MYC, FBXW7 og TP53 kopi nummer variation og udtryk i Gastric Cancer

MYC, FBXW7
og TP53
kopi nummer variation og udtryk i Gastric Cancer
Abstrakt
Baggrund
MYC deregulering er en almindelig begivenhed i gastrisk carcinogenese, sædvanligvis som følge af genamplifikation, kromosomale translokationer eller posttranslationelle mekanismer. FBXW7
er en p53-kontrolleret tumor-suppressor, der spiller en rolle i reguleringen af ​​cellecyklus exit og reentry via MYC nedbrydning.
Metoder
Vi evaluerede MYC
, FBXW7
, og TP53
kopiantal, mRNA-niveauer, og proteinekspression i gastrisk cancer og parrede ikke neoplastiske prøver fra 33 patienter og også i gastrisk adenocarcinom cellelinier. Vi bestemt også invasion potentiale i mavens kræft cellelinjer.
Resultater
MYC
forstærkning blev observeret i 51,5% af gastrisk tumor prøver. Sletning af én kopi af FBXW7
og TP53
blev observeret i 45,5% og 21,2% af gastrisk tumorer hhv. MYC
mRNA-ekspression var betydeligt højere i tumorer end i ikke-neoplastiske prøver. FBXW7
og TP53
mRNA-ekspression var markant lavere i tumorer end i parrede ikke-neoplastiske prøver. Desuden blev dereguleret MYC
og FBXW7
mRNA-ekspression er forbundet med tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastase og tumor stadium III-IV. Desuden blev MYC immunfarvning observeret hyppigere i tarm-type end diffus type gastrisk kræft og var forbundet med MYC
mRNA-ekspression. In vitro undersøgelser viste, at øget MYC og reduceret FBXW7 ekspression er associeret med en mere invasiv fænotype i gastriske cancercellelinier. Dette resultat tilskyndet os til at undersøge aktiviteten af ​​gelatinaserne MMP-2 og MMP-9 i begge cellelinier. Begge gelatinaser syntetiseres hovedsageligt af stromaceller snarere end kræftceller, og det er blevet foreslået, at begge bidrager til cancer progression. Vi observerede en signifikant stigning i MMP-9-aktivitet i ACP02 sammenlignet med ACP03-celler. Disse resultater bekræftede, at ACP02-celler har større invasion funktionsevne end ACP03-celler.
Konklusion
Som konklusion kan FBXW7 og MYC mRNA spille en rolle i aggressiv biologiske opførsel af gastriske cancerceller og kan være en nyttig indikator for dårlig prognose. Desuden MYC er en kandidat mål for nye behandlinger mod mavekræft.
Nøgleord
mavekræft MYC FBXW7 TP53 Baggrund
Gastric kræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. GC betragtes som en stort problem for folkesundheden, især i udviklingslandene, herunder Brasilien [2].
En grundlæggende aspekt af carcinogenese er ukontrolleret celledeling som følge af ophobning af ændringer, der fremmer udtryk eller undertrykkelse af cellecyklus-kontrol gener [3]. MYC
er en transkriptionel faktor involveret i cellecyklus regulering og cellevækst anholdelse, der er almindeligt dereguleret i kræft og er blevet beskrevet som et centralt element i gastrisk carcinogenese [4, 5]. Flere forskellige typer af posttranslationelle modifikationer af MYC er beskrevet, herunder phosphorylering, acetylering, og ubiquitinering [6]. Ubiquitin-proteasom systemet er den største proteinnedbrydning regulatoriske pathway involveret i celledifferentiering og vækstkontrol [7]. FBXW7
koder for en F-box-protein underenheden af ​​Skp1 /CUL1 /F-box-kompleks (SCF) ubiquitin ligase kompleks. SCF FBXW7 inducerer nedbrydning af produkterne af positive cellecyklus regulator gener, såsom cyklin E
, MYC
, HAK
, og Jun
gennem fosforylering-afhængig ubiquitinering [8]. Blandt SCF FBXW7 substrater, MYC er af særlig betydning i cellecyklus exit fordi det menes at spille en rolle for, om mammale celler deler eller ej [9].
