MYC, FBXW7 en TP53 copy number variatie en expressie in Gastric Cancer

MYC, FBXW7 Kopen en TP53
copy number variation en expressie bij maagkanker
Abstracte achtergrond
MYC deregulering is een veel voorkomende gebeurtenis in maagkanker, meestal als gevolg van genamplificatie, chromosomale translocaties of posttranslationele. FBXW7
is een p53 gecontroleerde tumor-suppressor die een rol spelen bij de regulering van de celcyclus exit en de terugkeer in de atmosfeer speelt via MYC degradatie.
Methods
We evalueerden MYC
, FBXW7
en TP53
kopieaantal mRNA en eiwitexpressie in maagkanker en gepaarde non-neoplastische monsters van 33 patiënten en ook in adenocarcinoom cellijnen. We hebben ook vastgesteld de invasie potentieel van de maagkanker cellijnen.
Resultaten
MYC
amplificatie werd waargenomen bij 51,5% van de maag tumor samples. Deletie van één exemplaar van FBXW7 Kopen en TP53
werd waargenomen bij 45,5% en 21,2% van maag tumoren, respectievelijk. MYC
mRNA expressie in tumoren was significant hoger dan bij niet-neoplastische monsters. FBXW7 Kopen en TP53
mRNA expressie was duidelijk lager in tumoren dan in gepaarde non-neoplastische exemplaren. Bovendien gedereguleerde MYC Kopen en FBXW7
mRNA expressie was geassocieerd met de aanwezigheid van lymfeklier metastase en tumor stadium III-IV. Daarnaast werd MYC immunokleuring vaker waargenomen in de darm-type dan diffuse-type maagkanker en werd geassocieerd met MYC
mRNA expressie. In vitro studies toonden aan dat meer MYC en verminderde FBXW7 expressie is geassocieerd met een invasief fenotype in maagkanker cellijnen. Dit resultaat ons aangespoord om de activiteit van MMP-2 en MMP-9 in beide cellijnen te onderzoeken. Beide gelatinasen worden voornamelijk gesynthetiseerd door stromacellen in plaats van kankercellen, en het is voorgesteld dat beide bijdragen aan de progressie van kanker. We observeerden een significante stijging van MMP-9-activiteit in vergelijking met ACP02 ACP03 cellen. Deze resultaten bevestigden dat ACP02 cellen hebben een grotere invasie vermogen dan ACP03 cellen.
Conclusie
Concluderend kan FBXW7 en MYC mRNA een rol in de agressieve biologische gedrag van maagkanker cellen spelen en kan een nuttige indicator van een slechte prognose. Verder MYC is een kandidaat doelwit voor nieuwe therapieën tegen maagkanker.
Sleutelwoorden
Maagkanker MYC FBXW7 TP53 Achtergrond
Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker overlijden wereldwijd [1]. GC wordt beschouwd als een belangrijke bezorgdheid over de volksgezondheid, met name in ontwikkelingslanden, waaronder Brazilië [2].
Een fundamenteel aspect van carcinogenese is ongecontroleerde celdeling als gevolg van de accumulatie van veranderingen die de expressie of onderdrukking van de celcyclus-control genen te bevorderen [3]. MYC
is een transcriptie factor die betrokken zijn bij regulering van de celcyclus en de celgroei arrestatie die vaak wordt gedereguleerd in kanker en is beschreven als een belangrijk element van de maag carcinogenese [4, 5]. Verschillende soorten posttranslationele modificaties van MYC zijn beschreven, waaronder fosforylatie, acetylatie, en ubiquitinering [6]. Het ubiquitine-proteasoom-systeem is de belangrijkste eiwitafbraak regelgevende pathway betrokken bij celdifferentiatie en groeicontrole [7]. FBXW7
codeert voor een F-box-eiwit subunit van de Skp1 /Cul1 /F-box complex (SCF) ubiquitine ligase complex. SCF FBXW7 induceert afbraak van de producten van de positieve celcyclus regulator genen, zoals cycline E
, MYC
, NOTCH
en juni
, door middel van fosforylering afhankelijke ubiquitinering [8]. Onder SCF FBXW7 substraten MYC is bijzonder belangrijk celcyclus verlaten omdat men denkt dat een rol speelt bij het bepalen of zoogdiercellen verdelen indien [9].
