Correlación entre HER-2 /neu (-2 erbB) nivel de expresión y el efecto terapéutico de tratamiento de combinación con HERCEPTIN® y agentes quimioterapéuticos en gástrico Correlación lines

célula de cáncer entre HER-2 /neu (erbB-2) el nivel de expresión y el efecto terapéutico de tratamiento de combinación con agentes quimioterapéuticos Herceptin y en líneas celulares de cáncer gástrico
Resumen Introducción

Aunque el cáncer gástrico avanzado tiene muchas limitaciones y la tasa de respuesta es marginal en la quimioterapia. La sobreexpresión del factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2 (HER-2 /neu
) gen y su proteína se asocia con aumento de la división celular y una alta tasa de crecimiento del tumor y se han reportado en varios tumores malignos. Especialmente, aproximadamente el 30% de los pacientes con cáncer de mama tienen la sobreexpresión de HER-2 /neu
proteínas y la sobreexpresión metástasis más rápido, induce la resistencia de la quimioterapia y la función de los receptores de estrógenos abajo-regular. Recombinante anti-HER2 anticuerpo humanizado (Herceptin) inhibe la proliferación de HER-2 /neu
células tumorales que sobreexpresan y el uso de que en combinación en el cáncer de mama metastásico han aumentado la citotoxicidad de los agentes quimioterapéuticos.
Métodos
Evaluamos la expresión de HER-2 /neu
proteína en líneas de células gástricas por FACS y luego comparar la citotoxicidad en quimioterapéuticos (doxorrubicina, cisplatino, paclitaxel, 5-FU) solo y en combinación con Herceptin de acuerdo con la expresión de HER-2 /neu
de proteínas mediante el ensayo de MTT.
resultados
1. NCI-N87 (88%) de la línea celular de cáncer gástrico y SK-BR-3 (89%) línea celular de cáncer de mama con una fuerte positividad de HER 2 /neu
expresión. YBC-2 (55%) y YBC-3 (48%) de la línea celular de cáncer gástrico con intermediado positividad, débil, respectivamente. Control negativo U-87 MG (6%) línea celular de cáncer de cerebro se mostró una baja expresión de HER-2 /neu. 2. El crecimiento celular se inhibió de forma dependiente de la dosis en HER-2 /neu
línea positiva, célula de control SK-BR-3 por tratamiento con Herceptin, pero no se observa en HER-2 neu
línea celular de control /negativo U-87 MG. inhibición efectiva del crecimiento no se observó en líneas celulares de cáncer gástrico con un solo tratamiento de Herceptin, todas las líneas celulares observaron la inhibición del crecimiento dependiente de la dosis de agentes quimioterapéuticos (doxorrubicina, cisplatino, paclitaxel y 5-FU). 3. La combinación de Herceptin con doxorrubicina observado efectos sinérgicos en todas las líneas celulares de cáncer, excepto YBC-3, combinación de Herceptin con cisplatino observó NCI-N87 y SK-BR-3 y la combinación de Herceptin con paclitaxel observado efectos sinérgicos en YBC-2. Combinación de Herceptin con 5-FU observó efectos antagonistas en todas las líneas celulares de cáncer.
Conclusiones
Según HER-2 /neu
nivel de expresión, se observó efecto de los agentes contra el cáncer de manera diferente en combinación de Herceptin con agentes quimioterapéuticos. Esto sugiere que HER-2 /neu
nivel de expresión puede ser norma de selección combinación de fármacos aplicado en combinación de Herceptin con agentes quimioterapéuticos en el cáncer gástrico.
Palabras clave
HER-2 /neu gratis (erbB- 2) la combinación del tratamiento del cáncer gástrico HERCEPTIN® IC Introducción Desde