Dereguleret FBXW7
ekspression er en væsentlig årsag af carcinogenese [10-12]. Tab af FBXW7
ekspression kan føre til MYC overekspression og er blevet forbundet med dårlig prognose i GC patienter [13]. Men MYC aktivering med FBXW7
tab udløser aktivering af p53, som spiller en central rolle i reguleringen af ​​cellulære reaktioner på DNA-skader og unormal udtryk for onkogener. Induktion af standsning af cellecyklus ved p53 tillader DNA-reparation eller apoptose induktion [14]. Således samtidig tab af FBXW7
og TP53
er nødvendig for at fremkalde genetisk ustabilitet og tumorigenese [11].
I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi MYC
, FBXW7
, og TP53
genkopiantallet variation og mRNA og proteinekspression i GC-prøver og gastrisk adenocarcinom cellelinier. Mulige sammenhænge mellem vores resultater og de klinisk-patologiske træk og /eller invasion og migration evne af cellelinjer blev også vurderet.
Metoder
kliniske prøver
Prøver blev opnået fra 33 GC patienter, som gennemgik kirurgisk behandling på João de Barros Barreto Universitetshospital i Pará stat, Brasilien. Dissekerede tumorer og parret ikke neoplastiske vævsprøver blev straks skåret fra maven og frosset i flydende nitrogen indtil RNA-ekstraktion.
Den klinisk-patologiske træk ved patientprøverne er vist i tabel 1. GC-prøver blev klassificeret ifølge Lauren [15] . Alle GC-prøver viste tilstedeværelsen af ​​Helicobacter pylori
, og CagA virulensfaktor blev bestemt ved PCR-analyse af urinstof
og CagA
som beskrevet af Clayton et al
. [16] og Covacci et al.
[17], hhv. Alle patienter havde negative historier om udsættelse for enten kemoterapi eller strålebehandling før operationen, og der var ingen andre co-forekomster af diagnosticeret kræft. Informeret samtykke med godkendelse af den etiske komité for Federal University of Pará var obtained.Table en MYC, FBXW7 og TP53 genkopiantal variation, MYC og p53-protein-ekspression og klinisk-patologiske træk af 33 GC patienter
CNV MYC

CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 kopier (n = 16)
≥ 3 eksemplarer (n = 17)
p værdi
2 kopier (n = 18)
en kopi (n = 15)
p-værdi
2 kopier (n = 25)
en kopi (n = 7)
p - værdi
P (n = 19)
N (n = 14)
p-værdi
P (n = 6)
N (n = 25)
p-værdi
Alder (y) (gennemsnit ± SD)
> 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2)
9
5
6
8
10
4
10
9
2
17
Køn
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10
12
6
8
10
5
13
Histopatologi
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9
1
3
8
1
10
dybde tumor invasion
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
lymfeknudemetastase
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10
10
15
4
13
7
5
15
Stage
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11
4
8
7
4
11
MYC IHC
Negative
5
8
0,481
7
6
1,000
11
2
0,671
Positiv
11
9
11
9
14
5
p53 IHC
Negativ
14
12
0,398
14
12
1,000
21
4
0,157
positiv
2
5
4
3
4
3
* p
< 0,05; P: positiv, N:. negativ
Cells linjer
gastrisk adenocarcinom cellelinier ACP02 og ACP03 [18] blev dyrket i komplet RPMI-medium (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin og 1% kanamycin.
Kopier nummer variation (CNV)
DNA blev ekstraheret under anvendelse af et DNAQiamp mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Duplex kvantitativ realtids-PCR (real-time qPCR) blev udført under anvendelse af de FAM /MGB-mærket TaqMan prober til MYC
(Hs01764918_cn), FBXW7
(Hs01362464_cn), eller TP53
(Hs06423639_cn), og VIC /TAMRA-mærket TaqMan CNV RNAse P
(.403.326) blev anvendt til den interne kontrol. Alle realtid qPCR reaktioner blev udført i fire eksemplarer med gDNA ifølge fabrikantens protokol under anvendelse af en 7500 Fast Real-Time PCR systemet (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Kopiantallet af hver prøve blev estimeret ved CNV analyse under anvendelse Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Kendt humant genomisk DNA (Promega, Madison, USA) blev anvendt til kalibrering.
