Korelacija med HER-2 /neu (erbB-2) nivo izražanja in terapevtski učinek kombiniranega zdravljenja z zdravilom Herceptin in kemoterapevtiki v želodcu karcinom lines

Korelacija med HER-2 /neu (erbB-2) izraz ravni in terapevtski učinek kombiniranega zdravljenja z zdravilom Herceptin in kemoterapevtikov v celičnih linijah raka želodca
Abstract
Uvod
Čeprav ima napredovalega raka želodca precej omejitev in hitrost odziva je zanemarljiv v kemoterapiji. Prekomerno rastnega humani epidermalni rastni faktor receptor 2 (HER-2 /neu
) gena in njegovega proteina so povezana s povečano celično delitvijo in visoko stopnjo rasti tumorja in so poročali v številnih malignih sprememb. Še posebej, približno 30% bolnic z rakom dojk imajo čezmerno HER-2 /neu
beljakovin in čezmerni metastaze hitreje, povzroča odpornost na kemoterapijo in dol urediti delovanje estrogenskih receptorjev. Rekombinantno humanizirano anti-HER2 protitelesa (Herceptin) zavira proliferacijo HER-2 /neu
prekomerno ekspresijo tumorskih celic in uporabe, ki v kombinaciji v metastatskega raka dojke so se povečale citotoksičnosti kemoterapevtiki.
Metode
ocenili smo izraz HER-2 /neu
beljakovin v vrsticah želodčnih celic s FACS in nato primerjavo citotoksičnost v kemoterapevtiki (doksorubicin, cisplatin, paclitaxel, 5-FU) sam ali v kombinaciji z zdravilom Herceptin po izražanja HER-2 /neu
proteina MTT testu.
rezultatov
1. NCI-N87 (88%), želodčni rak celične linije in SK-BR-3 (89%), rak dojk celične linije z močnim pozitivnosti dediščini 2 /neu
izraz. YBC-2 (55%) in YBC-3 (48%), celične linije želodčnega raka pri posrednikih, šibko pozitivnost oz. Negativna kontrola U-87 MG (6%), možganski rak celične linije smo pokazali nizko ekspresijo HER-2 /neu. 2. Rast celic se je v odvisnosti od odmerka zaviral Her-2 /neu
pozitivno, nadzor celične linije SK-BR-3 z obdelavo Herceptin, vendar niso opazili HER-2 /neu
negativni nadzor celične linije U-87 MG. Učinkovito zaviranje rasti nismo opazili v želodčnih linij rakavih celic z eno samo zdravljenje Herceptin, vse celične linije opazili inhibicije rasti je odvisen od odmerka kemoterapevtikov (doksorubicin, cisplatin, paclitaxel in 5-FU). 3. Kombinacija Herceptin z doksorubicinom ugotovili sinergijske učinke na vseh rak celičnih linijah, razen YBC-3, kombinacija Herceptin s cisplatinom opazili NCI-N87 in SK-BR-3 in kombinacija Herceptin s paklitakselom opazili sinergijske učinke v YBC-2. Kombinacija Herceptin s 5-FU opazili antagonistične učinke v vseh raka celičnih linijah.
Sklepe
Po HER-2 /neu
ravni izražanja, je v kombinaciji zdravila Herceptin z opazili učinek proti raku drugače kemoterapevtiki. To kaže, da se HER-2 /neu
nivo izražanja lahko uporablja standard izbire kombinacija drog v kombinaciji zdravila Herceptin Z kemoterapevtikov pri bolnikih z rakom želodca.
