Correlatie tussen HER-2 /neu (erbB-2) expressieniveau en therapeutisch effect van de combinatiebehandeling met HERCEPTIN® en chemotherapeutische middelen bij maagkanker cellijnen

Correlatie tussen HER-2 /neu (erbB-2) expressie niveau en therapeutische effect van de combinatie van behandeling met Herceptin en chemotherapeutische middelen bij maagkanker cellijnen
De abstracte Inleiding
Hoewel gevorderde maagkanker heeft vele beperkingen en respons rate is marginaal in chemotherapie. Overexpressie van humane epidermale groeifactor receptor 2 (HER-2 /neu
) gen en het eiwit zijn geassocieerd met verhoogde celdeling en een hoge mate van tumorgroei en gerapporteerd in verscheidene tumoren. Bijzonder ongeveer 30% van borst- kankerpatiënten overexpressie van HER-2 /neu-eiwit en
overexpressie metastaseren sneller, induceert weerstand van de chemotherapie en neerwaarts reguleren functie van oestrogeenreceptor. Recombinant gehumaniseerd anti-HER2-antilichaam (Herceptin) de proliferatie van HER-2 /neu tot overexpressie
tumorcellen en het gebruik van deze in combinatie metastatische borstkanker toegenomen cytotoxiciteit van chemotherapeutische middelen.
Methods
We evalueerden de expressie van HER-2 /neu
eiwit in de maag cellijnen door FACS en daarna vergelijken van de cytotoxiciteit in chemotherapeutica (doxorubicine, cisplatine, paclitaxel, 5-FU) alleen en in combinatie met Herceptin uit de betrekking van HER-2 /neu
eiwit door MTT-test.
Resultaten
1. NCI-N87 (88%) maagkanker cellijn en SK-BR-3 (89%) van borstkanker cellijn met sterke positiviteit van haar- 2 /neu
expressie. YBC-2 (55%) en YBC-3 (48%) maagkanker cellijn met een intermediair, zwakke positiviteit respectievelijk. Negatieve controle U-87 MG (6%) hersenkanker cellijn werden toonde lage expressie van HER-2 /neu. 2. Cel groei werd dosis-afhankelijk geremd in HER-2 /neu
positieve controle cellijn SK-BR-3 door behandeling met Herceptin, maar niet waargenomen in HER-2 /neu
negatieve controle cellijn U-87 MG. Effectieve groeiremming niet bij maagkanker cellijnen met enkele behandeling Herceptin waargenomen, alle cellijnen waargenomen dosis-afhankelijke remming van de groei chemotherapeutische middelen (doxorubicine, cisplatine, paclitaxel en 5-FU). 3. Combinatie van Herceptin met doxorubicine waargenomen synergetische effecten in alle kanker cellijnen, behalve YBC-3, een combinatie van Herceptin met cisplatine waargenomen NCI-N87 en SK-BR-3 en de combinatie van Herceptin met paclitaxel waargenomen synergetische effecten in YBC-2. Combinatie van Herceptin met 5-FU waargenomen antagonistische effecten in alle kanker cellijnen.
Conclusies
Volgens HER-2 /neu
expressie niveau effect van anti-kankermiddelen werd anders in een combinatie van Herceptin met waargenomen chemotherapeutische middelen. Dit suggereert dat HER-2 /neu
expressie kan worden toegepast norm van combinatie van geneesmiddelen selectie in combinatie van Herceptin Met chemotherapeutische middelen bij maagkanker.
Trefwoorden
HER-2 /neu
(erbB- 2) HERCEPTIN® Maagkanker Combinatiebehandeling CI Inleiding
Sinds bekend is dat signaaltransductie routes door de groeifactor en de receptor speelt een machteloze rol in het kankerverwekkende proces veel studies worden uitgevoerd. Het HER-2 /neu
(erbB-2) proteïne, glycoproteïne celmembraan, een groeifactor receptor de activiteit van receptor tyrosine kinase [1]. HER2 is herhaaldelijk aangetoond in een groot aantal menselijke tumoren. Normale cel secretie geassocieerd met HER-2 /neu-eiwit, maar vernietiging van normale cellen te controleren waardoor eiwit overexpressie, verhoogt de snelheid van celdeling en groei veroorzaken voorstadia wijzigingen [2]. Ondernemingen De HER-2 /neu
( erbB-2) gen dat gelegen is op menselijk chromosoom 17q21 [3], waarin een gedeeltelijke homologie met de epidermale groeifactor receptor (EGFR) heeft [4, 5]. EGF (epidermale groeifactor) receptorfamilie is de activiteit van receptor tyrosine kinase en bestond uit EGF receptor, c-erbB-2, c-erbB-3 en c-erbB-4 [6-8]. Het HER-2 /neu oncoprotein, codeert een p185kD membraan glycoproteïne receptor die betrokken is bij de groei en diffentiation van de tumorcellen en 25 ~ 30% tot overexpressie gebracht in borst-, eierstok- en maagcarcinomen [9-12] en de prognose van deze patiënten slecht [13-15].