Verstoorde FBXW7
expressie is een belangrijke oorzaak van carcinogenese [10-12]. Verlies van FBXW7
expressie kan leiden tot MYC overexpressie en is geassocieerd met een slechte prognose bij patiënten GC [13]. Echter, MYC activering door FBXW7
verlies veroorzaakt activering van p53, die een sleutelrol spelen in de regulatie van cellulaire reacties op DNA-schade en abnormale expressie van oncogenen speelt. Inductie van celcyclus arrestatie door p53 zorgt voor herstel van DNA of apoptose inductie [14]. Zo gelijktijdige verlies van FBXW7 Kopen en TP53
is noodzakelijk om genetische instabiliteit en het ontstaan ​​van tumoren [11] veroorzaken.
In de huidige studie, onderzochten we MYC
, FBXW7
en TP53
gen copy number variation en mRNA en eiwit expressie in GC monsters en adenocarcinoom van de maag cellijnen. Mogelijke associaties tussen onze bevindingen en de klinische en pathologische kenmerken en /of invasie en migratie vermogen van de cellijnen werden ook beoordeeld.
Methods
Klinische monsters
Monsters werden verkregen uit 33 GC patiënten die chirurgie ondergaan op João de Barros Barreto University Hospital in Pará State, Brazilië. Ontleed tumor- en gepaard non-neoplastische weefselmonsters werden onmiddellijk uit de maag gesneden en bevroren in vloeibare stikstof tot extractie van RNA. Ondernemingen De klinische en pathologische kenmerken van de patiënt monsters worden getoond in Tabel 1. GC monsters werden geclassificeerd volgens Lauren [15] . Alle GC monsters toonde de aanwezigheid van Helicobacter pylori
en de cagA virulentie factor werd bepaald door PCR-analyse van ureum Kopen en cagA
zoals beschreven door Clayton et al
. [16] en Covacci et al.
[17], respectievelijk. Alle patiënten hadden negatieve geschiedenis van blootstelling aan chemotherapie of radiotherapie voor de operatie en er waren geen andere tegelijk voorkomen van kanker gediagnosticeerd. Informed consent met goedkeuring van de ethische commissie van de Federale Universiteit van Pará was obtained.Table 1 MYC, FBXW7 en TP53 gen copy number variation, MYC en p53-eiwit expressie en clinicopathologische kenmerken van 33 GC patiënten
CNV MYC

CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 exemplaren (n = 16)
≥ 3 exemplaren (n = 17)
p- waarde
2 exemplaren (n = 18)
1 exemplaar (n = 15)
p- waarde
2 exemplaren (n = 25)
1 exemplaar (n = 7)
p - waarde
P (n = 19)
N (n = 14)
p- waarde
P (n = 6)
N (n = 25)
p- waarde
Age (y) (gemiddelde ± SD) Restaurant > 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2)
9
5
6
8
10 verhuur 4
10 | 9 2
17
Geslacht
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10
12
6
8
10 | 5
13
Histopathologie
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9 1
3
8 1
10 | diepte van tumorinvasie
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
lymfekliermetastasen
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10 | 10 | 15 verhuur 4
13
7
5
15
Stage
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11 verhuur 4
8
7 verhuur 4
11
MYC IHC
Negatief
5
8
0,481
7
6
1,000
11 2
0,671
Positieve
11
9
11
9
14
5
p53 IHC
Negatief
14
12
0,398
14
12
1,000
21 verhuur 4
0.157
positief 2
5 verhuur 4
3 verhuur 4
3
* p Restaurant < 0,05; P: positief; N:. negatieve
cellijnen
Maagdarmkanker cellijnen ACP02 en ACP03 [18] werden gekweekt in compleet RPMI-medium (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline /streptomycine en 1% kanamycine.
copy number variation (CNV)
DNA werd geëxtraheerd met behulp van een DNAQiamp mini-kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Duplex kwantitatieve real-time PCR (real-time qPCR) werd uitgevoerd met behulp van de FAM /MGB-gelabelde TaqMan probes voor MYC
(Hs01764918_cn), FBXW7
(Hs01362464_cn), of TP53
(Hs06423639_cn), en VIC /TAMRA-gelabelde TaqMan CNV RNAse P
(.403.326) werd gebruikt voor de controle. Alle real-time qPCR reacties werden uitgevoerd in viervoud met gDNA volgens het protocol van de fabrikant met een 7500 Fast Real-Time PCR systeem (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Het aantal kopieën van elk monster werd geschat door CNV analyse met Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Bekende menselijk genomisch DNA (Promega, Madison, USA) werd gebruikt voor de kalibratie.