Ključne besede
HER-2 /neu
(erbB- 2) rak HERCEPTIN želodca Kombinirano zdravljenje CI Uvod
Ker je znano, da prenos signalov poti s rastnega faktorja in njegov receptor imajo impotentni vlogo v rakotvorno postopku številne študije, ki se izvaja. Her-2 /neu
(erbB-2) protein, celična membrana glikoprotein, je rastni faktor receptor ima aktivnost receptorja tirozin kinaze [1]. HER2 je pogosto odkrita v številnih človeških tumorjev. izločanje normalno celično povezan s HER-2 /neu beljakovin, ampak uničevanje normalnih celic nadzorom povzroča beljakovin čezmerno poveča stopnja rast in delitev celice povzročijo predrakave spremembe [2].
HER-2 /neu
( erbB-2), gen, ki se nahaja na humani kromosom 17q21 [3], ki ima delno homologna z epidermalni rastni faktor receptor (EGFR) [4, 5]. ESPG (epidermalni rastni faktor), družina receptorja ima aktivnost receptorja tirozin kinaze in sestavljalo EGF receptorja, c-erbB-2, c-erbB-3 in c-erbB-4 [6-8]. HER-2 /neu onkoproteina, kodira membranski glikoprotein p185kD, receptor, ki je vpletena v rast in diffentiation tumorskih celic in 25 ~ 30% prekomerno v prsi, jajčnikov in želodčnih karcinomov [9-12] in prognozo teh bolnikov je slaba [13-15].
Čezmerno neu
gena HER-2 /in to je protein so povezani z rakom dojk bolnikovo prognozo in terapijo [16-18] in izražanje HER-2 /neu
je močno potreben za rast tumorja [19]. Tisti, ki kažejo, da HER-2 /neu
vpletajo v nastanek raka dojk, napredovanja in maligne in HER-2 /neu
prekomerno, je bolj pomembno kot hormonskih receptorjev na bolnikih z bezgavkah metastaze [9]. Zato ti terapevtski cilji HER-2 /neu
proteinske drog, rekombinantno humanizirano anti- HER-2 /neu
protitelesa - Herceptin, učinkovite pri zdravljenju raka na dojki so poročali [20]
želodca. rak je rak najbolj razširjena na Kitajskem. Pojav raka želodca je večstopenjski kancerogen postopek s sortnimi genskih mutacij. HER-2 status je povezana z globino invazije, faze TNM, bezgavke in daljni metastaz raka želodca [21]. HER-2 /neu prekomerno ekspresijo je povezan s slabo prognozo raka želodca, vendar ima le malo vpliva na preživetje pri raku želodca kot samostojno prognoze dejavnik [22]. Herceptin® kot citostatiki sredstvo, mono terapija učinkovita od protitumornih učinkov ne moremo pričakovati, vendar veliko raziskav poteka v kombinaciji z drugimi zdravili proti raku ali bioloških dejavnikov. Vendar pa še vedno ni natančno preučiti kombiniranega zdravljenja z zdravilom Herceptin z zdravili proti raku v celičnih linijah želodca [13]. Zato se v tej študiji smo raziskali učinkovito kombinacijo Herceptin (trastuzumab, Genentech Inc, CA, ZDA) [23-25], ki je namenjeno za HER-2 /neu
onkoproteina, z zdravili proti raku na želodcu raka celičnih linijah je bilo odvisno od HER-2 /neu
onkoproteina izraz.
materiali in metode
Celice
želodčni rak celičnih linij uporablja YBC-2, YBC-3 in NCI-N 87 celične linije. V YBC-2 in YBC-3 celične linije so bile določene z intraperitonealno metastatskega raka želodca oddelek za patologijo, Yanbian University. NCI-N 87 celična linija je bila ustanovljena v Združenih državah, ki ga NIS (National Cancer Institute, CRL5822, ZDA). U-87 MG (ATCC, HTB14) možganski tumor celične linije in SK-BR-3 (ATCC, HTB30) rak dojk celične linije so bile uporabljene za HER-2 /neu
protein izražanja pozitivno in negativno kontrolo, oz.