Overexpressie van HER-2 /neu
gen en het eiwit zijn geassocieerd prognose en behandeling [16-18] en expressie van borstkanker patiënt HER-2 /neu
is sterk vereist voor tumorgroei [19]. Die suggereren dat HER-2 /neu
betrokken bij borstkanker ontstaan, progressie en kwaadaardige en HER-2 /neu overexpressie
belangrijker dan hormoonreceptoren de patiënten met lymfekliermetastase [9]. Daarom zijn deze therapeutische targets HER-2 /neu
eiwitgeneesmiddelen, recombinant gehumaniseerd anti-HER-2 /neu
antilichaam - Herceptin, effectief bij de behandeling van borstkanker is gerapporteerd [20]
Gastric. kanker is de meest voorkomende kanker bij China. Het optreden van maagkanker is de meerstaps carcinogenese met verschillende genetische mutaties. HER-2 status gecorreleerd met de diepte van de invasie, TNM, lymfeklieren en metastasen van maagkanker [21]. HER-2 /neu overexpressie gerelateerd aan slechte prognose van maagkanker maar een bescheiden effect op de overleving bij maagkanker als onafhankelijke prognose factor [22]. Herceptin® als een cytostaticum, de mono therapie efficiënte van anti-tumor effect kan niet worden verwacht, maar veel onderzoek is aan de gang voor de combinatietherapie met andere geneesmiddelen tegen kanker of biologische middelen. Echter nog niet nauwkeurig onderzoeken van combinatietherapie van Herceptin met geneesmiddelen tegen kanker in de maag cellijnen [13]. Daarom is in deze studie onderzoeken we de effectieve combinatie van Herceptin (Trastuzumab, Genentech Inc., CA, USA) [23-25], als doelwit voor HER-2 /neu
oncoprotein, met anti-kanker drugs in maagkanker cellijnen afhankelijk van het HER-2 /neu
oncoprotein expressie.
Materialen en werkwijzen cellen

Maagkanker cellijnen werden gebruikt YBC-2, YBC-3 en NCI-N 87 cellijnen. De YBC-2 en YBC-3 cellijnen werden vastgesteld op basis van intraperitoneale uitgezaaide maagkanker door afdeling Pathologie, Yanbian University. De NCI-N 87 cellijn werd opgericht in de Verenigde State door NCI (National Cancer Institute, CRL5822, USA). De U-87 MG (ATCC HTB14) hersentumor cellijn SK-BR-3 (ATCC HTB30) borstkanker cellijn werden gebruikt voor HER-2 /neu eiwitexpressie
positieve en negatieve controle, respectievelijk.
Deze cellijn werden gekweekt minimaal gebruik essentiële media (MEM, GINCO BRL, Grand Island, NY, USA), die met daarin wordt geïnactiveerd (bij 56 ° C gedurende 30 min) 10% foetaal runderserum (FBS, GINCO BRL, Grand Island , NY, USA), 100 eenheden /ml penicilline en 0,1 mg /ml streptomycine. Alle kweek incubaties werden uitgevoerd in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO <sub>2
incubator. Drugs
Herceptin, Humanoid recombinant HER-2 /neu-antilichaam werd uit VS (Trastuzumab, 440 mg /20 ml Genentech Inc., San Francisco, CA, USA), en erkende geneesmiddelen tegen kanker, effect bij maagkanker, adriamycine (doxorubicine, 10 mg /5 ml), cisplatine (cisplatine, 10 mg /flesje), taxol (paclitaxel, 30 mg /flesje) en 5-FU (5-Flourouracil, 250 mg /5 ml) werden uit China. Bij experiment do elk geneesmiddel werd verdund in celkweekmedium.