Kvantitativ realtids-revers transkriptase PCR
Totalt RNA blev ekstraheret med TRI-reagens ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, USA ) ifølge producentens instruktioner. RNA-koncentrationen og kvaliteten blev bestemt under anvendelse af et NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) og 1% agarosegeler. Komplementær DNA (cDNA) blev syntetiseret under anvendelse af en High-Capacity cDNA Archive Kit ifølge producentens anbefalinger (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Real-time qPCR primere og TaqMan prober rettet mod MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7
(Hs00217794_m1), og TP53
(Hs01034249_m1) blev købt som Analyser-on-Demand Produkter til Gene Expression ((Life Technologies, . Foster City, CA, USA) Real time qPCR blev udført under anvendelse af en ABI Prism 7500-systemet (Life Technologies, Foster City, CA, USA) ifølge producentens instruktioner GAPDH
(NM_002046.3;. Life Technology, USA) blev valgt som en intern kontrol til overvågning RNA input og revers transkription effektivitet. Alt realtid qPCR reaktioner for målgener og interne kontroller blev udført i tre eksemplarer på den samme plade. den relative kvantificering (RQ) af genekspression blev beregnet ved hjælp af ΔΔCt metode [19], hvor den ikke-neoplastiske prøve blev udpeget som en kalibrator for hver parret tumor prøve.
Immunhistokemi
immunhistokemisk analyse for MYC og p53 blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede kirurgiske afsnit. Serielle 3 um snit blev anvendt. Heat-induceret antigen hentning blev ansat (mikroprocessor-styret tryk Pascal ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). En universel peroxidase-konjugeret sekundært antistof kit (LSAB System, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) blev anvendt til påvisning med diaminobenzidin (DAB) som kromogen. De følgende primære antistoffer blev anvendt: monoklonale muse antistoffer rettet mod MYC (fortynding 1: 150; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA og klon 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (fortynding 1:50, Abnova Corp., Taipei City, Taiwan), og p53 (fortynding 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Positive proteinekspression blev defineret som klar kernefarvning i mere end 10% af cellerne.
Migration og invasion assay
Migration og invasion-assays blev udført i en modificeret Boyden kammer med filterindsatse (8 um porer) til 12-brønds plader (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). For at vurdere invasion, blev filtre overtrukket med 10 pi Matrigel (10-13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) under på is. Celler (2 x 10 5) blev udpladet i det øverste kammer i 1 ml RPMI uden FBS. Det nedre kammer blev fyldt med 1,5 ml RPMI med FBS. Efter 48 timer i kultur blev celler fikseret med 4% paraformaldehyd og post-fikseret med 0,2% krystalviolet i 20% methanol. Celler på oversiden af ​​filteret, herunder på Matrigel, blev fjernet med en vatpind. Invaderende celler (på den nedre side af filtret) blev fotograferet og talt. Eksperimenter blev udført tre gange.
Immunofluorescens
celler dyrket på dækglas blev fikseret med 1% paraformaldehyd i phosphatbufret saltvand (PBS) i 10 minutter, derefter permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i PBS i 15 minutter og blokeret med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Cellerne blev farvet med museantistoffer mod MYC (fortyndet 1:50; Zymed ®, USA), p53 (fortyndet 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), og FBXW7 (fortyndet 1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Taiwan). Primære antistoffer blev afsløret under anvendelse af et anti-muse Alexa-568-konjugeret sekundært antistof (Invitrogen). Alle inkubationer blev udført i 60 minutter ved stuetemperatur. Kerner blev farvet med DAPI i Prolong anti-fade montering medium (Invitrogen). Negative kontrolprøver blev behandlet som beskrevet ovenfor bortset fra, at primære antistoffer blev udeladt og erstattet med PBS alene.