To celično linijo bila najmanjša kultiviramo uporaba nujna mediji (MEM, GINCO BRL, Grand Island, NY, ZDA), ki je vsebuje inaktiviramo (pri 56 ° C 30 min), 10% fetalni goveji serum (FBS, GINCO BRL, Grand Island , NY, USA), 100 enot /ml penicilina in 0,1 mg /ml streptomicin. Vse kulture Inkubacija je bila izvedena v navlaženi 37 ° C, 5% CO <sub>2 inkubatorja.
DROGE
Herceptin, Humanoid rekombinantni HER-2 /neu protitelesa, je bil iz ZDA (trastuzumab, 440 mg /20 ml , Genentech Inc., San Francisco, CA, ZDA), in priznana zdravila proti raku, učinek na raka želodca Adriamicin (doksorubicin, 10 mg /5 ml), cisplatin (cisplatin 10 mg /vialo), Taxol (paklitaksel, 30 mg /viala) in 5-FU (5-Flourouracil, 250 mg /5 ml) je bilo iz Kitajske. Pri tem eksperiment vsako zdravilo je bilo uporabljeno razredčimo v celične kulture medijev.
FACS analize (HER-2 /neu protein izraz)
HER-2 /neu
(erbB-2) onkoproteina izraz je bila opravljena s pomočjo Fluorescence- aktivira Cell Sorter (FACS, Becton Dickinson, ZDA) izvaja immunophenotyping na površini celic. Kulture celice (1 x 10 <sup>6) smo zbrali po zdraviti z tripsina-EDTA (GIBCOBRL, Grand Island, NY, ZDA) in inkubirali s primarno protitelo, anti-HER-2 /neu
protitelesa (mišjimi monoklonskimi protitelo, LAB VISION, CA, ZDA), v razredčenju 1: 200 in 50 ul za 1 uro pri 4 ° C. Obarvajo Celice smo dvakrat sprali s hladnim PBS. Barvanja in pranje so bile izvedene v PBS (fosfatov pufrske raztopine, pH 7,6 Ca ++ Mg ++ brezplačno, GIBCO BRL, Grand Island, NY, ZDA) 2% FBS. Po dvakratnem spiranju sekundarni FITC protimišja protitelesa (Anti-Mouse FITC-konjugirano protitelo, Novocastra, ZDA) je bil uporabljen v razredčenju 1:40 in 50 ul inkubiramo 40 minut pri 4 ° C, potem pa dvakrat speremo s hladnim PBS. Po končanem barvanje, so rešitev filtracija celica uporablja 40 um najlon mreže pridobiti eno celico prekinjena snovi in ​​delaš analizo v FACS.
MTT testom (in vitro Herceptin in kemoterapevtikov občutljivost preskusnega v želodcu raka celičnih linijah)
MTT test je bil uporabljen za in vitro
testu občutljivosti drog v želodcu raka celičnih linijah. MTT barvilo [3- (4,5-dimetil tiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolij bromid] zniža na formazana (temno vijolično vodi netopen spojina) s sistemom sukcinat dehidrogenaze aktivne mitohondrijev, in s tem, še posebej uporablja za optične gostote (oD) vrtin je bila izmerjena v encimsko imunskim testom (ELISA) čitalnika Sunrise (TECAN) pri 560 nm. OD linearno korelaciji s številom živih celic. Celice smo nanesli na 180 ul medijih 1 x 10 4 celic na dobro v 96 dobro več vdolbinicami in inkubiramo 24 ur pri 37 ° C, 5% CO 2.
Za enkratno drog Test občutljivosti so bili uporabljeni dve metodi. Prvič, Herceptin (4,625, 9,25, 18,5, 37 uM), doksorubicin (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 iM), cisplatin (0,166, 1,666, 16.66, 166,6 iM), paclitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 pM) in 5-FU (38,43, 384,37, 3843,78, 38437,8 uM) smo razredčili v 20 p.l medija in dodamo k ploščama in inkubirali 4 dni. Kontrolna skupina so bili dodani samo mediji, brez drog in inkubiranih istih trajanja. Drugič, sinergijski učinek kombiniranega zdravljenja s kombinacijo zdravila Herceptin + doksorubicin, Herceptin + cisplatin, Herceptin + Paklitaksel in Herceptin + 5-FU.