FACS-analyse (HER-2 /neu eiwitexpressie)
HER-2 /neu
(erbB-2) oncoprotein expressie werd uitgevoerd met behulp van fluorescentie- Activated Cell Sorter (FACS, Becton Dickinson, USA) uitgevoerd immunofenotypering in celoppervlak. Kweekcellen (1 x 10 <sup>6) werden geoogst na behandeling met trypsine-EDTA (GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA) en geïncubeerd met het primaire antilichaam, anti-HER-2 /neu
antilichaam (Mouse Monoclonal antilichaam, LAB VISION, CA, USA), in een 1: 200 verdunning en 50 pl gedurende 1 uur bij 4 ° C. Gekleurde cellen werden tweemaal met koud PBS gewassen. Kleuring en wassen werden uitgevoerd in PBS (fosfaat-bufferoplossing, pH 7,6 Ca ++ Mg ++ vrij, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 2% FBS. Na tweemaal wassen secundaire FITC antimuis-antilichaam (anti-muis FITC-geconjugeerd antilichaam, Novocastra, USA) werd gebruikt in een verdunning 1:40 en 50 ul werden gedurende 40 minuten bij 4 ° C, na vervolgens tweemaal gewassen met koude PBS. Na het voltooien van de kleuring werden filtratie cel oplossing gebruikt 40 um nylon mesh verkrijgen van de enkele cel zwevende stoffen en het doen van onderzoek in de FACS.
MTT-test (in vitro Herceptin en chemotherapeutische middelen gevoeligheidstest bij maagkanker cellijnen)
de MTT-assay werd gebruikt voor in vitro drug
gevoeligheidstest bij maagkanker cellijnen. MTT kleurstof [3- (4,5-dimethyl thiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromide] wordt gereduceerd tot formazan (een donkerpaarse water onoplosbare verbinding) Door de succinaat dehydrogenase systeem voor actieve mitochondria, en dus specifiek worden gebruikt om de optische dichtheid (OD) van de putjes werd gemeten in een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) Sunrise reader (TECAN) bij 560 nm. De OD gecorreleerd lineair met het aantal levensvatbare cellen. Cellen werden met 180 ul medium van 1 x 10 4 cellen per putje in een 96 well plaat met meerdere holtes en gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2.
Voor enkel middel gevoeligheid test, werden twee methoden toegepast. Eerst, Herceptin (4,625, 9,25, 18,5, 37 uM), doxorubicine (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 uM), cisplatine (0,166, 1,666, 16,66, 166,6 uM), paclitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 uM) en 5-FU (38,43, 384,37, 3843,78, 38437,8 uM) werden verdund in 20 ul medium en toegevoegd aan de platen en geïncubeerd gedurende 4 dagen. Controlegroep werden pas media toegevoegd zonder drugs en gedurende dezelfde looptijden. Ten tweede, het synergetische effect van de combinatietherapie met een combinatie van Herceptin + doxorubicine, Herceptin + cisplatine, Herceptin + Paclitaxel en Herceptin + 5-FU.
Als combinatiebehandeling Herceptin en elke kankermedicijn uitgevoerd gevoeligheid test, vaste molaire concentratie percentage van beide geneesmiddelen, na het vervolgens toevoegen van 50 ul MTT werd MTT opgelost in fosfaatbuffer bij de concentratie van 2 mg /gl, toegevoegd aan elk putje en 4 uur langer. Na verwijdering van de supernatant, geplaatst 150 ui DMSO (Dimethylsulfoxide, Sigma, USA) in elk putje en zachtjes schudden ongeveer 15 minuten om de gegenereerde formazan op te lossen. De optische dichtheid (OD) van de putjes werd gemeten in een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) lezer bij 562 en 720 nm. Het voortbestaan ​​kwaadaardige cel werd berekend door de vergelijking (OD van het geneesmiddel goed OD van de blanco en /gemiddelde OD van controle goed - OD van de blanco well) x 100%. MTT assay werd uitgevoerd en driemaal herhaald voor elke dosis van het medicijn (5 putje) werden de resultaten geanalyseerd om het gemiddelde.