Western blotting
Protein ekstraktion fra celler blev udført ifølge standardprocedurer. Kort beskrevet blev samlet protein ekstraheret fra ACP02 og ACP03 celler under anvendelse 50 mM Tris-HCI-buffer indeholdende 100 mmol /l NaCl, 50 mM NaF, 1 mM Navo 4, 0,5% NP-40, og komplet proteaseinhibitorcocktail (Roche , Tyskland). Proteinkoncentration blev estimeret ved anvendelse af et Bradford-assay (Sigma-Aldrich). Ca. 30 ug totalt proteinekstrakt blev sat på en 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel og elektroforesebehandlet. Opløste proteiner blev derefter overført fra gelen til en nitrocellulosemembran. Membranen blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 5% Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) og derefter inkuberet med monoklonalt muse-anti-myc (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei City, Taiwan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), og anti-β-actin (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) antistoffer fortyndet 1: 200, 1: 100, 1: 100, og 1: 2.000, henholdsvis. Efterfølgende blev membranerne inkuberet med en 1: 5000 fortynding af peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret fåre-anti-muse-antistof (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) i 1 time ved stuetemperatur. Proteiner blev visualiseret ved forøget kemiluminescens.
Zymografi
ACP02 og ACP03-celler (5 x 10 4 af hver) blev udpladet og fik lov til at klæbe og spredes i mindst 8 timer. Adhærerende celler blev vasket tre gange med PBS, og dyrkningsmediet erstattedes med serum-frit medium i 24 timer. Aktiviteten af ​​MMP2 og MMP9 i det konditionerede medium blev vurderet ved zymografi. Konditioneret medium blev opsamlet, koncentreret (Microcon 30 K, Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland) og resuspenderet i SDS-PAGE-prøvebuffer (uden β-mercaptoethanol). De resterende celler blev lyseret og proteinkoncentrationen blev estimeret ved anvendelse af et BCA-assay (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). I alt 1 ug protein fra hver konditionerede medium blev separeret på 10% polyacrylamidgeler indeholdende 0,2% gelatine. Efter elektroforese blev gelerne vasket i 2,5% Triton X-100 i 30 minutter, derefter ækvilibreret i 10 mM Tris (pH 8,0) og inkuberet ved 37 ° C i 16-24 timer i en udvikling buffer indeholdende 50 mM Tris (pH 8,0 ), 5 mM CaCl 2, og 0,02% NaN 3. Gelerne blev farvet med 0,2% Coomassie blue R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) og affarvet med 1: 1 eddikesyre /methanol-opløsning. Eksperimenter blev udført tre gange. Zymografisk bands, som er tegn på MMP-aktivitet, blev kvantificeret ved scanning densitometri.
Statistiske analyser
normalitet af variable fordelinger blev bestemt under anvendelse af Shapiro-Wilk test. Foreninger mellem MYC
, FBXW7
, og TP53
kopiere nummer variation, mRNA-niveauer, proteinekspression, klinisk-patologiske træk, og celle invasion og migration kapacitet blev analyseret ved hjælp af chi-square (χ 2) og Mann-Whitney test. Korrelation mellem ekspression af de forskellige mål-mRNA'er blev bestemt under anvendelse Spearman test, ved hvilken en værdi under 0,3 indikerede en svag korrelation, 0,3-0,7 indikerede en medium korrelation, og værdier over 0,7 indikerede en stærk korrelation. Data er vist som median og interkvartile område; P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.
Resultater
gastrisk tumor prøver viste forstærkning af MYC
og sletning af FBXW7
og TP53
Tre eller flere kopier af MYC
blev fundet i 51,5% (17/33) af gastriske tumorceller. Derimod 45,5% (15/33) og 21,2% (7/33) af gastriske tumorceller indeholdt kun en kopi af FBXW7
og TP53
henholdsvis.
Associering mellem klinisk-patologiske træk og MYC
er FBXW7
, og TP53
kopi nummer opsummeret i tabel 1. En gastrisk tumor, der indeholdt tre eksemplarer af TP53
blev udelukket fra chi-square analyse. Ingen association blev fundet mellem kopi nummer variation af de undersøgte gener og klinisk-patologiske træk.
MYC
mRNA-ekspression var højere i tumorer end i ikke-neoplastiske prøver, mens FBXW7
og TP53
mRNA-ekspression var lavere i tumorprøver
ekspressionsniveauet af MYC
mRNA (2,01 ± 1,72 gange ændring) i tumor- vævsprøver var signifikant højere end i ikke-neoplastisk væv (p = 0,0002), hvorimod ekspressionsniveauet af FBXW7
mRNA (0,53 ± 0,40 gange ændring) og TP53
mRNA (0,84 ± 0,55 gange ændring) i tumor- vævsprøver var signifikant lavere end i ikke-neoplastisk væv (p < 0,0001 og p = 0,0011, henholdsvis). Vi fandt ikke en signifikant sammenhæng mellem MYC
, FBXW7
, og TP53
mRNA-ekspression (MYC
/FBXW7
mRNA r = -0,3464, p = 0,0562; MYC
/TP53
mRNA r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7
/TP53
mRNA r = -0,0745, p = 0,4747). Således blev opdaget kun en tendens til sammenhæng mellem en stigning i MYC
mRNA udtryk og et fald i FBXW7
mRNA-ekspression.