conocido que las vías de transducción de señales del factor de crecimiento y su receptor juegan un papel impotente en el proceso carcinogénico están llevando a cabo muchos estudios. La proteína HER-2 /neu
(erbB-2), glicoproteína de membrana celular, es un receptor del factor de crecimiento tiene la actividad de la tirosina quinasa del receptor de [1]. HER2 se ha detectado con frecuencia en una amplia gama de tumores humanos. la secreción normal de la célula asociada con la proteína HER-2 /neu, pero la destrucción de las células normales de control haciendo que la sobreexpresión de proteínas, aumenta la tasa de división celular y el crecimiento indujo cambios precancerosos [2]. comentario El HER-2 /neu gratis ( erbB-2) de genes que se encuentra en el cromosoma humano 17q21 [3], que tiene una homología parcial con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [4, 5]. EGF (factor de crecimiento epidérmico) familia de receptores tiene la actividad de la tirosina quinasa del receptor y constaba de receptor EGF, c-erbB-2, c-erbB-3 y c-erbB-4 [6-8]. El HER-2 /neu oncogénica, codifica una glicoproteína de membrana p185kD, receptor que está implicada en el crecimiento y diffentiation de las células tumorales y 25 ~ 30% sobreexpresa en mama, ovario y carcinomas gástricos [9-12] y el pronóstico de estos pacientes es pobre [13-15]. la sobreexpresión de
/gen HER-2 neu
y es la proteína se asocian pronóstico y el tratamiento [16-18] y la expresión de los pacientes de cáncer de mama HER-2 /neu
está fuertemente requerido para el crecimiento del tumor [19]. Los que sugieren que HER-2 /neu
implicado en la aparición del cáncer de mama, la progresión y la maligna y HER-2 /neu
sobreexpresión es más importante que los receptores de hormonas en los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos [9]. Por lo tanto, estos objetivos terapéuticos HER-2 /neu
fármacos de proteínas, humanizado recombinante anti-HER-2 /neu
anticuerpo - Herceptin, eficaces en el tratamiento de cáncer de mama se ha informado [20]
gástrico. el cáncer es el cáncer más frecuente en la china. La aparición de cáncer gástrico es el proceso carcinogénico de múltiples etapas con mutaciones genéticas de variedades. HER-2 se correlaciona con la profundidad de la invasión, el estadio TNM, los ganglios linfáticos y metástasis a distancia del cáncer gástrico [21]. HER-2 /neu sobre expresión está relacionada con un mal pronóstico del cáncer gástrico, pero tiene un efecto modesto sobre la supervivencia en el cáncer gástrico como factor pronóstico independiente [22]. Herceptin® como agente citostático, no se puede esperar el mono terapia eficaz de los efectos antitumorales, pero una gran cantidad de investigación está en marcha para la terapia de combinación con otros medicamentos contra el cáncer o agentes biológicos. Sin embargo, todavía no estudiar con precisión de la terapia de combinación de Herceptin con medicamentos contra el cáncer en las líneas celulares gástricas [13]. Por lo tanto, en este estudio se investiga la combinación efectiva de Herceptin (trastuzumab, Genentech Inc, CA, EE.UU.) [23-25], la orientación para HER-2 /neu
oncoproteína, con medicamentos contra el cáncer en líneas celulares de cáncer gástrico , se utilizaron en función de la HER-2 /neu
oncoproteína expresión.
Materiales y métodos las células

