Myc, FBXW7 i TP53 broj kopija varijacije i izražavanje u želučanom Cancer

myc, FBXW7 pregled i TP53 pregled kopirati broj varijacija i izraz u raka želuca pregled apstraktne pregled pozadine
myc deregulacije je čest događaj u želuca karcinogeneze, obično kao posljedica gena povećavanje kromosomske translokacije ili posttranslacijskih mehanizmima. FBXW7 pregled je p53 kontrolirana tumor-supresor koji igra ulogu u regulaciji staničnog ciklusa izlaska i ponovnog ulaska preko degradacije myc.
Metode pregled smo ocijenili myc
, FBXW7 pregled i TP53
broj kopija, razine mRNA i ekspresiju proteina u karcinomu želuca i upareni non-neoplastičnih uzoraka iz 33 bolesnika i u želučanim adenokarcinoma staničnim linijama. Također smo odredili invazije potencijal želučanih staničnim linijama karcinoma. pregled Rezultati pregled myc pregled pojačanje zabilježena je u 51,5% uzoraka želučane tumora. Brisanje jedne kopije FBXW7 Netlogu i TP53 Netlogu zabilježena je u 45,5% i 21,2% želučanih tumora, respektivno. Myc pregled mRNA bila je značajno viša u tumorima nego u ne-maligne uzoraka. FBXW7 pregled i TP53 pregled mRNA bila je znatno niža u tumorima nego uparenih ne-maligne primjeraka. Štoviše, deregulirano myc pregled i FBXW7 pregled ekspresija mRNA je povezana s prisutnošću limfnih čvorova metastaza i tumora stadij III-IV. Osim toga, myc imunološko je češća kod crijevnih tipa nego difuzne tipa želučanog karcinoma i bio je povezan s myc
mRNA ekspresije. In vitro istraživanja su pokazala da povećana myc i smanjuje ekspresiju FBXW7 povezana s više invazivni fenotipa u želučanom staničnim linijama raka. Ovaj rezultat potaknuo nas je ispitati aktivnost želatinaze MMP-2 i MMP-9 u obje stanične linije. Oba želatinaze sintetizirani su pretežito stromalnih stanica nego stanica karcinoma, i to je predloženo da su pridonose napredovanju raka. Zapaženo je da je značajno povećanje aktivnosti MMP-9 u odnosu na ACP02 ACP03 stanicama. Ovi rezultati potvrđuju da ACP02 stanice imaju veću sposobnost invazije nego ACP03 stanica. Pregled Zaključak
U zaključku, FBXW7 i myc mRNA mogu igrati ulogu u agresivnom biološkom ponašanju želučanih stanica raka, a može biti koristan pokazatelj lošu prognozu. Nadalje, myc je meta kandidat za nove terapije protiv raka želuca. Pregled Ključne riječi pregled Rak želuca myc FBXW7 TP53 Pozadina pregled, karcinoma želuca (GC) je četvrti najčešći karcinom i drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu [1]. GC smatra glavni javni zdravstveni problem, posebno u zemljama u razvoju, uključujući Brazil [2].
Temeljni aspekt karcinogeneze je nekontrolirane proliferacije stanica uslijed nakupljanja promjena koje promiču izraz ili potiskivanje staničnog ciklusa za kontrolu gena [3]. Myc pregled je transkripcijski faktor koji su uključeni u regulaciji staničnog ciklusa i zaustavljanje rasta stanica koje se obično deregulirano u raka, te je opisan kao ključni element želučane karcinogeneze [4, 5]. Nekoliko vrsta posttranslacijskih modifikacija myc su opisani, uključujući fosforilacije, acetilaciju i ubikvitinacija [6]. Ubikvitina-proteasomalni sustav je glavni degradacije proteina regulatorni put sudjeluje u staničnom diferencijacijom i rasta kontrolu [7]. FBXW7 pregled kodira F-box proteina podgrupu Skp1 /Cul1 /F-box kompleksa (SCF) ubikvitina ligaze složeni. SCF FBXW7 uzrokuje degradaciju proizvoda pozitivnih staničnog ciklusa regulator gene, kao što su ciklin E Netlogu, myc Netlogu, usjek Netlogu i jun Netlogu putem fosforilacije ovisne ubiquitination [8]. Među SKF FBXW7 podlogama, myc je od posebne važnosti u izlazu staničnog ciklusa, jer je mislio da igraju ulogu u određivanju je li podijeliti stanice sisavaca ili ne [9]. Pregled, deregulirano FBXW7 pregled, izraz je glavni uzrok karcinogeneze [10-12]. Gubitak FBXW7 pregled ekspresije mogu dovesti do prekomjerne ekspresije myc i povezana je s lošom prognozom u GC bolesnika [13]. Međutim, myc aktiviranja FBXW7 pregled gubitak izaziva aktivaciju p53, koji igra ključnu ulogu u regulaciji staničnog odgovora na oštećenja DNA i poremećaj ekspresije onkogena. Izazivanje staničnog ciklusa p53 omogućuje popravak DNA ili indukcijom apoptoze [14]. Dakle, potrebna je istodobna gubitak FBXW7 Netlogu i TP53 Netlogu da potiču genetske nestabilnosti i nastanku tumora [11].
