MYC, FBXW7 in TP53 kopiranje variacije številko in izražanja želodčnega raka

MYC, FBXW7
in TP53
kopiranje variacije številko in izražanja v Rak želodca
Abstract
Ozadje
myc deregulacijo je pogost pojav v želodcu rakotvornosti običajno kot posledica genske ojačevanje, kromosomskih premestitev ali posttranskripcijske mehanizmi. FBXW7
je-p53 nadzorom tumor-supresorski, ki igra pomembno vlogo pri regulaciji izstopa celičnega ciklusa in ponoven prek degradacije myc.
Metode
smo ocenjevali myc
, FBXW7
in TP53
število kopij, ravni mRNA in proteina izražanje pri raku želodca in seznanjenih ne-neoplastične osebkov iz 33 bolnikih in tudi pri želodčnih adenokarcinom celičnih linijah. Ugotavljali smo tudi invazijo potencial želodčnega raka celičnih linijah.
Rezultati
MYC
pomnoževanje so opazili pri 51,5% vzorcev želodčnih tumorjev. Izbris en izvod FBXW7
in TP53
so opazili pri 45,5% in 21,2% želodčnih tumorjev oz. Myc
mRNA izraz je bil v tumorjih bistveno višja kot v ne-neoplastične vzorcev. FBXW7
in TP53
mRNA izraz je bil v tumorjih znatno nižja kot v parnih ne-neoplastične osebkov. Poleg tega je bil deregulacije MYC
in FBXW7
mRNA izraz povezan s prisotnostjo bezgavkah metastaz in tumorjev fazi III-IV. Poleg tega je bil MYC imunskim barvanjem pogosteje opazili v črevesju tipa kot želodcu raka difuzno tipa in je bila povezana z myc
mRNA izražanja. In vitro raziskave so pokazale, da je povečana MYC in zmanjšano FBXW7 izraz povezana z bolj invazivno fenotipa v želodcu raka celičnih linijah. Ta rezultat nas spodbujajo k raziskati aktivnost želatinaze MMP-2 in MMP-9 v obeh celičnih linijah. Oba želatinaze sintetiziramo pretežno stromalnih celic namesto rakavih celicah, in je bilo predlagano, da tako prispevajo k napredovanje raka. Smo opazili znatno povečanje MMP-9 aktivnosti v ACP02 primerjavi z ACP03 celic. Ti rezultati so potrdili, da imajo ACP02 celice večjo invazijo zmogljivosti kot ACP03 celic.
Zaključek
Na koncu lahko FBXW7 in MYC mRNA igrajo vlogo pri agresivnem biološkega vedenja želodčnih rakavih celic in je lahko uporaben kazalnik slabo prognozo. Poleg tega MYC je cilj kandidat za novih terapij proti raku želodca.
Ključne besede
rak želodca MYC FBXW7 TP53 Ozadje
raka želodca (GC) je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu [1]. GC se šteje za večjo skrb za javno zdravje, še posebej v državah v razvoju, vključno z Brazilijo [2].
Temeljni vidik rakotvornosti je širjenje nenadzorovano celic, ki izhajajo iz kopičenja sprememb, ki spodbujajo izražanje ali zatiranje celični cikel nadzora genov [3]. MYC
je transkripcijski faktor, ki sodeluje pri regulaciji celičnega cikla in rasti celic aretacijo, ki se običajno liberaliziranega v raka in je bila opisana kot ključni element želodca rakotvornosti [4, 5]. Več različnih vrst potranslacijske modifikacij myc so bili opisani, vključno s fosforilacijo, acetiliranjem in ubikvitinacije [6]. sistem ubikvitin-proteasoma je glavni degradacije proteina predpisani poti vključeni v kontrolo celične diferenciacije in rasti [7]. FBXW7
kodira F-box beljakovin podenoto je na Skp1 /Cul1 /F-box kompleksa (SCF) ubikvitin ligaza zapleteno. SCF FBXW7 povzroča degradacijo izdelkov pozitivnih celičnega ciklusa regulator genov, kot so ciklin E
, myc
, zareza
in JUN
preko fosforilacije odvisen od ubikvitinacije [8]. Med SCF FBXW7 podlagah, MYC je zlasti pomembno pri izstopu celičnega ciklusa, ker je mislil, da igrajo vlogo pri določanju, ali sesalske celice deliti ali ne [9].