Ko kombinirano zdravljenje Herceptin in vsak opraviti preizkus občutljivosti zdravilo proti raku, določen molski odstotek koncentracije obeh zdravil, potem pa dodali 50 ul MTT, MTT smo raztopili v fosfatnem pufru pri koncentraciji 2 mg /ul, ter dodamo v vsako in inkubirali 4 ure več. Po odstranitvi supernatanta, ki se nahaja 150 ul DMSO (dimetilsulfoksid, Sigma, ZDA) v vsako vdolbino in rahlo stresamo približno 15 minut, da se raztopi ustvarjen formazana. Optična gostota (OD) vrtin je bila izmerjena v čitalniku encimski imunski test (ELISA) pri 562 in 720 nm. Preživetje maligni celic smo izračunali po enačbi (OD za zdravila dobro OD slepe vrtine /pomeni OD nadzora dobro - OD slepe vrtine) × 100%. MTT testu smo izvedli in ponovili trikrat za vsak odmerek zdravila (5 dobro) rezultati so bili analizirani da dobimo povprečno.
Izračun CI vrednosti po kombinacijski terapiji
CI (Kombinacija indeksom) dobimo s formulo Chou-Talalay, je bila izračunana na podlagi vrednosti IC50 (Dm) je primerjala učinkovitost in krivuljo zmogljivosti (m vrednost). Klasična formula Isobologram (CI = 1) je bila, kot sledi. CI =
D
1
/
Dx 1
+
D
2
/
Dx 2
imenovalec (Dx) 1 in (Dx) 2 so navedli odstotek citotoksičnost, če se zdravijo samo z eno samo drogo; Števec (D) 1 in (D) 2 so navedli odstotek citotoksičnost med zdravljenjem z obeh zdravil. Dx =
Dm fa /
1
-
fa 1
m
Dm je mediana učinek odmerek (IC50), ta izračunana s mediana učinka parceli X-prestrezanje od antilog. X
=
log D
primerjavi Y
=
log f
A
/
1
-
f
A
m je naklon parcele je mediana učinka. Analiza večkratnih učinek drog s pomočjo Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Velika Britanija), so bile izračunane vrednosti m, Dm, Dx, in CI. (Dx) 1 in (Dx) 2 so bile izračunane z mediano učinka formula Chou-Talalay. CI < 1, CI = 1, CI > 1 so bili imenovani sinergija, vsota, in antagonizem učinkov oziroma
statističnega vrednotenja
Statistične analize podatkov je bilo opravljenih s pomočjo dveh zimsko Student t
-test (SPSS 13,0 programske opreme, SPSS, Chicago, IL). . p
vrednosti manj kot 0,05, so bile obravnavane statistično značilne. Analiza variance (ANOVA) smo uporabili za multiple primerjave skupine za določitev potencialnih protitumorne učinke med skupinami.
Rezultati
HER-2 /neu izraz v želodcu linij rakavih celic s FACS
izražanje HER2 /neu protein smo analizirali v treh različnih rak želodca celičnih linijah (YBC-2, YBC-3 in NCI-N87). Izraz tega proteinis 48% (šibko), 55% (srednje) in 88% (močno) v YBC-2, YBC-3 in NCI-N87, oz. Izraz tega proteina je bil 89% v pozitivnem raka dojk celične linije SK-BR-3 in 6% v negativno možganski tumor celične linije U-87 MG (slika 1). Slika 1 HER-2 /neu ekspresijo v želodčnih raka celičnih linijah. Ekspresijo HER2 /neu proteina v vseh celičnih linijah raka smo izmerili s fluorescenco aktivirano celično sortiranje analizo. ekspresijo HER2 /neu v treh želodčnih raka celičnih linijah (YBC-2, YBC-3 in NCI-N87) je bilo 48% (šibko), 55% (srednja) in 88% (močno), oz. Vse skupine nadzora testu ni bila več kot 0,5% (podatki niso pokazali). Kot pozitivno kontrolo, SK-BR-3 HER2 /neu izražanja 89%. U-87 MG pokazala manjšo ekspresijo HER2 /neu (6%) kot negetive kontrolo.