Kwantitatieve real-time reverse transcriptase PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd met TRI reagens ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, USA ) volgens de instructies van de fabrikant. RNA-concentratie en kwaliteit werden bepaald met een spectrofotometer NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) en 1% agarose gels. Complementair DNA (cDNA) werd gesynthetiseerd met behulp van een extra grote cDNA Archive kit volgens aanbevelingen van de fabrikant (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Real-time qPCR primers en TaqMan probes targeting MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7
(Hs00217794_m1) en TP53
(Hs01034249_m1) werden gekocht als Testen-on-Demand producten voor Gene Expression ((Life Technologies, . Foster City, CA, USA) in echte tijd qPCR werd uitgevoerd met een ABI Prism 7500 systeem (Life Technologies, Foster City, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant GAPDH
(NM_002046.3;. Life Technology, USA) werd gekozen als een interne controle voor de controle RNA ingang en reverse transcriptie efficiëntie. All real-time qPCR reacties voor doelgenen en controles werden in drievoud op dezelfde plaat. de relatieve kwantificatie (RQ) van genexpressie werd berekend met de ΔΔCt werkwijze [19], waarbij de niet-neoplastische monster werd aangeduid als een calibrator per gekoppelde tumormonster.
Immunohistochemie Immunohistochemische analyses voor
MYC en p53 werden uitgevoerd op met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde secties chirurgische. Seriële 3-um secties werden gebruikt. Warmte-geïnduceerde antigen retrieval werd gebruikt (microprocessor gestuurde druk Pascal ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Een universele peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam kit (LSAB System, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) werd gebruikt voor detectie met diaminobenzidine (DAB) als het chromogeen. De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: muis monoklonale antilichamen gericht tegen MYC (verdunning 1: 150; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA en kloon 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (verdunning 1:50, Abnova Corp., Taipei City, Taiwan), en p53 (verdunning 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Positieve eiwitexpressie werd gedefinieerd als duidelijk nucleaire kleuring in meer dan 10% van de cellen.
Migratie en invasie assay
migratie en invasie assays werden uitgevoerd in een gemodificeerde Boyden-kamer uitgevoerd met filterelementen (8 urn poriën) voor 12-well platen (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Invasie beoordelen, werden filters bekleed met 10 pl Matrigel (10-13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) terwijl op ijs. Cellen (2 x 10 5) werden uitgeplaat in de bovenste kamer in 1 ml RPMI zonder FBS. De onderste kamer was gevuld met 1,5 ml RPMI met FBS. Na 48 uur in kweek werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde en post-gefixeerd met 0,2% kristalviolet in 20% methanol. Cellen aan de bovenzijde van het filter, ook die in de Matrigel werden verwijderd met een wattenstaafje. Binnendringende cellen (aan de onderzijde van het filter) werden gefotografeerd en geteld. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd.
Immunofluorescentie
cellen gekweekt op dekglaasjes werden gefixeerd met 1% paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 10 min, vervolgens doorlaatbaar gemaakt met 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in PBS gedurende 15 min en geblokkeerd met 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS. De cellen werden gekleurd met de muis antilichamen tegen MYC (1:50 verdund; Zymed ®, USA), p53 (1:50 verdund; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), en FBXW7 (1:50 verdund; Abnova Corp ., Taipei City, Taiwan). Primaire antilichamen werden onthuld onder toepassing van een anti-muis Alexa-568 geconjugeerd secundair antilichaam (Invitrogen). Alle incubaties werden uitgevoerd gedurende 60 min bij kamertemperatuur. Kernen werden gekleurd met DAPI in Prolong anti-fade montage medium (Invitrogen). Negatieve controlemonsters werden verwerkt zoals hierboven, behalve dat de primaire antilichamen waren weggelaten en vervangen door PBS alleen beschreven.