U ovoj studiji istraživali smo myc
, FBXW7
i TP53
broj kopija gena varijacija i mRNA i proteina izraz u GC uzoraka i želučanog adenokarcinoma staničnim linijama. Također su ocijenjeni Moguća povezanost između naših nalaza i kliničkopatološkim značajke i /ili invazije i migracijske sposobnosti staničnih linija.
Metode
kliničkim uzorcima
Uzorci su dobiveni iz 33 GC bolesnika podvrgnutih kirurškom liječenju u João Klinička bolnica de Barros Barreto u para državi, Brazil. Secirao tumora i upareni ne-maligne uzorci tkiva su odmah izrezati iz želuca i smrznuti u tekućem dušiku do ekstrakcije RNA.
Kliničkopatološka obilježja uzoraka bolesnika prikazani su u tablici 1. Uzorci GC su klasificirani prema Lauren [15] , Svi uzorci GC je pokazala prisutnost Helicobacter pylori pregled i faktor CAGA virulentnost određena je PCR analize uree
i CAGA
kako su opisali Clayton et al pregled. [16] i Covacci et al.
[17], redom. Svi su bolesnici imali negativne povijesti izloženosti ili kemoterapijom ili radioterapijom prije operacije, a nije bilo drugih co-pojava dijagnozom raka. Informirani pristanak uz odobrenje etičkog odbora Federalnog Sveučilišta Pará je obtained.Table 1 myc, FBXW7 i TP53 gen broj kopija varijacije, myc i p53 protein ekspresije i kliničkopatološkim značajke 33 GC pacijenata
CNV myc
pregled CNV FBXW7

CNV TP53

IHC myc
IHC p53
2 kopije (n = 16)
≥ 3 primjerka (n = 17)
p- vrijednost
2 kopije (n = 18)
jedan primjerak (n = 15)
p- vrijednost
2 kopije (n = 25)
jedan primjerak (n = 7)
p - vrijednost
P (n = 19)
N (n = 14)
p- vrijednost
P (n = 6)
N (n = 25)
p- vrijednost
Age (y) (srednja vrijednost ± SD) izvoznici > 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2) pregled, 9 pregled 5
6
8
10
4
10 pregled, 9
2 pregled, 17 pregled Spol
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8 pregled 10 pregled, 12 pregled 6
8
10 pregled 5
13 pregled Patohistološki
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6. pregled 5
9
1 pregled 3
8
1 pregled 10 pregled Dubina invazije tumora
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13 pregled, 14 pregled, 20 pregled 6
18 pregled, 9
6
21 pregled limfnih čvorova metastaze
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10 pregled, 10 pregled, 15 pregled, 4
13 pregled 7
5
15 pregled Stage
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6. pregled 9
11 pregled 4
8
7 pregled 4
11 pregled myc IHC pregled Negativna pregled 5
8 pregled 0,481 pregled 7
6
1,000 pregled 11
2 pregled 0,671 pregled Pozitivan pregled 11 pregled, 9
11 pregled, 9 pregled 14
5 pregled p53 IHC pregled Negativna pregled 14 pregled, 12 pregled 0,398 pregled 14 pregled, 12 pregled 1,000 pregled 21
4
0,157 pregled pozitivan pregled 2 pregled, 5
4 pregled 3
4 pregled 3 pregled * p izvoznici < 0,05; p: pozitivni, N:. negativna pregled staničnih linija pregled Želučani adenokarcinom stanične linije ACP02 i ACP03 [18] su kultivirane u kompletnom RPMI mediju (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1% penicilin /streptomicina i 1% kanamicin. pregled Copy broj varijacija (CNV) pregled DNA je ekstrahiran korištenjem DNAQiamp mini kit (Qiagen, Hilden, Njemačka) prema naputku proizvođača. Duplex kvantitativne real-time PCR (u stvarnom vremenu qPCR) provodi se uz FAM /MGB-označene TaqMan sondi za myc Netlogu (Hs01764918_cn), FBXW7 pregled (Hs01362464_cn) ili TP53 pregled (Hs06423639_cn) i VIC /TAMRA obilježeni TaqMan CNV RNA P pregled (.403.326) se koristi za unutarnju kontrolu. Sve u stvarnom vremenu qPCR reakcije su provedene u četiri primjerka sa gDNA prema protokolu proizvođača pomoću 7500 Fast PCR sustav u stvarnom vremenu (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Broj kopija svakog uzorka procjenjuje se CNV analizom pomoću Copy pozivatelja Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Poznat humanog genoma DNA (Promega, Madison, SAD) se koristi za kalibraciju.