Tabel 2 opsummerer sammenhængen mellem forskellige klinisk-patologiske træk og RQ af MYC
, FBXW7
, og TP53
mRNA-ekspression i tumor og parrede ikke-neoplastiske prøver. En stigning i MYC
mRNA-niveauet var forbundet med tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastase (p = 0,016) og GC tumor stadium III-IV (p = 0,036). En betydelig reduktion i FBXW7
mRNA-niveauet var også forbundet med tilstedeværelsen lymfeknudemetastase (p = 0,015) og tumor stadium III-IV (p = 0,008) .table 2 MYC, FBXW7 og TP53 mRNA ekspressionsniveauer og klinisk-patologiske faktorer 33 gastrisk kræftpatienter
n (%)
MYC
p-værdi
FBXW7

p værdi
TP53
p-værdi
Median ± IQR
Median ± IQR
Median ± IQR
Alder (y) (gennemsnit ± SD)
> 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%)
2,04 ± 1,35
0,8873
0,55 ± 0,37
0,9247
0,86 ± 0,62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%)
1,44 ± 4,88
0,53 ± 0,50
0,94 ± 1,65
Køn
Mand
15 (45,5%)
2,01 ± 1,01
0,4065
0,53 ± 0,22
0,6353
0,89 ± 0,58
0,8125
Female
18 (54,5%)
1,67 ± 2,03
0,56 ± 0,56
0,87 ± 0,69
Histopatologien
Intestinal
22 (66,7%)
2,06 ± 0,99
0,3525
0,53 ± 0,16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
Diffus
11 (33,3%)
1.40 ± 2.32
0,77 ± 0,74
0,94 ± 0,38
Dybde af tumor invasion
T1
6 (18,2%)
0,89 ± 0,47
0,0857
0,88 ± 0,58
0,0678
0,85 ± 0,15
0,7069
T2-T4
27 (81,8%)
2,08 ± 1,42
0,53 ± 0,43
0,91 ± 0,79
lymfeknudemetastase
Fraværende
13 (39,4%)
0,98 ± 1,09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0,84 ± 0,44
0,6121
Præsenter
20 (60,6%)
2,10 ± 2,20
0,46 ± 0,38
0,94 ± 0,79
Stage
I-II
18 (54,5%)
1,39 ± 1,23
0,0362 *
0,57 ± 0,38
0,0380 *
0,83 ± 0,55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2,41 ± 2,79
0,34 ± 0,45
0,96 ± 1,19
MYC IHC
Positiv
20 (60,6%)
2,18 ± 1,59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0,81 ± 0,57
0,1372
Negativ
13 (39,4%)
0,89 ± 0,85
0,58 ± 0,53
0,99 ± 0,90
p53 IHC
Positiv
7 (21,2%)
4,25 ± 6,53
0,0891
0,64 ± 0,68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
Negativ
26 (78,8%)
2,00 ± 1,44
0,55 ± 0,35
0,87 ± 0,60
* p
< 0,05; IQR:. Interkvartile område
Nuclear MYC proteinfarvning er associeret med intestinal-typen GC
Positiv farvning for nuklear MYC og p53 blev fundet i 64,5% (20/31) og 19,4% (6/31) af GC-prøver henholdsvis (Figur 1). Ingen positivitet blev fundet for FBXW7. Tabel 1 opsummerer de klinisk-patologiske træk og MYC og p53 Immunofarvning resultater. Ekspression af MYC var hyppigere hos intestinal-type end diffus-typen GC (p = 0,007). Endvidere blev MYC immunfarvning forbundet med forøget MYC
mRNA-niveau (p = 0,0022). Ingen association blev fundet mellem p53 immunfarvning og klinisk-patologiske karakteristika, TP53
kopi nummer, eller TP53
mRNA-ekspression. Figur 1 Immunohistokemisk analyse af MYC og p53-protein-ekspression i GC. (A) Negativ MYC immunfarvning i diffust-typen GC; (B) MYC immune positivitet i tarm-typen GC; (C) Positive p53 immunfarvning i diffust-typen GC; (D) p53 immun positivitet i tarm-typen GC (forstørrelse × 40).