Western blotting
Eiwitextractie van cellen werd uitgevoerd volgens standaardprocedures. In het kort werd totaal eiwit geëxtraheerd uit ACP02 en ACP03 cellen middels 50 mM Tris-HCl buffer die 100 mmol /L NaCl, 50 mM NaF, 1 mM NATO 4, 0,5% NP-40, en volledige proteaseremmer cocktail (Roche , Duitsland). De eiwitconcentratie werd geschat met een Bradford test (Sigma-Aldrich). Ongeveer 30 ug totaal eiwit extract werd geladen op een 12% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) gel en geëlektroforeerd. Opgeloste eiwitten werden vervolgens overgebracht uit de gel naar een nitrocellulosemembraan. Het membraan werd geblokkeerd met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing die 5% Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) en vervolgens geïncubeerd met muizen monoklonaal anti-MYC (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei City, Taiwan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), en anti-β-actine (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) antilichamen verdund 1: 200, 1: 100, 1: 100 en 1: 2000, respectievelijk. Vervolgens werden membranen geïncubeerd met een 1: 5000 verdunning van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd schaap anti-muis antilichaam (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Eiwitten werden zichtbaar gemaakt door versterkte chemiluminescentie.
ACP02 en ACP03 cellen (5 x 10 4 van elk) werden uitgeplaat en toegestaan ​​te hechten en verspreiden gedurende minstens 8 uur zymografie
. Hechtende cellen werden driemaal gewassen met PBS, en werd het cultuurmedium vervangen door serumvrij medium gedurende 24 uur. De activiteit van MMP2 en MMP9 in het geconditioneerde medium werd beoordeeld door zymografie. Geconditioneerd medium werd verzameld, geconcentreerd (Microcon 30 K, Millipore Merck, Darmstadt, Duitsland) en opnieuw gesuspendeerd in SDS-PAGE monsterbuffer (zonder β-mercaptoethanol). De overige cellen werden gelyseerd en de eiwitconcentratie werd geschat met een BCA assay (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Een totaal van 1 ug eiwit van elk geconditioneerd medium werd gescheiden op 10% polyacrylamide gels die 0,2% gelatine. Na elektroforese werden de gels in 2,5% Triton X-100 gewassen gedurende 30 min, vervolgens geëquilibreerd in 10 mM Tris (pH 8,0) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 16-24 h in een ontwikkeling buffer die 50 mM Tris (pH 8,0 ), 5 mM CaCh 2, en 0,02% NaN 3. De gels werden gekleurd met 0,2% Coomassie blauw R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) en ontkleurd met 1: 1 azijnzuur /methanol-oplossing. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd. Zymografische banden, die indicatief MMP activiteit werd gekwantificeerd door het scannen van densitometrie.
Statistische analyses
normaliteit variabele verdeling werd bepaald met de Shapiro-Wilk testen. Associaties tussen MYC
, FBXW7
en TP53
copy number variation, mRNA-niveaus, eiwitexpressie, clinicopathologische functies en cel invasie en migratie capaciteit werden geanalyseerd met behulp van de chi-kwadraat (χ 2) en Mann-Whitney test. Correlatie tussen de expressie van verschillende doelwit mRNA werd bepaald met testen Spearman's, waarbij een waarde beneden 0,3 bleek een zwakke correlatie, 0,3-0,7 aangegeven een medium correlatie en waarden boven 0,7 gaf een sterke correlatie. De gegevens worden weergegeven als de mediaan en interkwartielafstand; p-waarden kleiner dan 0,05 significant werden beschouwd.
Resultaten
Gastric tumor specimens toonde versterking van MYC Kopen en verwijdering van FBXW7 Kopen en TP53
Drie of meer kopieën van MYC
gevonden in 51,5% (17/33) van gastrische tumorcellen. Daarentegen 45,5% (15/33) en 21,2% (7/33) van gastrische tumorcellen bevatte slechts één exemplaar van FBXW7 Kopen en TP53
respectievelijk. Ondernemingen De associatie tussen klinische en pathologische kenmerken en MYC
wordt FBXW7
en TP53
kopienummer samengevat in Tabel 1. Een maagtumor dat drie kopieën van TP53
van de chi-kwadraat analyse werd uitgesloten bevatte. Er werd geen verband gevonden tussen copy number variation van de genen bestudeerd en klinische en pathologische kenmerken.
