenziali effetti antitumorali tra i gruppi.
Risultati
HER-2 /neu espressione in linee cellulari di cancro gastrico di FACS
L'espressione di HER2 /neu proteina è stata analizzata in tre diverse linee di cellule di cancro allo stomaco (YBC-2, YBC-3 e NCI-N87). L'espressione di questo proteinis 48% (debole), il 55% (media) e 88% (forte) in YBC-2, YBC-3 e NCI-N87, rispettivamente. L'espressione di questa proteina era 89% in positivo linea cellulare di tumore al seno SK-BR-3, e il 6% in negativo linea cellulare tumore cerebrale U-87 MG (Figura 1). Figura 1 HER-2 /neu espressione in linee cellulari di cancro gastrico. L'espressione della proteina HER2 /neu in tutte le linee cellulari di tumore sono stati misurati mediante analisi classificare cellule fluorescenza attivato. L'espressione di HER2 /neu in tre linee di cellule di cancro gastrico (YBC-2, YBC-3 e NCI-N87) erano il 48% (debole), il 55% (media) e 88% (forte), rispettivamente. Tutti i gruppi di controllo isotipico non erano più dello 0,5% (dati non mostrato). Come il controllo positivo, SK-BR-3 di espressione HER2 /neu è 89%. U-87 mg ha mostrato minore espressione di HER2 /neu (6%), come il controllo negetive.
La sensibilità della linea di cellule di cancro dello stomaco di Herceptin e farmaco anti-cancro e l'analisi di sensibilità al trattamento singolo farmaco in vitro
in uso singolo di Herceptin, l'arresto della crescita cellulare era debole e IC 50 non era rilevabile in vitro con linee cellulari di cancro allo stomaco (Figura 2). Al contrario, i quattro diversi farmaci anti-cancro (doxorubincin, cisplatino, paclitaxel e 5-FU) ha mostrato una inibizione dose-dipendente della crescita cellulare e IC 50 è stato rilevato (Tabella 1, Figura 2). Figura 2 chemiosensibilità di Herceptin e quattro farmaci anti-cancro in linee cellulari di cancro gastrico. In uso singolo di Herceptin, l'arresto della crescita cellulare era debole e IC50 non era rilevabile in vitro con linee cellulari di cancro allo stomaco. Al contrario, i quattro diversi farmaci anti-cancro (doxorubincin, cisplatino, paclitaxel e 5-FU) ha mostrato una inibizione dose-dipendente della crescita cellulare e IC50 è stato rilevato.
Table 1 IC30 e IC50 di cinque agenti anti-cancro contro YBC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG e SK-BR-3 linee cellulari
agenti antitumorali
linee cellulari (IC30) mM
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
agenti antitumorali
linee cellulari (IC 50) micron
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
L'effetto della combinazione di Herceptin e farmaci anti-cancro
Nella combinazione di Herceptin e doxorubincin trattamento, l'effetto sinergico è stato osservato in YBC-2 e cellule NCI-N87, ma non in linea cellulare YBC-3 che ha debole espressione di HER2 /neu
proteine ​​(tabella 2, figura 3a, P
< 0,05). Nella combinazione di Herceptin e cisplatino, gli effetti sinergici sono stati osservati in linee cellulari YBC-3 SK-BR-3, NCI-N87 e (CI < 1, P
< 0,05). Tuttavia, sono stati osservati gli effetti inibitori in YBC-2 e le linee U-87 mg di cellule (Indice di combinazione > 1, P
< 0,05) (Tabella 3, figura 3b). Il trattamento di Herceptin e paclitaxel, in YBC-3 e-87 U linee cellulari MG, sono stati osservati gli effetti inibitori (CI > 1), tuttavia, in linea di cellule YBC-3, è stato osservato l'effetto sinergico (CI < 1 , P
< 0,05). Nelle linee SK-BR-3 e NSC-87 cellule, gli effetti erano diversi dipende dalla dose di farmaci (Tabella 4, Figura 3c). Nella combinazione di Herceptin e 5-FU, gli effetti inibitori sono stati osservati in tutte le linee cellulari (CI > 1, P
< 0,05) (Tabella 5, figura 3d) .table 2 valori calcolati per la combinazione Indice come effetto la crescita inibitorio di trattamento di combinazione con Herceptin e doxorubicina in linee cellulari di cancro gastrico
YBC-2
combinazione Value Index
parametri (micron)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2.93
0.54
0.98
HER 1.201,02
0,32
0.91
DOX + HER
0,09
0.05
0.03
0.25
0.74
0.96
Diagnosi effetto combinato
sinergia
sinergia
sinergia
YBC-3
combinazione Value Index
parametri (micron)
Drug
ED50 ED75