Občutljivost rak želodca celične linije do Herceptin in proti raku, zdravila in analizo občutljivosti do samega zdravljenja odvisnosti od drog in vitro
pri enkratni uporabi zdravila Herceptin, je bila aretacija celične rasti šibka in IC 50 ni bilo mogoče zaznati v vitro z rakom želodca celične linije (slika 2). V nasprotju s tem, štirje različni proti raku drog (doxorubincin, cisplatina, paklitaksel in 5-FU) je pokazala odmerka odvisno inhibicijo rasti celic in IC bila odkrita 50 (Tabela 1, slika 2). Slika 2 Chemosensitivity od Herceptin® in štiri proti raku droge v želodcu raka celičnih linijah. Pri enkratni uporabi zdravila Herceptin, je bila tudi aretacija celične rasti šibke in IC50 ni bilo zaznati in vitro z rakom želodca celične linije. V nasprotju s tem, štirje različni proti raku drog (doxorubincin, cisplatina, paklitaksel in 5-FU) je pokazala odmerka odvisno inhibicijo rasti celic in IC50 bila zaznana.
Tabela 1 IC30 in IC50 pet proti raku proti YBC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG in SK-BR-3 celičnih linijah
proti raku
celičnih linijah (IC30) iM
YBC-2

YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
Sredstva proti raku
Celične linije (IC 50) iM
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
Učinek kombinacije Herceptin in proti raku drog
V kombinaciji Herceptin in doxorubincin zdravljenja je sinergijski učinek opazili pri YBC-2 in NCI-N87 celice, ne pa tudi v YBC-3 celične linije, ki je šibko izražanje HER2 /neu
proteina (preglednica 2, slika 3a, P
< 0,05). V kombinaciji zdravila Herceptin in cisplatina, so v SK-BR-3, NCI-N87 in YBC-3 celičnih linijah (; 1, P
< 0,05 CI <) upoštevati sinergijske učinke. Vendar so pri YBC-2 in U-87 MG celičnih linijah opazili zaviralni učinki (kombinacija indeksa > 1 P
< 0,05) (tabela 3, slika 3b). Zdravljenje Herceptin in paklitaksela, v YBC-3 in U-87 celične linije MG, so opazili zaviralni učinki (CI > 1), vendar pa se v YBC-3 celične linije, je bilo opaziti sinergijski učinek (CI < 1 P
< 0,05). V SK-BR-3 in NCI-87 celičnih linijah, so bili učinki drugačni odvisen od odmerka drog (tabela 4, slika 3c). V kombinaciji Herceptin in 5-FU, so bili v vseh celičnih linij opazili zaviralni učinki (CI > 1 P
< 0,05) (tabela 5, slika 3d) .table 2 Izračunano vrednosti Kombinacija Indeks kot rast zaviralnega učinka kombinaciji z Herceptin® in Doksorubicin v celičnih linijah raka želodca
YBC 2-
Kombinacija indeks Vrednost
Parameter (um)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2.93
0,54
0,98
HER
1201,02
0,32
0,91
DOX + NJENO
0,09
0,05
0,03
0,25
0,74
0,96
Diagnoza kombinirani učinek
sinergija
sinergija
sinergija
YBC-3
Kombinacija vrednosti indeksa
parametrov (LM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
2.310
0.768
0.946
HER
46.063
0,623
0,970
DOX + NJENO
0,266
0,598
1,377
0,406
0,469
0,925
Diagnoza kombinirani učinek
sinergija
sinergija
antagonizem
po NCI-N87
Kombinacija vrednosti indeksa
parametrov (LM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0.070
0,398
0,864
HER
113.350
0,191
0,635
DOX + HER
0.005
0,004
0,003
0.000
0,437
0,995
Diagnoza kombinirani učinek
sinergija
sinergija
sinergija
U-87 MG
Kombinacija vrednosti indeksa
parametrov (LM)
Drug
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0.295
0.620
0,997
ZANJO
1845,5
0,457
0.860
DOX + NJENO
0.441
0,435
0,448
0,101
0,589
0,992
diagnozo skupni učinek
sinergija
sinergija
sinergija
SK-BR-3
Kombinacija vrednosti indeksa
parametrov (LM)
zasvojenosti
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
DOX
0.103
0,832
0.998
HER
1424000
0,046
0,435
DOX + HER
0,046
0,074
0,117
0.005
0,616
0,985
Diagnoza kombinirani učinek
sinergija
sinergija
sinergija
DOX
, doksorubicin; NJENO
, Herceptin.