Deregulirati FBXW7
izraz je glavni vzrok karcinogeneze [10-12]. Izguba FBXW7
izražanja lahko privede do myc čezmerni in je bilo povezano s slabo prognozo pri bolnikih GC [13]. Vendar MYC aktivacija s FBXW7
izguba sproži aktivacijo p53, ki ima ključno vlogo pri regulaciji celične odzive na poškodbe DNK in nenormalno ekspresijo onkogenov. Indukcija ustavitev celičnega cikla p53 omogoča popravilo DNA ali apoptoze indukcijo [14]. Tako je sočasna izguba FBXW7
in TP53
nujno za ustvarjanje genetske nestabilnosti in tumorigeneze [11].
V tej študiji smo raziskovali myc
, FBXW7
in TP53
gen obrazec številka spremembe in mRNA in izražanje beljakovin v vzorcih GC in želodčnih adenokarcinom celičnih linij. so bili ocenjeni tudi možne vezi med našimi ugotovitvami in clinicopathological funkcije in /ali invazijo in migracije zmožnosti celičnih linij.
Metode
kliničnih vzorcih
Vzorci so bili pridobljeni od 33 bolnikov, GC, ki so doživeli kirurško zdravljenje na João University Hospital de Barros Barreto v Pará državi, Brazilija. Seciramo tumor in paru non-neoplastične vzorce tkiva smo takoj reši iz želodca in zamrznemo v tekočem dušiku, dokler ekstrakcijo RNA.
Clinicopathological značilnosti vzorcev pacientov so prikazani v tabeli 1. GC vzorcih so bile razvrščene po Lauren [15] . Vsi vzorci GC je pokazala prisotnost Helicobacter pylori
in faktor cagA virulence je bil določen z analizo PCR sečnine
in cagA
kot ga Clayton et al
opisano. [16] in Covacci et al.
[17], v tem zaporedju. Vsi bolniki so imeli negativne zgodovine izpostavljenosti bodisi kemoterapije ali radioterapije pred operacijo, in ni bilo druge pomožne pojavih diagnozo raka. Privolitev z odobritvijo etiko Zvezne Univerze Pará je obtained.Table 1 MYC, sprememba FBXW7 in TP53 gen število kopij, MYC in protein p53 izražanja in clinicopathological značilnosti 33 bolnikih GC
CNV myc

CNV FBXW7

CNV TP53

IHC myc
IHC p53
2 kopiji (n = 16)
≥ 3 kopije (n = 17)
p- vrednost
2 kopiji (n = 18)
1 kopija (n = 15)
p- vrednost
2 kopiji (n = 25)
1 kopija (n = 7)
p - vrednost
P (n = 19)
N (n = 14)
p- vrednost
P (n = 6)
N (n = 25)
p- vrednost
Age (y) (povprečje ± SD)
> 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2)
9
5
6
8
10
4
10
9
2
17
Spol
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10
12
6
8
10
5
13
Histopatologija
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9
1
3
8
1
10
Globina tumorske invazije
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
limfnega vozla metastaze
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10
10
15
4
13
7
5
15
Stage
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11
4
8
7
4
11
myc IHC
Negative
5
8
0,481
7
6
1.000
11
2
0,671
Positive
11
9
11
9
14
5
p53 IHC
Negative
14
12
0,398
14
12
1.000
21
4
0.157
pozitivna
2
5
4
3
4
3
* p
< 0,05; P: pozitivno; N:. negativna
celičnih linij
želodcu adenokarcinom celične linije ACP02 in ACP03 [18] smo kultivirali v popolni RPMI mediju (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, ZDA), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS), 1% penicilin /streptomicina in 1% kanamicin-.