Sammenligning af ACP02 og ACP03 cellelinjer
Både ACP02 og ACP03 celler indeholdt tre MYC
kopier og kun én FBXW7
kopi . Antallet af TP53
kopier var ubestemt i begge cellelinier. Sammenlignet med mRNA ekspression i ACP03 celler, ACP02 celler udtrykte et højere niveau af MYC
(1,34 gange) og lavere niveauer af FBXW7
og TP53
mRNA (0.62- og 0,73 gange, henholdsvis).
Western blot-analyser afslørede, at MYC-ekspression var betydeligt højere i ACP02-celler end ACP03 celler (p = 0,048). Desuden FBXW7 ekspression var signifikant lavere i ACP02 celler end ACP03 celler (p = 0,049). Der var imidlertid ingen signifikant forskel i p53-ekspression mellem cellelinierne (p = 0,077) (figur 2A-B).
Immunofluorescensanalyse af begge proteiner viste et punktformet mønster af mærkning, der støtter de Western blot resultater, som viser en stigning i MYC og reduktion i FBXW7 udtryk i ACP02 celler sammenlignet med ACP03 (figur 2). Matrigel invasion assay Resultaterne viste, at ACP02-celler var mere invasiv end ACP03 celler (p = 0,001). Migration assay Resultaterne viste, at færre ACP02 celler migreret mod ACP03-celler (p = 0,0028) (Figur 2C-D). Figur 2 MYC, FBXW7 og p53 udtryk, migration og invasion evne i ACP02 og ACP03. (A) Graf show gennemsnit ± SD af MYC, FBXW7 og p53-proteinekspression i ACP02 og ACP03. Disse proteiner blev normaliseret til niveauet af beta actin; (B) Repræsentative data for MYC, FBXW7 og p53 protein udtryk; (C-D) Grafer viser middelværdi ± SD af migration og invasive celler tre eksemplarer assay; (E) Repræsentative resultater af MYC, FBXW7 og p53 immunofluorescens
Både ACP02 og ACP03 celler præsenteres fire Gelatinaseaktivitet bands:. MMP-9 latent (92 kDa), MMP-9 aktiv (88 kDa), MMP-2 latent ( 72 kDa), og MMP-2 aktiv (66 kDa) (figur 3). Vi fandt ingen signifikante forskelle i MMP-9 latent (p = 0,9788), MMP-2 aktiv (p = 0,7848), og MMP-2 latent (p = 0,1678) mellem ACP02 og ACP03-celler. Imidlertid blev fundet signifikante forskelle mellem ACP02 og ACP03-celler med hensyn til MMP-9 aktiv (p = 0,0182). Figur 3 repræsentant gelatinezymografi analyse af MMP-2 og MMP-9-aktivitet i ACP02 og ACP03. (A) bånd svarende til både latente og aktive former af MMP-2 og MMP-9 blev observeret i ACP02 og ACP03. Densitometriske analyser er af bånd svarende til latent og aktive former af MMP-2 (B) og MMP-9 (C).
Diskussion
I den aktuelle undersøgelse, vi observeret, at MYC
mRNA-ekspression blev forøget i GC-prøver sammenlignet med tilsvarende ikke-neoplastiske prøver. Hertil kommer, at vi ved, er dette den første undersøgelse for at rapportere en sammenhæng mellem øget MYC
mRNA-ekspression og tilstedeværelsen af ​​lymfeknude metastaser og CG stadie III-IV, styrke tanken om, at MYC
deregulering er en stærk faktor for malignitet i GC.
Adams et al
. [20] og Leder et al.