MYC
mRNA expressie was hoger in tumoren dan bij niet-neoplastische exemplaren, terwijl FBXW7 Kopen en TP53
mRNA expressie was lager in tumor specimens Ondernemingen de expressie van MYC
mRNA (2.01 ± 1.72 voudige verandering) in tumorweefsel monsters was significant hoger dan bij niet-neoplastisch weefsel (p = 0,0002), terwijl de expressie van FBXW7
mRNA (0.53 ± 0.40 voudige verandering) en TP53
mRNA (0,84 ± 0,55 voudige verandering) in tumorweefsel monsters was significant lager dan bij niet-neoplastisch weefsel (p < 0,0001 en p = 0,0011, respectievelijk). We hadden geen significante correlatie tussen MYC
, FBXW7
en TP53
mRNA expressie (Zoek MYC Twitter /FBXW7
mRNA r = -0,3464, p = 0,0562; MYC Twitter /TP53
mRNA r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7 Twitter /TP53
mRNA r = -0,0745, p = 0,4747). Aldus is slechts een neiging tot correlatie tussen een toename MYC
mRNA expressie en een afname van FBXW7
mRNA-expressie werd gedetecteerd.
Tabel 2 vat de associaties tussen verschillende klinische en pathologische kenmerken en RQ van MYC
, FBXW7
en TP53
mRNA expressie in tumor en gepaarde non-neoplastische exemplaren. Een toename MYC
mRNA-niveau werd geassocieerd met de aanwezigheid van lymfeknoop metastasen (p = 0,016) en GC tumor stadium III-IV (p = 0,036). Een significante vermindering van FBXW7
mRNA-niveau werd ook in verband gebracht met de aanwezigheid lymfeklier metastase (p = 0,015) en tumor stadium III-IV (p = 0,008) .table 2 MYC, FBXW7 en TP53 mRNA expressie niveaus en klinisch-pathologische factoren van 33 maagkankerpatiënten
n (%)
MYC
p-waarde
FBXW7

p-waarde
TP53
p-waarde
Median ± IQR
Median ± IQR
Median ± IQR
Age (y) (gemiddelde ± SD) Restaurant > 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%)
2.04 ± 1.35
0,8873
0,55 ± 0,37
0,9247
0.86 ± 0.62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%)
1,44 ± 4.88
0.53 ± 0.50
0.94 ± 1.65
Gender
Man
15 (45,5%)
2.01 ± 1.01
0,4065
0.53 ± 0.22
0,6353
0.89 ± 0.58
0,8125
Female
18 (54,5%)
1,67 ± 2,03
0.56 ± 0.56
0.87 ± 0.69
Histopathologie
Intestinale
22 (66,7%)
2,06 ± 0.99
0,3525
0.53 ± 0.16
0,1391
0.81 ± 0.78
0,3311
Zend
11 (33,3%)
1.40 ± 2.32
0.77 ± 0.74
0,94 ± 0,38
diepte van tumorinvasie
T1
6 (18,2%)
0,89 ± 0,47
0,0857
0.88 ± 0.58
0,0678
0.85 ± 0.15
0,7069
T2-T4
27 (81,8%)
2,08 ± 1,42
0.53 ± 0.43
0,91 ± 0.79
lymfekliermetastasen
Afwezig
13 (39,4%)
0.98 ± 1.09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0.84 ± 0.44
0,6121
Presenteer
20 (60,6%)
2.10 ± 2.20
0.46 ± 0.38
0.94 ± 0.79
Stage
I-II
18 (54,5%)
1,39 ± 1.23
0,0362 *
0.57 ± 0.38
0,0380 *
0,83 ± 0.55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2,41 ± 2.79
0.34 ± 0.45
0.96 ± 1.19
MYC IHC
Positieve
20 (60,6%)
2.18 ± 1.59
0,0022 *
0.53 ± 0.32
0,4090
0.81 ± 0.57
0,1372
Negatief
13 (39,4%)
0.89 ± 0.85
0.58 ± 0.53
0.99 ± 0.90
p53 IHC
Positief
7 (21,2%)
4.25 ± 6.53
0,0891
0,64 ± 0.68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
Negatief
26 (78,8%)
2.00 ± 1.44
0.55 ± 0.35
0,87 ± 0,60
* p
< 0,05; IQR:. Interkwartielafstand
Nuclear MYC eiwit kleuring wordt geassocieerd met intestinale-type GC
Positieve kleuring voor nucleaire MYC en p53 werd gevonden in 64,5% (20/31) en 19,4% (31/06) van GC monsters respectievelijk (figuur 1). Geen positiviteit werd gevonden voor FBXW7. Tabel 1 vat de klinische en pathologische kenmerken en MYC en p53 immunokleuring resultaten. Expressie van MYC was vaker voor in de darm-type dan diffuse-type GC (p = 0,007). Bovendien werd MYC immunokleuring geassocieerd met een verhoogde MYC
mRNA-niveau (p = 0,0022). Er werd geen verband gevonden tussen p53 immunokleuring en klinisch-pathologische kenmerken, TP53
copy number of TP53
mRNA expressie. Figuur 1 Immunohistochemische analyse van MYC en p53-eiwitexpressie in GC. (A) Negatieve MYC immunokleuring in diffuse-type GC; (B) MYC immuun positiviteit in de darm-type GC; (C) Positieve p53 immunokleuring in diffuse-type GC; (D) p53 immuun positiviteit in de darm-type GC (vergroting x 40).