líneas celulares de cáncer gástrico líneas 87 celulares YBC-2, YBC-3 y NCI-N. Las líneas celulares YBC-2 y YBC-3 se establecieron a partir de cáncer gástrico metastásico intraperitoneal por el Departamento de Patología, Universidad Yanbian. La línea celular NCI-87 N se estableció en el estado unido por el NCI (Instituto Nacional del Cáncer, CRL5822, EE.UU.). El MG U-87 (ATCC, HTB14) línea celular de tumor cerebral y SK-BR-3 (ATCC, HTB30) línea celular de cáncer de mama se utilizaron para HER-2 /neu
control positivo y negativo expresión de la proteína, respectivamente.
Estos línea celular fueron utilización culta mínimo medio esencial (MEM, Ginco BRL, Grand Island, NY, EE.UU.), que se contienen inactivado (a 56 ° C durante 30 min) 10% de suero fetal bovino (FBS, Ginco BRL, Grand Island , Nueva York, EE.UU.), 100 unidades /ml de penicilina y 0,1 mg /ml de estreptomicina. Todas las incubaciones de cultivo se realizaron en un humidificado 37 ° C, 5% de CO <sub>2 incubadora.
Drugs
Herceptin, recombinante humanoide HER-2 /neu anticuerpo, era de EE.UU. (Trastuzumab, 440 mg /20 ml , Genentech Inc., San Francisco, CA, EE.UU.), y fármacos contra el cáncer reconocidos, efecto en el cáncer gástrico, adriamicina (doxorrubicina, 10 mg /5 ml), cisplatino (cisplatino, 10 mg /vial), Taxol (paclitaxel, 30 mg /vial) y 5-FU (5-Flourouracil, 250 mg /5 ml) eran de china. Cuando hace el experimento cada fármaco fue utilizado diluido en medio de cultivo celular.
Análisis FACS (expresión HER-2 /neu)
HER-2 /neu gratis (erbB-2) la expresión oncoproteína se realizó utilizando por fluorescencia activada por células clasificador (FACS, Becton Dickinson, EE.UU.) realizó el inmunofenotipo en la superficie celular. células de cultivo (1 x 10 <sup>6) fueron cosechadas después de un tratamiento con tripsina-EDTA (GIBCOBRL, Grand Island, NY, EE.UU.) y se incubaron con el anticuerpo primario, anti-HER-2 /neu
anticuerpo (monoclonal de ratón anticuerpo, VISION LAB, CA, EE.UU.), en una dilución 1: 200 y 50 l durante 1 hora a 4 ° C. Las células teñidas se lavaron dos veces con PBS frío. Tinción y el lavado se realizaron en PBS (solución tampón de fosfato, pH 7,6 Ca ++ Mg ++ gratis, Gibco BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) FBS al 2%. Después de lavar dos veces un anticuerpo anti-ratón de FITC-secundario (anticuerpo anti-ratón conjugado con FITC, Novocastra, EE.UU.) se utilizó en una dilución 1:40, y 50 l se incubaron durante 40 minutos a 4 ° C, después de entonces se lavó dos veces con frío PBS. Después de completar la tinción, solución de células de filtración se utilizaron 40 um de malla de nylon obtener la única célula materia en suspensión y el análisis que hace en el.
Ensayo FACS MTT (Herceptin en vitro y agentes quimioterapéuticos prueba de sensibilidad en líneas celulares de cáncer gástrico)
El ensayo MTT se ha utilizado para vitro
prueba de sensibilidad a los fármacos en las líneas celulares de cáncer gástrico. MTT colorante [3- (4,5-dimetil-tiazol-2 il) -2,5-difenil tetrazolio] se reduce a formazán (un compuesto insoluble en agua de color púrpura oscuro) por el sistema de succinato deshidrogenasa de mitocondrias activo, y por lo tanto, utilizado específicamente para la densidad óptica (DO) de los pocillos se midió en un lector unido a enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) Sunrise (TECAN) a 560 nm. El OD correlaciona linealmente con el número de células viables. Las células se cultivaron en placas a 180 ul de medios 1 × 10 4 células por pocillo en una placa de 96 pocillos múltiples pocillos y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Opiniones de solo medicamento prueba de sensibilidad, se aplicaron dos métodos. En primer lugar, Herceptin (4,625, 9,25, 18,5, 37 mM), doxorrubicina (0,0183, 0,183, 1,83, 18,3 mM), cisplatino (0,166, 1,666, 16,66, 166,6 M), paclitaxel (0,0585, 0,585, 5,85, 58,5 M) y 5-FU (38,43, 384,37, 3843,78, 38.437,8 mu M) se diluyeron en 20 medios mu l y se añadió a las placas y se incubaron durante 4 días. El grupo de control se añadieron único medio de comunicación sin las drogas y se incubó mismas duraciones. En segundo lugar, el efecto sinérgico de la terapia de combinación con una combinación de Herceptin + doxorrubicina, cisplatino + Herceptin, Herceptin + Paclitaxel y Herceptin + 5-FU.
Cuando el tratamiento de combinación Herceptin y cada prueba de sensibilidad realizado medicamento contra el cáncer, se fijaron porcentaje concentración molar de ambos fármacos, después a continuación, añadir 50 l de MTT, MTT se disolvió en tampón de fosfato a la concentración de 2 mg /l, se añadió a cada pocillo y se incubaron 4 horas más. Después de retirar el sobrenadante, colocado 150 l DMSO (dimetil sulfóxido, Sigma, EE.UU.) en cada pocillo y agitando suavemente unos 15 minutos para disolver el formazano generado. La densidad óptica (DO) de los pocillos se midió en un lector de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) a 562 y 720 nm. La supervivencia de las células malignas se calculó mediante la ecuación (DO del fármaco bien la DO del pocillo del blanco /DO media del control del pozo - DO del pocillo testigo) x 100%. ensayo de MTT se realizó y se repite tres veces para cada dosis del fármaco (5 también) los resultados fueron analizados para obtener la media.
valor CI cálculo después de la terapia de combinación
CI (índice de combinación) se obtuvo por la fórmula de Chou-Talalay, se calculó a partir del valor de IC50 (Dm) comparó la eficacia y la curva de capacidad (el valor m). fórmula clásica del isobolograma (CI = 1) fue como sigue. CI =
D
1 | /
Dx 1 | +
D
2
/
Dx 2
denominador de (Dx) 1 y (Dx) 2 fueron indicar el porcentaje de citotoxicidad cuando son tratados con un solo fármaco por separado; numerador de (D) 1 y (D) 2 eran indican el porcentaje de citotoxicidad de cuando fueron tratados con ambos fármacos. Dx =
Dm fa /
1 | -
fa 1 | m
Dm es la dosis del efecto mediana (IC50), esta calculado por parcela del efecto medio de la intersección x desde el antilogaritmo. X
= log
D
frente Y
= log f