Kvantitativnih realnom vremenu reverzne transkriptaze PCR pregled, ukupna RNA je ekstrahirana TRI Reagens ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, USA ) prema uputama proizvođača. Koncentracija i kvaliteta RNA određene su korištenjem NanoDrop spektrofotometar (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) i 1% agaroznom gelu. Komplementarne DNA (cDNA) je sintetiziran pomoću velikog kapaciteta cDNA Arhiva kompleta prema preporukama proizvođača (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Real-time qPCR primeri i TaqMan probe ciljanje myc
(Hs00153408_m1), FBXW7 pregled (Hs00217794_m1) i TP53 pregled (Hs01034249_m1) su kupljeni kao Testovi na zahtjev Proizvodi za Gene Expression ((Life Technologies, . Foster City, CA, USA) u realnom vremenu qPCR je izvedena pomoću ABI Prism 7500 sustav (Life Technologies, Foster City, CA, USA) u skladu s uputama proizvođača GAPDH
(NM_002046.3;. Život Tehnologija, USA) izabran je kao interna kontrola za praćenje unosa RNA i preokrenuti učinkovitost transkripcije. sve u stvarnom vremenu qPCR reakcije za ciljnih gena i unutarnjih kontrola izvode se u tri primjerka na istoj ploči. relativna kvantifikacija (RQ) ekspresije gena je izračunata pomoću ΔΔCt Postupak [19], u kojima ne-neoplastičnih uzorak je označen kao kalibrator za svaki upareni uzorku tumora. pregled Imunohistokemija pregled Imunohistokemijska analiza za myc i p53 su provedena na formalinom fixed, paraffin-embedded kirurških sekcija. Korišteni su serijski 3-um sekcije. Heat-inducirana dohvat antigen bio zaposlen (mikroprocesorski upravljan tlak Pascal ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Univerzalni Komplet sekundarnog protutijela konjugiranog s peroksidazom (LSAB sustav, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) za detekciju s diaminobenzidin (DAB) kao kromogen. Korišteni su sljedeći Primarna antitijela: miš monoklonska antitijela usmjerenih protiv myc (razrjeđivanje 1: 150; SC-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA i klon 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (razrjeđenje 1:50, Abnova Corp, Taipei City, Tajvan), i p53 (razrjeđenje 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Pozitivna ekspresija proteina je definiran kao bistro obojenje jezgre u više od 10% stanica. Pregled Migracijski test i invaziju pregled migracije i pokusima invazije provedene su u modificiranom Boydenove komore s filtarskim umecima (8 um pore) za 12 jamica (BD bioznanosti, San Jose, CA, USA). Za procjenu invaziju, filteri obložene su s 10 ul Matrigel (10-13 mg /ml) (BD bioznanosti, San Jose, CA, USA) dok na ledu. Stanice (2 x 10 5) su stavljene u gornjoj komori u 1 ml RPMI bez FBS. Donja komora se napuni s 1,5 ml RPMI s FBS. Nakon 48 sati u kulturi, stanice su fiksirane s 4% -tnim paraformaldehidom i naknadno obrađena s 0,2% kristalno ljubičastog u 20% metanola. Stanice na gornjoj strani filtera, uključujući i one u matrigelu, su bile uklonjene pamučnom krpom. Invazivnih stanica (na donjoj strani filtera) fotografirani su i broje. Eksperimenti su ponovljeni tri puta.