Vergelijking van ACP02 en ACP03 cellijnen
Zowel ACP02 en ACP03 cellen bevatte drie MYC
exemplaren en slechts één FBXW7
exemplaar . Het aantal TP53
kopieën was niet bepaald in beide cellijnen. Vergeleken met mRNA expressie in ACP03 cellen ACP02 cellen brachten een hoger MYC
(1,34-voudig) en de lagere FBXW7 Kopen en TP53
mRNA (0.62- en 0,73-voud).
Western blot analyse toont dat MYC expressie was significant hoger in ACP02 cellen dan ACP03 cellen (p = 0,048). Bovendien was FBXW7 expressie significant lager in ACP02 cellen dan ACP03 cellen (p = 0,049). Er was echter geen significant verschil in p53-expressie tussen de cellijnen (p = 0,077) (Figuur 2A-B).
Immunofluorescentie analyse van beide eiwitten vertoonden een puntvormige patroon van labeling, ondersteunen de Western blot resultaten die een verhoging van MYC en vermindering van FBXW7 expressie in cellen ACP02 opzichte ACP03 (figuur 2). Matrigel invasie assay resultaten toonden aan dat ACP02 cellen ingrijpender dan ACP03 cellen (p = 0,001). Migratieanalyse resultaten toonden dat minder ACP02 cellen gemigreerd opzichte ACP03 cellen (p = 0,0028) (figuur 2C-D). Figuur 2 MYC, FBXW7 en p53 expressie, migratie en invasie vermogen in ACP02 en ACP03. (A) Grafiek: gemiddelde ± SD van MYC, FBXW7 en p53-eiwit expressie in ACP02 en ACP03. Deze eiwitten werden genormaliseerd tot het niveau van beta actine; (B) Representatieve gegevens van MYC, FBXW7 en p53-eiwit meningsuiting; (C-D) Grafieken tonen gemiddelde ± SD van migratie en invasieve cellen drievoud assay; (E) Representatieve resultaten van MYC, FBXW7 en p53 immunofluorescentie
Zowel ACP02 en ACP03 cellen gepresenteerd vier gelatinase activiteit bands:. MMP-9 latent (92 kDa), MMP-9 actief is (88 kDa), MMP-2 latent ( 72 kDa) en MMP-2 actief (66 kDa) (figuur 3). We vonden geen significante verschillen in MMP-9 latente (p = 0,9788), MMP-2 actief (p = 0,7848), en MMP-2 latente (p = 0,1678) tussen ACP02 en ACP03 cellen. Er werden echter significante verschillen gevonden tussen ACP02 en ACP03 cellen met betrekking tot MMP-9 actief is (p = 0,0182). Figuur 3 Representatieve gelatine zymografie analyse van MMP-2 en MMP-9-activiteit in ACP02 en ACP03. (A) banden die overeenkomen met zowel latente en actieve vormen van MMP-2 en MMP-9 werden waargenomen in ACP02 en ACP03. Densitometrische analyses van de band van latente en actieve vormen van MMP-2 (B) en MMP-9 (C).

Bespreking In deze studie hebben we vastgesteld dat MYC
mRNA expressie verhoogd GC monsters vergeleken met overeenkomstige niet-neoplastische monsters. Bovendien zover wij weten is dit de eerste studie die een verband tussen verhoogde MYC
mRNA expressie en de aanwezigheid van lymfekliermetastase en CG stadium III-IV melden, te benadrukken dat MYC
deregulering een sterke factor voor maligniteit in GC.
Adams et al
. [20] en Leder et al.