število Kopiraj variacije (CNV)
DNK smo ekstrahirali z uporabo DNAQiamp mini kit (Qiagen, Hilden, Nemčija), v skladu z navodili proizvajalca. Duplex kvantitativni PCR v realnem času (real-time qPCR) je bila izvedena s pomočjo FAM /MGB-označenih TaqMan sonde za myc
(Hs01764918_cn), FBXW7
(Hs01362464_cn), ali TP53
(Hs06423639_cn), in VIC /Tamra označenih TaqMan CNV RNase P
(Ƹ3326) je bila uporabljena za notranje kontrole. Vse v realnem času qPCR reakcije so bile izvedene v štirih izvodih z gDNA po protokolu proizvajalca z uporabo 7500 Fast Real-Time sistem PCR (Life Technologies, Foster City, CA, ZDA). Število kopija vsakega vzorca je bila ocenjena z analizo CNV uporabo Kopiraj klicatelja Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, ZDA). Znan človeške genomske DNA (Promega, Madison, ZDA) je bil uporabljen za kalibracijo.
Kvantitativno realnem času reverzne transkriptaze PCR
Total RNA je bila vzeta s TRI Reagent ® Rešitev (Life Technologies, Carlbad, CA, ZDA ) po navodilih proizvajalca. Koncentracija in kakovost RNA smo določili s pomočjo NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, ZDA) in 1% agarozni geli. Komplementarna DNA (cDNA) smo sintetizirali s pomočjo High-Capacity cDNA Archive kit v skladu s priporočili proizvajalca (Life Technologies, Foster City, CA, ZDA). Realnem času qPCR temelji in TaqMan sonde ciljanje myc
(Hs00153408_m1), FBXW7
(Hs00217794_m1), in TP53
(Hs01034249_m1) so bile kupljene kot Izdelki Testi-on-Demand za izražanja genov ((Life Technologies, . Foster City, CA, ZDA) v realnem času qPCR je bila izvedena z uporabo ABI Prism 7500 sistem (Life Technologies, Foster City, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca GAPDH
(NM_002046.3;. Življenje Technology, ZDA) je bil izbran kot notranjega nadzora za spremljanje vnosa RNA in nazaj učinkovitost prepisu. Vse v realnem času qPCR reakcije na ciljnih genov in notranjih kontrol bile izvedene v treh izvodih na isto ploščo. relativna kvantifikacija (RQ) izražanja genov smo izračunali s pomočjo ΔΔCt metoda [19], v katerem je bil ne-neoplastične vzorec označi kot kalibratorja za vsak seznanjem tumorja vzorca.
Imunohistokemija
Imunohistokemijsko analize za myc in p53 smo izvedli na,-parafin vgrajeni kirurških oddelkih, formalin določen. so bili uporabljeni serijske 3 Lun sekcije. Nalaganje antigen toplotno povzroča bil zaposlen (mikroprocesorsko nadzorom tlaka Pascal ® DakoCytomation, CARPINTERIA, CA, ZDA). Univerzalna peroksidazo konjugirano komplet sekundarna protitelesa (LSAB sistem, DakoCytomation, Carpinteria, CA, ZDA) smo uporabili za detekcijo s diaminobenzidine (DAB) kot kromogena. Uporabljena so bila naslednja primarna protitelesa: miška monoklonskih protiteles, usmerjenih proti myc (redčenje 1: 150; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, ZDA in klon 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, ZDA) , FBXW7 (redčenje 01:50, Abnova Corp., Taipei City, Tajvan) in p53 (redčenje 01:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, ZDA). Pozitivna izražanje proteina je bila opredeljena kot jasen jedrske barvanjem v več kot 10% celic.