[21] viste, at MYC
mRNA-ekspression deregulering kan fremme udviklingen af ​​kræft i transgene musemodeller. Stigningen i MYC
mRNA-niveau i humane kræftformer kan skyldes både direkte og indirekte mekanismer, som kan have flere forklaringer. Første, MYC
amplifikation er den mest almindelige mekanisme af MYC
deregulering i GC [5]. Denne mekanisme fører til øget produktion af onkogene produkter i mængder, der overstiger den transkriptionelle kapacitet af en normal dobbelt kopi-gen. Her observerede vi tre eller flere MYC
gen kopier i 51,5% af gastriske tumorer prøver. Tidligere undersøgelser fra vores gruppe viste også, at MYC
forstærkning eller trisomi af kromosom 8, hvor MYC
ligger, var til stede i alle GC undersøgte prøver fra individer i det nordlige Brasilien, samt i GC cellelinjer er fastsat af vores gruppe fra tumorer i brasilianske patienter [18, 22-27]. Tilstedeværelsen af ​​MYC
forstærkning er også blevet rapporteret i plasmaprøver fra individer med GC [28]. Men ingen direkte sammenhæng mellem MYC
kopiere, nummer variation og mRNA-ekspression blev påvist i den foreliggende undersøgelse.
Andet kan stigningen i MYC
mRNA-ekspression skyldes konsekvent rekombination mellem immunoglobulin (Ig) locus og den MYC
oncogen. Dette fænomen er ofte beskrevet i Burkitts lymfom og er forbundet med en længere halveringstid af MYC
mRNA i berørte celler [29]. Tidligere vores forskningsgruppe observerede MYC
indrykninger i diffus type GC primært i kromosomer, der er kortlagt til gener af immunglobuliner (kromosomer 2, 14 og 22) [26]. Således kan kromosomale translokationer involverer MYC
locus (8q24) i diffust-typen CG i personer fra det nordlige Brasilien også afspejle en stigning i MYC
mRNA-niveau.
Immunhistokemi (IHC) analyse afslørede, at MYC udtryk er oftere fundet i tarm-typen GC end diffus-type GC prøver. Disse ændringer kan føre til en unormal MYC protein, som ikke genkendes af nogen af ​​de anvendte antistoffer i den foreliggende undersøgelse. Desuden observerede vi en sammenhæng mellem MYC
mRNA udtryk niveau og MYC farvning. Endvidere posttranskriptionel mekanismer styrer MYC stabilitet [6, 30]. MYC
deregulering har været forbundet med tab af FBXW7
, en haploinsufficient tumorsuppressorgen. Generelt kan FBXW7
tab skyldes tab af heterozygositet (LOH) og mutation [30]. Tabet på 4q den FBXW7
locus, er en tilbagevendende kromosomale ændringer i GC [31, 32], og FBXW7
mutationer er blevet fundet i 3,7-6% af gastriske tumorer [12].
In den foreliggende undersøgelse, observerede vi kun én kopi af FBXW7
genet i 45,16% af de gastriske tumorer undersøgt. Interessant er FBXW7
mRNA-ekspression i GC-prøver markant nedsat i sammenligning med tilsvarende ikke-neoplastisk væv. Desuden blev FBXW7
mRNA-ekspression deregulering forbundet med tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastase og GC stadium III-IV, som det også blev observeret med MYC
mRNA. Disse resultater underbygger arbejde Yokobori el al.
[13], som også viste en sammenhæng mellem reduceret FBXW7
mRNA-ekspression og lymfeknude metastaser, der bidrager til den maligne potentiale GC celler og resulterer i dårlig prognose. Desuden observerede vi, at ekspressionen af ​​MYC
og FBXW7
mRNA tendens til at blive omvendt korreleret i nærværende undersøgelse.
Adskillige undersøgelser viste, at MYC
inaktivering undertrykker tumorer i dyr, hvilket antyder, at MYC
kan være et molekylært mål i kræftbehandlingen [33-35]. Alternativt Soucek et al
. [36] foreslået, at FBXW7 kunne lette "tumor vækstdvale terapi". Således kan MYC nedbrydning med FBXW7 ikke blot inducere en tilstand af tumor hviletilstand, men kunne også have en anti-tumor effekt. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Helicobacter pylori infektion og cirkulerende ghrelin niveauer - En systematisk gennemgang
• "Fast track" genoptræning efter mavekræft resektion: erfaring med 80 på hinanden følgende cases