una
/
1 | - f

una
m es la pendiente de la gráfica del efecto medio. El análisis del efecto del fármaco múltiple utilizando Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido), fueron valores de m, Dm, Dx, e IC se calculan. (Dx) 1 y (Dx) 2 se calcularon utilizando la fórmula del efecto mediana Chou-Talalay. CI < 1, CI = 1, CI > 1 fueron llamados sinergismo, sumatoria, y los efectos de antagonismo, respectivamente análisis estadístico de evaluación

estadístico de los datos se realizaron utilizando el Student de dos colas t-test
(software SPSS 13.0; SPSS, Chicago, IL). . p
los valores inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) para múltiples comparaciones de grupo para determinar los posibles efectos antitumorales entre los grupos.
: Resultados de la expresión HER-2 /neu en líneas celulares de cáncer gástrico por FACS México La expresión de HER2 /neu proteína se analizó en tres líneas celulares de cáncer de estómago diferentes (YBC-2, YBC-3 y NCI-N87). La expresión de este proteinis 48% (débil), 55% (medio) y 88% (fuerte) en YBC-2, YBC-3 y NCI-N87, respectivamente. La expresión de esta proteína fue del 89% en la línea celular de cáncer de mama positivo SK-BR-3 y el 6% en la línea celular del tumor cerebral negativo U-87 MG (Figura 1). Figura 1 HER-2 /neu expresión en líneas celulares de cáncer gástrico. La expresión de la proteína HER2 /neu en todas las líneas celulares de cáncer se midieron por análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia. La expresión de HER2 /neu en tres líneas celulares de cáncer gástrico (YBC-2, YBC-3 y NCI-N87) fueron 48% (débil), 55% (medio) y 88% (fuerte), respectivamente. Todos los grupos de control de isotipo no eran más de 0,5% (datos no mostró). Como control positivo, SK-BR-3 de expresión del HER2 /neu es 89%. U-87 MG mostró menor expresión de HER2 /neu (6%) como control negetive. México La sensibilidad de la línea celular de cáncer de estómago a Herceptin y medicamento contra el cáncer y el análisis de la sensibilidad al tratamiento farmacológico solo in vitro
en un solo uso de Herceptin, la detención del crecimiento celular era débil e IC 50 no era detectable in vitro con la línea celular de cáncer de estómago (Figura 2). En contraste, los cuatro diferentes fármacos contra el cáncer (doxorubincin, cisplatino, paclitaxel y 5-FU) mostraron una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento celular y IC se detectó 50 (Tabla 1, Figura 2). Figura 2 quimiosensibilidad de Herceptin® y cuatro fármacos contra el cáncer en las líneas celulares de cáncer gástrico. En un solo uso de Herceptin, la detención del crecimiento celular era débil y no era detectable IC50 in vitro con la línea celular de cáncer de estómago. En contraste, los cuatro diferentes fármacos contra el cáncer (doxorubincin, cisplatino, paclitaxel y 5-FU) mostraron una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento celular y IC50 fue detectado.
Tabla 1 IC30 y IC50 de cinco agentes anti-cáncer contra YBC -2, YBC-3, NCI-N87, U-87 MG y SK-BR-3 líneas celulares
agentes anticancerosos
líneas celulares gratis (IC30) micras
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3
T-87 MG