Migracije in invazije test
migracije in invazijo testi so bili opravljeni v spremenjeni Boyden komori s filtrirnimi vložki (8 Lun pore) za 12-jamicami (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA). Oceniti invazijo so filtri prevlečeni z 10 ul v Matrigel (10-13 mg /ml) (BD bioznanosti, San Jose, CA, USA), medtem ko na ledu. Celice (2 x 10 5) smo nanesli v zgornjo komoro v 1 ml RPMI brez FBS. Spodnja komora smo napolnili z 1,5 ml RPMI z FBS. Po 48 urah v kulturi, smo celice določena s 4% paraformaldehidom in-pošti fiksno z 0,2% kristal vijoličnim v 20% metanola. Celice na zgornji strani filtra, vključno s tistimi v Matrigel smo odstranili z bombažno krpico. Vdrla celice (na spodnji strani filtra) smo fotografirali in prešteti. Poskuse smo izvedli v treh izvodih.
Imunofluorescenco
celice gojijo v steklenih coverslips bila določena z 1% paraformaldehidom v fosfatnim pufrom (PBS), 10 minut, nato permeabiliziramo z 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) v PBS 15 minut in blokirali z 1% goveji serumski albumin (BSA) v PBS. Celice smo obarvali s protitelesi mišje proti MYC (razredčili 1:50; Zymed ®, ZDA), p53 (razredčili 1:50, DakoCytomation, Carpinteria, CA, ZDA) in FBXW7 (razredčili 1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Tajvan). Primarna protitelesa smo razkrili s pomočjo anti-miš Alexa-568-konjugiranimi sekundarna protitelesa (Invitrogen). Vse inkubacije smo izvedli v 60 minutah pri sobni temperaturi. Jedra smo obarvali z DAPI v podaljšali anti-zbledi zaščitnim sredstvom (Invitrogen). Negativni kontrolni vzorci so bili obdelani, kot je opisano zgoraj, razen je bilo, da so primarni protitelesa izpusti in nadomesti samo s PBS.
Blotting
ekstrakcijo Western beljakovin iz celic je bila izvedena v skladu s standardnimi postopki. Na kratko, je skupna protein pridobljen iz celic ACP02 in ACP03 pomočjo 50 mM Tris-HCl pufru, ki vsebuje 100 mmol /L NaCI, 50 mM NaF, 1 mM navo 4, 0,5% NP-40, in popolna koktajl inhibitor proteaze (Roche , Nemčija). koncentracija proteinov je bila ocenjena s pomočjo Bradford testom (Sigma-Aldrich). Okoli 30 mikrogramov skupne ekstrakta proteina smo nanesli na 12% natrijev dodecil sulfat, poliakrilamid gelska elektroforeza (SDS-PAGE) gelu in elektroforezo. Rešene proteine ​​smo nato prenesli iz gela na nitrocelulozno membrano. Membrana je bila blokirana s 5% nemastnim mlekom v Tris-pufrom, ki vsebuje 5% Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, ZDA) in nato inkubirali z miško monoklonsko anti-myc (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei City, Tajvan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, ZDA) in anti-β-aktin (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, ZDA) protitelesa razredčimo 1: 200, 1: 100, 1: 100 in 1: 2000 oz. Nato smo membrane inkubirali z 1: 5000 razredčitvijo s hrenovo peroksidazo (HRP) označenih s ovac protitelesa proti mišjim (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 1 uro pri sobni temperaturi. Beljakovine so vidne tudi z okrepljenim kemiluminescence.