ED90
Dm
m r
DOX
2.310
0,768 0,946

HER
46,063
0,623 0,970

DOX + HER
0,266 0,598

1.377
0,406 0,469

0,925
Diagnosi effetto combinato
sinergia
sinergia
antagonismo
NCI-N87
combinazione Value Index
parametri (micron)
Drug
ED50 ED75

ED90
Dm
m r
DOX
0,070 0,398

0.864
HER
113350
0,191 0,635

DOX + HER
0.005
0,004 0,003

0.000
0,437 0,995

diagnosi combinato effetto
sinergia
sinergia
sinergia
U-87 MG
Combinazione Value Index
parametri (micron)
Drug
ED50 ED75

ED90
Dm
m r
DOX
0,295 0,620

0,997
HER
1.845,5
0,457
0.860
DOX + HER
0,441 0,435

0.448
0,101 0,589

0.992
diagnosi combinato effetto
sinergia
sinergia
sinergia
SK-BR-3
combinazione Value Index
parametri (micron)
Drug
ED50 ED75

ED90
Dm
m
r
DOX
0.103
0.832
0.998
HER
1.424.000
0,046 0,435

DOX + HER
0,046
0,074 0,117

0,005 0,616

0.985
diagnosi combinato effetto
sinergia
sinergia
sinergia
DOX
, doxorubicina; HER
, Herceptin.
Figura Index 3 Combinazione come un effetto di inibizione della crescita di trattamento di combinazione con Herceptin e agenti anti-cancro. un. Nella combinazione di Herceptin e doxorubincin trattamento, l'effetto sinergico è stato osservato in cellule YBC-2 e NCI-N87, ma non nella linea cellulare YBC-3. b. Nella combinazione di Herceptin e cisplatino, gli effetti sinergici sono stati osservati in linee cellulari YBC-3 SK-BR-3, NCI-N87 e (CI < 1). Tuttavia, gli effetti inibitori sono stati osservati in YBC-2 e U-87 linee cellulari MG (CI > 1). c. Il trattamento di Herceptin e paclitaxel, in YBC-3 e-87 U linee cellulari MG, sono stati osservati gli effetti inibitori (CI > 1), tuttavia, in linea di cellule YBC-3, è stato osservato l'effetto sinergico (CI < 1 ). Nelle linee SK-BR-3 e NSC-87 cellule, gli effetti erano diversi dipende dalla dose di farmaci. d. Nella combinazione di Herceptin e 5-FU, gli effetti inibitori sono stati osservati in tutte le linee cellulari (CI > 1).
Tabella 3 valori calcolati per l'indice di combinazione come un effetto di inibizione della crescita di trattamento di combinazione con Herceptin e cisplatino nel carcinoma gastrico linee cellulari
YBC-2
Combinazione Value Index
parametri (micron)
Drug
ED50

ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
4.512
0,921 0,882

HER
1.201,0
0,316 0,915

CDDP + HER
1.375
2.707
5.337
2.232
0,587 0,965

diagnosi effetto combinato
antagonismo
antagonismo
antagonismo
YBC-3
combinazione Value Index
parametri (micron)
Drug
ED50 ED75

ED90
Dm
m r
CDDP
30,733
2.227
0,929
HER
46,063
0,623 0,970

CDDP + HER
0.274
0,110 0,054

12,091
1.472
0.998
Diagnosi effetto combinato
sinergia
sinergia
sinergia
NCI-N87
combinazione Indice Valore
parametri (micron)
Drug
ED50 ED75

ED90
Dm
m r
CDDP
45.86
0.53
0.93
HER 1.13E + 05
0,19
0.63
CDDP + HER
0.03
0,01
0,01
0.83
0.88
0.96
Diagnosi effetto combinato
sinergia
sinergia
sinergia
U-87 MG
Combinazione Value Index
parametri (micron)
Drug
ED50
ED75 ED90

Dm
m r
CDDP
5,65
1.08
0.98
HER 1.845,53
0.46
0.86
CDDP + HER
9.18
9.85
10.58
2.56
1.01
0.99
Diagnosi effetto combinato
antagonismo
antagonismo
antagonismo
SK-BR-3
combinazione Value Index
parametri (micron)
Drug
ED50 ED75

ED90
Dm
m r</sup></sub>