Imunofluorescencije pregled stanice uzgajane na pokrovnim stakalcima su fiksirane s 1% paraformaldehidom u fosfatno puferiranoj otopini soli (PBS), tijekom 10 minuta, zatim se natopljeni s 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) u PBS tijekom 15 minuta i blokirane s 1% albumina goveđeg seruma (BSA) u PBS-u. Stanice su obojene s mišjim protutijelima myc (razrijeđen 1:50; Zymed ®, USA), p53 (razrijeđen 1:50, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), te FBXW7 (razrijeđen 1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Tajvan). Primarna antitijela su pokazana upotrebom anti-mišjim Alexa-568-konjugiranog sekundarnog antitijela (Invitrogen). Sve inkubacije su provedene kroz 60 minuta na sobnoj temperaturi. Jezgre su obojene sa DAPI u produžiti montažu mediju protiv izbljeđivanja (Invitrogen). Uzorci Negativne kontrolne postupi se kako je opisano gore, osim što su izostavljeni i zamijenjeni sa samim PBS-om da Primarna antitijela.
Western blot-
ekstrakcija proteina iz stanica je izvedena u skladu sa standardnim postupcima. Ukratko, ukupni proteini se ekstrahira iz ACP02 i ACP03 stanica upotrebom 50 mM Tris-HCl puferu koji sadrži 100 mmol /L NaCl, 50 mM NaF, 1 mM NaVO 4, 0.5% NP-40, i kompletni koktel inhibitora proteaze (Roche Njemačka). Koncentracija proteina je određena pomoću Bradfordovog pokusa (Sigma-Aldrich). Oko 30 ug ukupne proteinskog ekstrakta je nanesen na 12% natrij dodecil sulfatom-poliakrilamid gel elektroforeze (SDS-PAGE), gel i elektroforetski. Riješen proteini potom su prenešeni iz gela na nitroceluloznu membranu. Membrana je bila blokirana s 5% nemasnog mlijeka u Tris-puferiranoj slanoj otopini koja sadrži 5% Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA), i zatim inkubirane s mišjim monoklonskim anti-myc (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei City, Tajvan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), i anti-β-aktin (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) antitijela razrijeđena u omjeru 1: 200, 1: 100, 1: 100 i 1: 2000, respektivno. Nakon toga, membrane se inkubiraju sa 1: 5000 razrijeđenja u peroksidazom iz hrena (HRP), koje je konjugirano ovčjeg anti-mišjeg antitijela (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Proteini su vizualizirani pojačane kemiluminiscencije. Pregled zimografiia pregled ACP02 i ACP03 stanice (5 × 10 4 od svakog) su stavljene i ostavi da se pridržavaju i širiti najmanje 8 sati. Prihvaćene stanice su isprane tri puta s PBS, te je medij za kulturu zamijenjen s medijem bez seruma tijekom 24 sata. Aktivnost MMP2 i MMP9 u kondicioniranom mediju bio je procijenjen zimografije. Kondicionirani medij je sakupljen, koncentriran (Mikrokonska 30 K, Merck Millipore, Darmstadt, Njemačka) i ponovo suspendirane u SDS-PAGE puferom za uzorke (bez beta-merkaptoetanola). Preostale stanice su lizirane, a koncentracija proteina je određena pomoću BCA testom (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Ukupno 1 ug proteina iz svakog kondicioniranom mediju odvojen na 10% poliakrilamidnom gelu koji sadrži 0.2% želatinom. Nakon elektroforeze, gelovi su isprani u 2,5% Triton X-100 tijekom 30 minuta, zatim je uravnotežena u 10 mM Tris (pH 8,0) i inkubira na 37 ° C tijekom 16-24 h, u puferu za razvoj sadrži 50 mM Tris (pH 8,0 ), 5 mM CaClz 2, i 0.02% NaN 3. Gelovi su obojene s 0.2% Coomassie blue R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) i obezbojena sa 1: 1 octena kiselina U otopinu /metanol. Eksperimenti su provedeni u triplikatu. Zimografskom bendova koji su indikativni za MMP aktivnošću, kvantificirane su skeniranjem denzitometrije. Pregled statističkih analiza pregled Normalnost promjenjive distribucija određena je pomoću Shapiro-Wilk testom. Udruge između myc Netlogu, FBXW7 Netlogu i TP53 pregled broj kopija varijacije, razine mRNA, ekspresije proteina, kliničkopatološka obilježja, te invazije stanice i migraciju sposobnost analizirani su pomoću hi-kvadrat (χ 2) i Mann-Whitney test. Korelacija između ekspresije različitih ciljnih mRNA se odredi pomoću Spearmanov testa, u kojem je vrijednost ispod 0,3 ukazuje na slabu korelaciju, 0,3-0,7 naznačeno srednje korelaciju, a vrijednosti iznad 0,7 ukazuje na jaku korelaciju. Podaci su prikazani kao medijan i interquartile raspon; P vrijednosti manje od 0,05 smatrale su značajne. | ​​Rezultati
Želučani uzorci tumora pokazalo je pojačanje myc Netlogu i brisanju FBXW7 Netlogu i TP53
Tri ili više primjeraka myc Netlogu pronađeni su u 51,5% (17/33) želučanog tumorskih stanica. Za razliku od toga, 45,5% (15/33) i 21,2% (7/33) od želučanih stanica tumora sadržavao samo jedan primjerak FBXW7 Netlogu i TP53 Netlogu, respektivno.