Cimografijo
ACP02 in ACP03 celice (5 × 10 4 od vsakega) smo nanesli in pustimo, da držijo in širjenje vsaj 8 ur. Adherentne celice izperemo trikrat s PBS in kulturni medij bil nadomeščen z medija za 24 ur brez seruma. Aktivnost MMP2 in MMP9 v kondicioniranega medija je bila ocenjena s cimografijo. Pogojeni medija zberemo, koncentriramo (Microcon 30 K Merck Millipore, Darmstadt, Nemčija) in ponovno suspendiramo v SDS-PAGE pufru vzorca (brez beta-merkaptoetanola). Preostale celice smo lizirali in koncentracijo proteina smo ocenili s pomočjo BCA testa (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Skupaj 1 ug beljakovin iz vsakega kondicioniranega medija smo ločili na 10% poliakrilamidnih gelih, ki vsebujejo 0,2% želatine. Po elektroforezi so bili geli sprali v 2,5% Triton X-100 za 30 minut, nato uravnotežen v 10 mM Tris (pH 8,0) ter inkubiramo pri 37 ° C za 16-24 ur v razvojnem pufra, ki vsebuje 50 mM Tris (pH 8,0 ), 5 mM CaCl 2, in 0,02% NaN 3. Geli smo obarvali z 0,2% Coomassie modrim R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) ter razbarvamo z 1: 1 ocetne raztopine kisline /metanola. Poskuse smo izvedli v treh izvodih. Zymographic trakovi, ki kažejo na MMP aktivnosti, so bili ovrednoteni s skeniranjem denzitometrijo.
Statističnih analiz
je normalnost variabilno porazdelitev določi s testom Shapiro-Wilk. Združenja med myc
, FBXW7
in TP53
kopiranje variacije številko, raven mRNA, izražanje proteinov, clinicopathological značilnosti in celično invazijo in migracije sposobnost smo analizirali s hi-kvadrat (χ 2) in Mann-Whitney testov. Korelacija med ekspresijo bila določena z uporabo Spearman testu, v katerem je vrednost pod 0,3 navedeno šibko korelacijo različnih ciljnih mRNA, 0,3-0,7 navedeno mediju korelacijo, in vrednosti nad 0,7 kaže na močno korelacijo. Podatki so prikazani kot srednjo in interkvartilni območju; P vrednosti, manjše od 0,05, so bile obravnavane pomembne.
Rezultati PODJETJA
tumorja želodca vzorci pokazali, ojačitve myc
in izbris FBXW7
in TP53
tri ali več izvodov myc
ugotovljeno je bilo pri 51,5% (17/33) na želodcu tumorskih celic. V nasprotju s tem, 45,5% (15/33) in 21,2% (7/33) želodčnih tumorskih celic vsebuje le en izvod FBXW7
in TP53
oz.
Pridružitvi med clinicopathological funkcij in myc
, je FBXW7
in TP53
številko izvoda povzeti v tabeli 1. Ena želodca tumorja, ki vsebuje tri kopije TP53
je bila izključena iz analize hi-kvadrat. Ne Povezave med spremembo števila kopij genov proučevanih in clinicopathological funkcije.
MYC
mRNA izraz je bil v tumorjih višja kot v ne-neoplastične primerkov, medtem ko FBXW7
in TP53
je mRNA izraz nižje v tumorju osebki
nivo ekspresije myc
mRNA (2,01 ± 1,72 krat spremembe) v vzorcih tumorskih tkiv je bila bistveno višja kot pri ne-neoplastične tkivu (p = 0,0002), medtem ko je na ravni ekspresije FBXW7
mRNA (0,53 ± 0,40 krat spremembe) in TP53
mRNA (0,84 ± 0,55 krat spremembe) v vzorcih tumorskih tkiv je bila precej nižja kot v ne-tumorska tkiva (p < 0,0001 in p = 0,0011, v tem zaporedju). Nismo našli pomembno povezanost med myc
, FBXW7
in TP53
mRNA izražanja (MYC
/FBXW7
mRNA r = -0,3464, p = 0,0562; MYC
/TP53
mRNA r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7
/TP53
mRNA r = -0,0745, p = 0,4747). Tako je bila odkrita le težnja k korelacija med povečanjem myc
mRNA izražanja in zmanjšanje FBXW7
mRNA izražanja.