CI waardeberekening na combinatietherapie
CI (Combination index) te verkrijgen werd verkregen door de formule Chou-Talalay, werd berekend uit de waarde van IC50 (Dm) werden de werkzaamheid en capaciteitscurve (de waarde m). Klassieke formule van het isobologram (Cl = 1) was als volgt. CI =
D
1
/Dx 1
+
D
2
/Dx 2
noemer van (Dx) 1 en (Dx) 2 waren geven het percentage cytotoxiciteit van wanneer ze behandeld worden met een enkele drug alleen; teller (D) 1 en (D) 2 waren geven het percentage cytotoxiciteit van bij behandeling met beide geneesmiddelen. Dx =
Dm fa /
1
-
fa 1
m
Dm is de mediaan-effect dosis (IC50), deze berekende door mediaan-effect plot van de X-as van het antilog. X
=
aanmelden D
versus Y
=
log f
een
/ 1
-
f
een
m is de helling van de mediaan-effect plot. Meerdere drug effect analyse met behulp van Calcusyn (Biosoft, Cambridge, UK), werden berekend waarden van m, Dm, Dx, en CI. (Dx) 1 en (Dx) 2 werden berekend met behulp van de Chou-Talalay mediaan-effect formule. CI < 1, CI = 1, CI > 1 werden respectievelijk synergie, sommatie, en antagonisme effecten genoemd
Statistische evaluatie
Statistische analyses van de werden uitgevoerd met behulp van de tweezijdige Student data t
-test (SPSS 13.0 software, SPSS, Chicago, IL). . p
waarden kleiner dan 0,05 werden als statistisch significant. Analyse van variantie (ANOVA) werd gebruikt voor multigroep vergelijkingen met potentiële antitumor effecten tussen groepen te bepalen.
Resultaten
HER-2 /neu expressie in maagkanker cellijnen door FACS Ondernemingen De expressie van HER2 /neu eiwit werd geanalyseerd in drie verschillende maagkanker cellijnen (YBC-2, YBC-3 en NCI-N87). De expressie van deze proteinis 48% (zwak), 55% (gemiddeld) en 88% (sterk) in YBC-2, YBC-3 en NCI-N87, respectievelijk. De expressie van dit eiwit was 89% in positieve borstkanker cellijn SK-BR-3, en 6% negatief hersentumor cellijn U-87 MG (figuur 1). Figuur 1 HER-2 /neu expressie in maagkanker cellijnen. De expressie van HER2 /neu eiwit in elke kankercellijnen werden gemeten door fluorescentie-geactiveerde celsortering analyse. De HER2 /neu expressie in drie maagkanker cellijnen (YBC-2, YBC-3 en NCI-N87) waren 48% (zwak), 55% (gemiddeld) en 88% (sterk), respectievelijk. Alle groepen isotype controle waren niet meer dan 0,5% (gegevens niet zien). Als de positieve controle, SK-BR-3 of HER2 /neu expressie is 89%. U-87 MG toonde lagere expressie van HER2 /neu (6%) als negetive controle. Ondernemingen De gevoeligheid van maagkanker cellijn Herceptin en anti-kanker medicijn en de analyse van de gevoeligheid voor één behandeling met geneesmiddelen in vitro
bij toepassing van alleen Herceptin, de arrestatie van celgroei was zwak en IC 50 was niet detecteerbaar in vitro maagkanker cellijn (Figuur 2). In tegenstelling, de vier verschillende anti-kanker geneesmiddelen (doxorubincin, cisplatine, paclitaxel en 5-FU) toonde dosisafhankelijke remming van de celgroei en IC 50 gedetecteerd (Tabel 1, Figuur 2). Figuur 2 chemogevoeligheid van Herceptin® en vier antikankergeneesmiddelen bij maagkanker cellijnen. Bij eenmalig gebruik van Herceptin, de arrestatie van celgroei was zwak en IC50 was niet detecteerbaar in vitro met maagkanker cellijn. In tegenstelling, de vier verschillende anti-kanker geneesmiddelen (doxorubincin, cisplatine, paclitaxel en 5-FU) toonde dosisafhankelijke remming van de celgroei en IC50 werd gedetecteerd.