Slika 3 Kombinirani indeks kot rast zaviralnega učinka kombinaciji z Herceptin® in proti raku. a. V kombinaciji zdravila Herceptin in doxorubincin zdravljenje je bilo opaziti sinergijski učinek v YBC-2 in NCI-N87 celic, vendar ne v YBC-3 celične linije. b. V kombinaciji zdravila Herceptin in cisplatina, so v SK-BR-3, NCI-N87 in YBC-3 celičnih linijah opazili sinergijske učinke (CI < 1). Vendar so pri YBC-2 in U-87 MG celičnih linijah opazili zaviralni učinki (IS > 1). c. Zdravljenje Herceptin in paklitaksela, v YBC-3 in U-87 celične linije MG, so opazili zaviralni učinki (CI > 1), vendar pa se v YBC-3 celične linije, je bilo opaziti sinergijski učinek (CI < 1 ). V SK-BR-3 in NCI-87 celičnih linijah, so bili učinki drugačni odvisen od odmerka zdravil. d. V kombinaciji Herceptin in 5-FU, so bili v vseh celičnih linij opazili zaviralni učinki (CI > 1).
Tabela 3 Izračunane vrednosti za kombinacijo indeksom kot rast zaviralnim učinkom kombinaciji z Herceptin® in Cisplatin raka želodca celične linije
YBC-2
Kombinacija vrednosti indeksa
parametrov (um)
Drug
ED50

ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
4.512
0,921
0,882
HER
1201,0
0,316
0,915
CDDP + NJENO
1.375
2,707
5,337
2,232
0,587
0,965
Diagnoza skupni učinek
antagonizem
antagonizem
antagonizem
YBC-3
Kombinacija vrednosti indeksa
parametrov (LM)
zasvojenosti
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
30.733
2,227
0.929
ZANJO
46.063
0,623
0,970
CDDP + NJENO
0,274
0.110
0,054
12,091
1,472
0,998
Diagnoza kombinirani učinek
sinergija
sinergija
sinergija
NCI-N87
kombinacija indeks Vrednost
parametrov (LM)
drog
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
45.86
0,53
0,93
HER
1.13E + 05
0,19
0,63
CDDP + HER
0,03
0,01
0,01
0,83
0,88
0,96
Diagnoza kombinirani učinek
sinergija
sinergija
sinergija
U-87 MG
Kombinacija vrednosti indeksa
parametrov (LM)
zasvojenosti
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r
CDDP
5.65
1,08
0,98
HER
1845,53
0,46
0.86
CDDP + NJENO
9,18
9,85
10.58
2.56
1.01
0,99
Diagnoza kombinirani učinek
antagonizem
antagonizem
antagonizem
SK-BR-3
Kombinacija vrednosti indeksa
parametrov (LM)
zasvojenosti
ED50
ED75
ED90
Dm
m
r</sup></sub>