Tabeli 2 so povzeti povezav med različnimi clinicopathological značilnosti in RQ v myc
, FBXW7
in TP53
mRNA izraz v tumorju in v parih, non-neoplastične primerki. Povečanje myc
nivoju mRNA je povezano s prisotnostjo bezgavk metastaze (p = 0,016) in GC stadiju tumor III-IV (p = 0,036). Znatno zmanjšanje FBXW7
ravni mRNA je bila povezana tudi z metastazami na prisotnost bezgavk (p = 0,015) in tumorja fazi III-IV (p = 0,008) .table 2 MYC, stopnje izraženosti FBXW7 in TP53 mRNA in clinicopathological dejavniki 33 bolnikih z želodčnim rakom
n (%)
MYC
p- vrednost
FBXW7

p- vrednost
TP53
p- vrednost
mediana ± IQR
mediana ± IQR
mediana ± IQR
Starost (y) (povprečje ± SD)
> 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%)
2,04 ± 1,35
0.8873
0,55 ± 0.37
0,9247
0,86 ± 0,62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%)
1,44 ± 4,88
0,53 ± 0,50
0,94 ± 1,65
Spol
Male
15 (45,5%)
2,01 ± 1,01
0,4065
0,53 ± 0,22
0,6353
0,89 ± 0,58
0,8125
Ženski
18 (54,5%)
1,67 ± 2,03
0,56 ± 0,56
0,87 ± 0,69
histopatologijo
črevesne
22 (66,7%)
2,06 ± 0,99
0,3525
0,53 ± 0,16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
razpršenih
11 (33,3%)
1,40 ± 2,32
0,77 ± 0,74
0,94 ± 0,38
Globina tumorska invazija
T1
6 (18,2%)
0,89 ± 0,47
0.0857
0,88 ± 0,58
0,0678
0,85 ± 0,15
0.7069
T2-T4
27 (81,8%)
2,08 ± 1,42
0,53 ± 0,43
0,91 ± 0,79
limfnega vozla metastaze
odsoten
13 (39,4%)
0,98 ± 1,09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0,84 ± 0,44
0,6121
Predstavite
20 (60,6%)
2,10 ± 2,20
0,46 ± 0,38
0,94 ± 0,79
Stage
I-II
18 (54,5%)
1,39 ± 1,23
0.0362 *
0,57 ± 0,38
0.0380 *
0,83 ± 0,55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2,41 ± 2,79
0,34 ± 0,45
0,96 ± 1,19
MYC IHC
Pozitivni
20 (60,6%)
2.18 ± 1.59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0,81 ± 0,57
0,1372
negativno
13 (39,4%)
0,89 ± 0,85
0,58 ± 0,53
0,99 ± 0,90
p53 IHC
pozitivno
7 (21,2%)
4,25 ± 6,53
0.0891
0,64 ± 0,68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
Negativni
26 (78,8%)
2,00 ± 1,44
0,55 ± 0,35
0,87 ± 0,60
* p
< 0,05; IQR. Interkvartilni je obseg
jedrsko MYC protein obarvanje povezano s črevesno tipa GC
Pozitivna barvanjem za jedrsko myc in p53 je bilo v 64,5% (20/31) in 19,4% (6/31) vzorcev GC oziroma (Slika 1). Ne pozitivnost je bilo za FBXW7. Tabela 1 povzema clinicopathological značilnosti in myc in rezultate p53 imunskim barvanjem. Izražanje myc bila pogostejša v črevesju tipa kot difuzno tipa GC (p = 0,007). Poleg tega je bil MYC imunskim barvanjem povezana s povečanim myc
ravni mRNA (p = 0,0022). Ne Povezave med p53 imunskim barvanjem in clinicopathological značilnosti, TP53
številu kopij, ali TP53
mRNA izražanja. Slika 1 Imunohistokemično analiza myc in izražanje p53 protein GC. (A) Negativni MYC imunskim barvanjem v difuzna tipa GC; (B) MYC imunski pozitivnost na črevesno tipa GC; (C) Pozitivni p53 imunskim barvanjem v difuzna tipa GC; (D) P53 imunskega pozitivnosti v črevesnih tipa GC (povečava × 40).