Herceptin
82.36
11.83
1326.72
0.02
289.09
Doxorubicin
0.6
0.76
0.01
0.03
0.07
Cisplatin
1.79
21
9.28
14.54
2.58
Paclitaxel
0.52
6.45
0.86
0.19
0.3
5-FU
33.11
0.22
4.11
148.75
5.51
agentes contra el cáncer
líneas celulares (IC 50) M
YBC-2
YBC-3
NCI-N87
SK-BR-3 sobre U-87 MG
Doxorubicin
2.93
2.31
0.07
0.1
0.29
Cisplatin
4.51
30.73
45.86
5.65
20.63
Paclitaxel
1.24
9.61
1.49
0.42
0.79
5-FU
752.04
4.74
119.61
753.42
46.58
El efecto de la combinación de Herceptin y fármacos contra el cáncer Hoteles en la combinación de Herceptin y doxorubincin tratamiento, se observó el efecto sinérgico en las células NCI-N87 YBC-2 y, pero no en la línea celular YBC-3 que tiene débil expresión de HER2 /neu
proteína (Tabla 2, Figura 3a, P
< 0,05). En la combinación de Herceptin y cisplatino, se observaron los efectos sinérgicos en YBC-3 líneas de células SK-BR-3, NCI-N87 y (CI < 1, P
< 0,05). Sin embargo, se observaron los efectos inhibidores en las líneas 87-U MG celulares YBC-2 y (índice de combinación > 1, P
< 0,05) (Tabla 3, Figura 3b). El tratamiento de Herceptin y paclitaxel, en 87 U líneas de células MG YBC-3 y, se observaron los efectos inhibitorios (IC > 1), sin embargo, en la línea celular YBC-3, se observó el efecto sinérgico (CI < 1 , P
< 0,05). En líneas SK-BR-3 y NCI-87 de células, los efectos eran diferentes depende de la dosis de los fármacos (Tabla 4, Figura 3c). En la combinación de Herceptin y 5-FU, se observaron los efectos inhibidores en todas las líneas celulares (IC > 1, P
< 0,05) (Tabla 5, Figura 3d) .Tabla 2 valores calculados para la combinación Índice como un efecto inhibidor del crecimiento de tratamiento de combinación con Herceptin® y doxorrubicina en líneas celulares de cáncer gástrico
YBC-2
índice de combinación Valor
Parámetro (M)
drogas
ED50
Ed75
ED90
Dm
m
r
DOX
2,93 0,54

0,98
su
1.201,02
0,32 0,91

DOX + SU
0,09 0,05

0,03 0,25

0,74 0,96

Diagnóstico efecto combinado
sinergia
sinergia
sinergia
YBC-3
índice de combinación de parámetros Valor
(M)
Drogas
DE50 DE90
Ed75

Dm
m
r
DOX
2.310
0,768 0,946

su
46.063
0,623 0,970

DOX + SU
0,266 0,598

1.377 0.406

0,469 0,925

Diagnóstico efecto combinado
sinergia
sinergia
antagonismo
NCI-N87
índice de combinación de parámetros Valor
(m)
Drogas
DE50 DE90
Ed75