Povezanost između kliničkopatološkim mogućnosti i myc
FBXW7 pregled i TP53 pregled kopirati broj sažeti su u tablici 1. Jedan želučani tumor koji je sadržavao tri primjerka TP53 pregled je isključen iz hi-kvadrat analize. Ne povezanost između broja kopija varijacije gena proučava i kliničkopatološkim značajke. Pregled myc pregled mRNA bila je veća u tumorima nego u ne-maligne primjeraka, dok FBXW7 Netlogu i TP53 pregled mRNA bila niža tumorom primjerci
razinu ekspresije myc pregled mRNA (2,01 ± 1,72 puta promjene) u uzorcima tkiva tumora bio značajno veći u odnosu na ne-neoplastičnog tkiva (p = 0,0002), a na ekspresijsku razinu FBXW7
mRNA (0,53 ± 0,40 puta promjene) i TP53 pregled mRNA (0,84 ± 0,55 puta promjene) u uzorcima tkiva tumora bio je znatno niži nego u ne-tumora, (p < 0,0001 i p = 0,0011, respektivno). Nismo pronašli značajnu povezanost između myc Netlogu, FBXW7 Netlogu i TP53 pregled mRNA ekspresije (myc pregled /FBXW7 pregled mRNA r = -0,3464, p = 0,0562; myc pregled /TP53 pregled mRNA r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7 pregled /TP53 pregled mRNA r = -0,0745, p = 0,4747). Dakle, samo je sklonost prema korelacije između povećanja myc
mRNA ekspresije i smanjenja FBXW7 pregled ekspresije mRNA je otkrivena. Pregled Tablica 2 daje vezu između različitih kliničkopatološkim značajke i RQ od myc Netlogu , FBXW7 pregled i TP53 pregled mRNA u tumoru i upareni ne-maligne primjerci. Povećanje myc
razini mRNA bila je povezana s prisutnošću limfnog čvora metastaza (p = 0,016), a GC tumor stadij III-IV (p = 0,036). Značajno smanjenje FBXW7 pregled razini mRNA je također bio povezan s prisutnošću limfnih čvorova metastaze (p = 0,015) i tumora stadij III-IV (p = 0,008) .table 2 myc, razina ekspresije FBXW7 i TP53 mRNA i kliničkopatološkim faktori 33 bolesnika s rakom želuca
n (%)
myc
p- vrijednost
FBXW7

p- vrijednost
TP53
p- vrijednost
Srednje ± IQR pregled Srednje ± IQR pregled Srednje ± IQR
doba (y) (srednja vrijednost ± SD) izvoznici > 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%)
2,04 ± 1,35
0.8873
0.55 ± 0.37
0,9247 pregled 0,86 ± 0,62 pregled 0,7409 pregled ≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%)
1,44 ± 4,88 pregled 0,53 ± 0,50 pregled 0,94 ± 1,65
Spol pregled muški pregled, 15 (45,5%)
2.01 ± 1.01 pregled 0,4065 pregled 0,53 ± 0,22 pregled 0,6353 pregled 0,89 ± 0,58 pregled 0,8125 pregled Female
18 (54,5%), pregled, 1,67 ± 2,03 pregled 0,56 ± 0,56 pregled 0,87 ± 0,69 pregled histopatoloških pregled crijevna pregled, 22 (66,7%), pregled, 2,06 ± 0,99 pregled 0,3525 pregled, 0,53 ± 0,16 pregled 0,1391 pregled 0,81 ± 0,78 pregled 0,

• Infekcija Helicobacter pylori i razina cirkulirajućeg grelin - Sustavni pregled
• "Brzi pjesmu" rehabilitacija nakon želudac resekcije tumora: iskustvo s 80 uzastopnih slučajeva