Primerjava ACP02 in ACP03 celičnih linij
Nobene ACP02 in ACP03 celice vsebovala tri myc
kopije in samo en FBXW7
kopijo . Število TP53
izvodov je bil določen v obeh celičnih linijah. V primerjavi z mRNA izražanja v ACP03 celicah, ACP02 celice izražajo višjo stopnjo myc
(1,34-krat) in nižjih ravneh FBXW7
in TP53
mRNA (0.62- in 0,73-krat).
Western blot analiz so pokazali, da je bila MYC izraz bistveno višja v ACP02 celicah kot ACP03 celic (p = 0,048). Poleg tega je bila FBXW7 izraz bistveno nižja v ACP02 celicah kot ACP03 celic (p = 0,049). Vendar pa ni bilo bistvene razlike v p53 izražanja med celičnih linij (p = 0,077) (Slika 2A-B). Analiza
Imunofluorescenčni obeh proteinov pokazala točkaste vzorec označevanja, podpirati zahodni rezultate popivnamo, ki kažejo povečanje MYC in zmanjšanje FBXW7 ekspresijo v celicah ACP02 primerjavi z ACP03 (slika 2). Vdora v Matrigel Rezultati Test je pokazal, da so ACP02 celice bolj invazivna, kot ACP03 celic (p = 0,001). Rezultati migracije Test je pokazal, da manj ACP02 celice migrira v primerjavi z ACP03 celic (p = 0,0028) (slika 2C-D). Slika 2 MYC, FBXW7 in p53 izraz, migracije in invazije sposobnost v ACP02 in ACP03. (A) Graf kažejo povprečje ± SD v myc FBXW7 in izražanja p53 beljakovin v ACP02 in ACP03. Ti proteini smo normalizirali na raven beta aktina; (B) predstavlja podatke, myc, FBXW7 in izražanja p53 beljakovin; (C-D) Grafi prikazujejo povprečje ± SD migracije in invazivnih celic treh izvodih test; (E) Reprezentativni rezultati myc FBXW7 in p53 imunofluorescenco
Tako ACP02 in ACP03 celice predstavljeni štirje pasovi dejavnosti gelatinaza:. MMP-9 latentno (92 kDa), MMP-9 aktivni (88 kDa), MMP-2 latentni ( 72 kDa), in MMP-2 aktivna (66 kDa) (slika 3). Ugotovili smo, ni bistvenih razlik v MMP-9 latentno (p = 0.9788), MMP-2 aktivna (p = 0,7848) in MMP-2 latentno (p = 0,1678) med ACP02 in ACP03 celic. Vendar pa so bile ugotovljene pomembne razlike med ACP02 in ACP03 celic glede na MMP-9 aktivni (p = 0,0182). Slika 3 predstavnika analizo želatina cimografijo za MMP-2 in MMP-9 aktivnosti v ACP02 in ACP03. (A) Trakovi ustrezajo obema latentne in aktivne oblike MMP-2 in MMP-9 so pri ACP02 in ACP03 opazili. Denzitometrična analize so pasovih ustrezajo latentnih in aktivnih oblik MMP-2 (b) in MMP-9 (C).
Razprava
V trenutni študiji, smo ugotovili, da MYC
je povečalo mRNA izraz v vzorcih GC primerjavi z ustreznim ne-neoplastične vzorcev. Poleg tega, da nam je znano, da je to prva študija, da poročajo o pridružitvi med povečano myc
mRNA izražanja in prisotnost bezgavk metastaz in CG fazi III-IV, krepi idejo, da je myc
deregulacija močan dejavnik za malignosti v PK.
Adams et al
. [20] in Leder et al.