Dm
m
r
DOX
0.070
0,398 0,864

su
113350
0,191 0,635

DOX + SU
0,005
0,004 0,003

0.000
0,437 0,995

Diagnóstico combinado efecto de sinergia

sinergia
sinergia sobre U-87 MG
índice de combinación de parámetros Valor
(M)
Drogas
DE50 DE90
Ed75

Dm
m
r
DOX
0.295
0,620 0,997

HER
1845,5
0,457 0,860

DOX + SU
0,441 0,435

0,448 0,101

0,589 0,992

Diagnóstico combinado efecto de sinergia

sinergia
sinergia
SK-BR-3
índice de combinación de parámetros Valor
(M)
Drogas
DE50 DE90
Ed75

Dm
m
r
DOX
0,103 0,832

0,998
su
1424000
0,046 0,435

DOX + SU
0,046
0,074
0,117 0,005

0,616 0,985

Diagnóstico combinado efecto de sinergia

sinergia
sinergia
DOX
, doxorrubicina; HER
, Herceptin.
Figura 3 Índice de combinación como un efecto inhibidor del crecimiento de tratamiento de combinación con Herceptin® y agentes contra el cáncer. a. En la combinación de Herceptin y doxorubincin tratamiento, se observó el efecto sinérgico en las células YBC-2 y NCI-N87, pero no en la línea celular YBC-3. segundo. En la combinación de Herceptin y cisplatino, se observaron los efectos sinérgicos en YBC-3 líneas de células SK-BR-3, NCI-N87 y (CI < 1). Sin embargo, se observaron los efectos inhibidores en U-87 líneas de células MG YBC-2 y (CI > 1). do. El tratamiento de Herceptin y paclitaxel, en 87 U líneas de células MG YBC-3 y, se observaron los efectos inhibitorios (IC > 1), sin embargo, en la línea celular YBC-3, se observó el efecto sinérgico (CI < 1 ). En líneas SK-BR-3 y NCI-87 de células, los efectos eran diferentes depende de la dosis de los fármacos. re. En la combinación de Herceptin y 5-FU, se observaron los efectos inhibidores en todas las líneas celulares (IC > 1).
Tabla 3 Los valores calculados para el índice de combinación como un efecto inhibidor del crecimiento de tratamiento de combinación con Herceptin® y cisplatino en el cáncer gástrico líneas celulares
YBC-2
índice de combinación Valor
Parámetro (M) guía empresas de Drogas
ED50

Ed75
ED90
Dm
m
r
CDDP
4.512
0,921 0,882

su
1.201,0
0,316 0,915

CDDP + SU
1.375 2.707

5.337 2.232

0,587 0,965

Diagnóstico combinado efecto
antagonismo
antagonismo
antagonismo
YBC-3
índice de combinación de parámetros Valor
(M)
Drogas
DE50 DE90
Ed75

Dm
m
r
CDDP
30.733
2.227
0,929
su
46.063
0,623 0,970

CDDP + HER
0,274 0,110

0,054
12.091
1,472 0,998

Diagnóstico efecto combinado
sinergia
sinergia
sinergia
NCI-N87
Índice de combinación Valor Parámetro
(m)
Drogas
DE50 DE90
Ed75

Dm
m
r
CDDP
45.86 0.53

0,93
su
1.13E + 05
0,19 0,63

CDDP + SU
0,03 0,01

0,01 0,83

0,88
0,96
Diagnóstico efecto combinado
sinergia
sinergia
sinergia sobre U-87 MG
índice de combinación de parámetros Valor
(M)
Drogas
ED50
Ed75
ED90
Dm
m
r CDDP
5,65 1,08

0,98
su
1.845,53
0,46
0,86
CDDP + SU
9.18 9.85

10,58
2,56
1.01 0.99

Diagnóstico efecto combinado
antagonismo
antagonismo
antagonismo
SK-BR-3
índice de combinación de parámetros Valor
(m)
Drogas
DE50 DE90
Ed75

Dm
m
r</sup></sub>