[21] heeft aangetoond dat MYC
mRNA expressie deregulering de ontwikkeling van kanker in transgene muismodellen kan bevorderen. De toename MYC
mRNA in humane kankers kunnen voortvloeien uit zowel directe als indirecte mechanismen, die verschillende verklaringen kunnen hebben. Eerst, MYC
amplificatie is de meest voorkomende mechanisme van MYC
deregulering in [5] GC. Dit mechanisme leidt tot een verhoogde productie van oncogene producten in hoeveelheden die de transcriptie capaciteit van een normale dubbele kopie gen overschrijden. Hier zagen we drie of meer MYC
gen exemplaren in 51,5% van de maag tumoren exemplaren. Eerdere studies uit de groep toonde ook aan dat MYC
amplificatie of trisomie van chromosoom 8, waar MYC
ligt, in alle GC onderzochte monsters van individuen in Noord Brazilië, en in GC vastgesteld cellijnen was onze groep van tumoren van de Braziliaanse patiënten [18, 22-27]. De aanwezigheid van MYC
amplificatie is ook beschreven in plasmamonsters van individuen met GC [28]. Echter geen direct verband tussen MYC
kopienummer variatie en mRNA expressie werd waargenomen in dit onderzoek. Tweede, de toename MYC
mRNA expressie kan het gevolg zijn van consistente recombinatie tussen de immunoglobuline (Ig) locus en de MYC
oncogen. Dit fenomeen wordt vaak beschreven in Burkitt-lymfoom en is geassocieerd met een langere halfwaardetijd van MYC
mRNA in aangetaste cellen [29]. Voorheen onze onderzoeksgroep waargenomen MYC
inserties in diffuse type GC voornamelijk in chromosomen die zijn toegewezen aan genen van immunoglobulinen (chromosomen 2, 14 en 22) [26]. Zo zou chromosomale translocaties waarbij MYC
locus (8q24) in diffuse-type CG bij personen uit Noord-Brazilië weerspiegelen ook een toename van de MYC
mRNA-niveau.
Immunohistochemie (IHC) analyse bleek dat MYC expressie vaker gevonden in de darm-type GC dan diffuse-type GC exemplaren. Deze veranderingen kunnen leiden tot een abnormale MYC eiwit dat niet door een van de antilichamen die in deze studie opgenomen. Bovendien zagen we een associatie tussen MYC
mRNA expressie niveau en de MYC kleuring. Bovendien posttranscriptionele mechanismen controle MYC stabiliteit [6, 30]. MYC
deregulering is geassocieerd met verlies van FBXW7
een haploinsufficient tumorsuppressorgen. In het algemeen kan FBXW7
schade veroorzaakt door het verlies van heterozygositeit (LOH) en mutatie [30]. Het verlies van 4q, het FBXW7
locus, is een terugkerende chromosomale afwijkingen in GC [31, 32] en FBXW7
mutaties gevonden in 3,7-6% van maag tumoren [12]. In
deze studie observeerden we slechts één kopie van het FBXW7 gen
in 45,16% van de maag tumoren bestudeerd. Interessant is dat FBXW7
mRNA expressie in GC monsters aanzienlijk verminderd vergeleken met overeenkomstige niet-neoplastisch weefsel. Bovendien werd FBXW7
mRNA expressie deregulering geassocieerd met de aanwezigheid van lymfekliermetastase en GC stadium III-IV, zoals ook waargenomen met MYC
mRNA. Deze bevindingen bevestigen het werk van Yokobori el al.
[13], die ook liet zien een verband tussen verminderde FBXW7
mRNA expressie en lymfeklieren metastase die bijdraagt ​​aan de maligne potentie van GC cellen en resulteert in een slechte prognose. Bovendien, we hebben geconstateerd dat de expressie van MYC Kopen en FBXW7
mRNA neiging om omgekeerd gecorreleerd in het huidige onderzoek.
Verschillende studies toonden aan dat MYC
inactivatie onderdrukt tumoren bij dieren, wat suggereert dat MYC
mogelijk doelwit in de behandeling van kanker [33-35] be. Als alternatief Soucek et al
. [36] voorgesteld dat FBXW7 "tumor ruststadia therapie" zou kunnen vergemakkelijken. Aldus kan MYC degradatie door FBXW7 niet alleen leiden tot een toestand van tumor slaaptoestand, maar kan ook een anti-tumor effect. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Helicobacter pylori infectie en circulerende ghreline niveaus - Een systematische review
• "Fast track" revalidatie na maagkanker resectie: ervaring met 80 opeenvolgende gevallen