Tabel 1 IC30 en IC50 van vijf antikankermiddelen tegen YBC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG en SK-BR-3-cellijnen
Cytostatica
cellijnen (IC30) micrometer
YBC-2

YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
Antikankermiddelen
cellijnen (IC 50) micrometer
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
Het effect van de combinatie van Herceptin en anti-kanker medicijnen
In de combinatie van Herceptin en doxorubincin behandeling, het synergetisch effect werd waargenomen in YBC-2 en NCI-N87 cellen, maar niet in YBC-3 cellijn die zwak is expressie van HER2 /neu
eiwit (tabel 2, figuur 3a, P Restaurant < 0,05). In de combinatie van Herceptin en cisplatine werden de synergetische effecten waargenomen in SK-BR-3, NCI-N87 en YBC 3-cellijnen (CI < 1, P
< 0,05). Echter, de remmende effecten waargenomen in YBC-2 en U-87 MG cellijnen (Combination indexeren > 1, P
< 0,05) (tabel 3, figuur 3b). De behandeling van Herceptin en paclitaxel, in YBC-3 en U-87 MG cellijnen, werden de remmende effecten waargenomen (CI > 1), maar in YBC-3 cellijn, het synergetisch effect werd waargenomen (CI < 1 , P Restaurant < 0,05). In SK-BR-3 en NCI-87 cellijnen waren de effecten verschillend afhankelijk van de dosis van de geneesmiddelen (Tabel 4, Figuur 3c). In de combinatie van Herceptin en 5-FU werden de remmende effecten waargenomen in alle cellijnen (CI > 1, P
< 0,05) (Tabel 5, Figuur 3d) .table 2 Berekende waarden voor de combinatie index als een groei-remmende effect van de combinatiebehandeling met Herceptin® en doxorubicine bij maagkanker cellijnen
YBC-2
combinatie index Value
Parameter (uM)
drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2,93
0.54
0.98
HER
1.201,02
0.32
0,91
DOX + HER
0.09
0.05
0.03
0,25
0.74
0.96
Diagnose gecombineerd effect
synergie
synergie
synergie
YBC-3
Combinatie Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2,310
0,768
0,946
HER
46,063
0,623
0.970
DOX + HER
0,266
0,598
1.377
0,406
0,469
0,925
Diagnose gecombineerd effect
synergie
synergie
antagonisme
NCI-N87
Combinatie Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0.070
0,398
0,864
HER
113.350
0,191
0,635
DOX + HER
0.005
0.004
0.003
0.000
0,437
0,995
Diagnose gecombineerd effect
synergie
synergie
synergie
U-87 MG
Combinatie Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,295
0.620
0,997
HER
1845,5
0,457
0.860
DOX + HER
0,441
0,435
0,448
0,101
0,589
0,992
Diagnose gecombineerd effect
synergie
synergie
synergie
SK-BR-3
Combinatie Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0,103
0,832
0,998
HER
1.424.000
0,046
0,435
DOX + HER
0,046
0.074
0,117
0.005
0,616
0,985
Diagnose gecombineerd effect
synergie
synergie
synergie
DOX
, doxorubicine; HER
, Herceptin.
Figuur 3 Combinatie Index als een groei-remmende effect van de combinatie behandeling met Herceptin en anti-kankermiddelen. een. In de combinatie van Herceptin en doxorubincin behandeling werd het synergetisch effect waargenomen in YBC-2 en NCI-N87-cellen, maar niet in YBC-3 cellijn. b. In de combinatie van Herceptin en cisplatine werden de synergetische effecten waargenomen in SK-BR-3, NCI-N87 en YBC 3-cellijnen (CI < 1). Echter, de remmende effecten waargenomen in YBC-2 en U-87 MG cellijnen (CI > 1). c. De behandeling van Herceptin en paclitaxel, in YBC-3 en U-87 MG cellijnen, werden de remmende effecten waargenomen (CI > 1), maar in YBC-3 cellijn, het synergetisch effect werd waargenomen (CI < 1 ). In SK-BR-3 en NCI-87 cellijnen waren de effecten verschillend afhankelijk van de dosis van de geneesmiddelen. d. In de combinatie van Herceptin en 5-FU werden de remmende effecten waargenomen in alle cellijnen (CI > 1).
Tabel 3 Berekende waarden voor de Combinatie Index als groeiremmende effect van de combinatiebehandeling met Herceptin® en cisplatine bij maagkanker cellijnen
YBC-2
Combinatie Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50

ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
4,512
0,921 0,882

haar
1201,0
0,316
0,915
CDDP + HER
1.375
2,707
5,337
2,232
0,587
0,965
Diagnose gecombineerde effect
antagonisme
antagonisme
antagonisme
YBC-3
Combinatie Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
30,733
2,227
0,929
HER
46,063
0,623
0.970
CDDP + HER
0.274
0.110
0,054
12,091
1.472
0,998
Diagnose gecombineerd effect
synergie
synergie
synergie
NCI-N87
combinatie Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
45,86
0,53
0.93
HER
1.13E + 05
0.19
0,63
CDDP + HER
0.03
0.01
0.01
0,83
0,88
0.96
Diagnose gecombineerd effect
synergie
synergie
synergie
U-87 MG
Combinatie Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
5.65
1,08
0.98
HER
1.845,53
0,46
0.86
CDDP + HER
9.18
9,85
10.58
2,56
1.01
0.99
Diagnose gecombineerd effect
antagonisme
antagonisme
antagonisme
SK-BR-3
Combinatie Index Value
Parameter (uM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r</sup></sub>