[21] je pokazala, da lahko myc
mRNA izraz deregulacija spodbuja razvoj raka na transgenih modelov miši. Povečanje myc
ravni mRNA v človeških raka lahko posledica neposrednih in posrednih mehanizmov, ki bi lahko več razlag. Prvič, myc
pomnoževanje je najpogostejši mehanizem myc
deregulacije v PK [5]. Ta mehanizem vodi do povečane proizvodnje onkogenih proizvodov v količinah, ki presegajo transkripcijsko sposobnost normalnega dvojnega gena kopiranjem. Tu smo opazili tri ali več myc
genske kopije v 51,5% želodca tumorji osebkov. Prejšnje študije iz naše skupine je tudi pokazala, da je bil prisoten v vseh vzorcih GC pregledanih od posameznikov v severni Braziliji, pa tudi v celičnih linijah GC, ki jih myc
pomnoževanje ali trisomija kromosoma 8, na kateri se nahaja MYC
, naša skupina iz tumorjev brazilskih bolnikov [18, 22-27]. Prisotnost myc
ojačanja so poročali tudi v vzorcih plazme od posameznikov z GC [28]. Vendar pa ni neposredne povezave med myc
kopirati sprememba števila in mRNA izraz je bila odkrita v tej študiji.
Drugič, povečanje myc
ekspresijo mRNA lahko posledica doslednega rekombinacijo med imunoglobulinov (Ig) locus in MYC
onkogena. Ta pojav je pogosto opisan v limfoma Burkittovega in je povezana z daljšo razpolovno dobo myc
mRNA v prizadetih celicah [29]. Pred tem je naša raziskovalna skupina opazili myc
vstavljanja v difuzna tipa GC predvsem v kromosomov, ki so preslikani v genih imunoglobuline (kromosomi 2, 14 in 22) [26]. Tako lahko kromosomske prenosi vključujejo myc
locus (8q24) v difuzna tipa CG pri posameznikih iz severne Brazilije odraža tudi povečanje myc
ravni mRNA.
Imunohistokemija analiza (IHK) je pokazala, da je MYC izraz pogosteje najdemo v črevesnih tipa GC kot GC osebkov razpršeno tipa. Te spremembe lahko privede do nenormalnega myc proteina, ki je po eni izmed protiteles, ki se uporabljajo v tej študiji ni priznano. Poleg tega smo ugotovili povezavo med myc
ravni mRNA izražanja in myc barvanje. Poleg tega posttranscriptional mehanizmi nadzora v myc stabilnost [6, 30]. Myc
deregulacija je bila povezana z izgubo FBXW7
, ki haploinsufficient zaviralnih genov. Na splošno lahko FBXW7
izguba posledica izgube heterozigotnosti (LOH) in mutacijo [30]. Izguba pri 4-kvadrantnem, v FBXW7
locus, je ponavljajoča kromosomske spremembe v GC [31, 32], in FBXW7
mutacije so bili ugotovljeni v 3.7-6% želodčnih tumorjev [12].
V ta študija, smo opazili le eno kopijo FBXW7
gena v 45,16% od želodca tumorjev raziskano. Zanimivo je, da je FBXW7
mRNA izraz v vzorcih GC izrazito znižala v primerjavi z ustreznimi ne-neoplastične tkivo. Poleg tega je FBXW7
mRNA izraz deregulacija povezano s prisotnostjo bezgavkah metastaze in fazo GC III-IV, kot je bilo opaziti tudi pri myc
mRNA. Te ugotovitve potrjujejo delo Yokobori el al.
[13], ki je pokazala tudi povezavo med zmanjša FBXW7
mRNA izražanja in bezgavk metastaze, ki prispeva k maligni potencial GC celic in ima za posledico slabo prognozo. Poleg tega smo ugotovili, da je izraz myc
in FBXW7
mRNA večinoma se obratno korelirana v tej študiji.
Številne študije so pokazale, da MYC
deaktivacijo zatira tumorje pri živalih, kar pomeni, da MYC
lahko molekularni tarča pri zdravljenju raka [33-35]. Druga možnost je, Souček et al
. [36] predlagala, da bi FBXW7 olajšanje "tumorja mirovanja terapijo". Tako, myc degradacija FBXW7 lahko ne le povzroči stanje tumorja mirovanja, vendar lahko imajo tudi učinek anti-tumor. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Helicobacter pylori okužbe in v obtoku ravni ghrelin - Sistematična review
• "Fast track" rehabilitacija po želodca resekcijo raka: izkušnje z 80 zaporednih primerih