MYC, FBXW7 og TP53 kopiere nummer variasjon og uttrykk i Gastric Cancer

MYC, FBXW7 Hotell og TP53
kopiere nummer variasjon og uttrykk i Gastric Cancer
Abstract
Bakgrunn
MYC deregulering er en vanlig hendelse i mage karsinogenese, vanligvis som følge av genamplifikasjon, translokasjon eller posttranslational mekanismer. FBXW7
er en p53-kontrollerte tumor-suppressor som spiller en rolle i regulering av cellesyklus exit og reentry via MYC degradering.
Metoder
Vi evaluerte MYC
, FBXW7
, og TP53
kopiantall, mRNA nivåer, og protein uttrykk i magekreft og sammenkoblede røyk neoplastiske prøver fra 33 pasienter, og også i mage adenokarsinom cellelinjer. Vi har også bestemt invasjonen potensialet av mage kreft cellelinjer.
Resultater
MYC
forsterkning ble observert hos 51,5% av mage tumorprøver. Sletting av en kopi av FBXW7 Hotell og TP53
ble observert i 45,5% og 21,2% av mage svulster, henholdsvis. MYC
mRNA-ekspresjon var signifikant høyere i tumorer enn i ikke-neoplastiske prøver. FBXW7 Hotell og TP53
mRNA uttrykk var markert lavere i tumorer enn i sammenkoblede røyk neoplastiske prøver. Dessuten ble deregulert MYC
og FBXW7
mRNA-ekspresjonen forbundet med nærværet av lymfeknutemetastase og tumor stadium III-IV. I tillegg MYC farging ble oftere observert i intestinal-type enn diffuse-type mage kreft og var assosiert med MYC
mRNA uttrykk. In vitro studier viste at økt MYC og redusert FBXW7 ekspresjon er assosiert med et mer invasive fenotype i magecancercellelinjer. Dette resultatet oppmuntret oss for å undersøke aktiviteten av gelatinaser MMP-2 og MMP-9 i begge cellelinjer. Begge gelatinaser syntetiseres hovedsakelig av stromale celler i stedet for kreftceller, og det har blitt foreslått at både bidra til progresjon av kreft. Vi har observert en signifikant økning i MMP-9 aktivitet i ACP02 sammenlignet med ACP03 celler. Disse resultatene bekrefter at ACP02 celler har større evne enn invasjon ACP03 celler.
Konklusjon
Som konklusjon kan FBXW7 og MYC mRNA spille en rolle i biologisk aggressiv oppførsel av magekreftceller, og kan være en nyttig indikator på dårlig prognose. Videre er MYC en kandidat mål for nye behandlingsformer mot magekreft.
Nøkkelord
Magekreft MYC FBXW7 TP53 Bakgrunn
Magekreft (GC) er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft død på verdensbasis [1]. GC regnes som en stor folkehelseproblem, spesielt i utviklingsland, inkludert Brasil [2]., En grunnleggende del av kreftutvikling er ukontrollert celledeling skyldes opphopning av endringer som fremmer uttrykk eller undertrykkelse av cellesyklus-kontroll gener [3]. MYC
er en transkripsjonsfaktor som er involvert i cellesyklusregulering og cellevekst arrest som vanligvis deregulert i kreft, og har blitt beskrevet som en sentral del av magekreft [4, 5]. Flere forskjellige typer av posttranslational modifikasjoner av MYC er blitt beskrevet, inkludert fosforylering, acetylering, og ubiquitinering [6]. Ubiquitin-proteasom-systemet er hovedproteinet degradering reguleringsveien som er involvert i celledifferensiering og vekst kontroll [7]. FBXW7
koder en F-box protein subenhet av Skp1 /Cul1 /F-box kompleks (SCF) ubiquitin ligase kompleks. SCF FBXW7 induserer nedbrytning av produktene av positive cellesyklus regulatoriske gener, for eksempel cyclin E
, MYC
, HAKK
, og juni
, gjennom fosforylering avhengig ubiquitinering [8]. Blant SCF FBXW7 underlag, er MYC spesielt viktig i cellesyklus exit fordi det antas å spille en rolle i å avgjøre om pattedyrceller dele eller ikke [9] deregulert FBXW7
.
Uttrykk er en viktig årsak av kreftutvikling [10-12]. Tap av FBXW7
ekspresjon kan føre til MYC overekspresjon og har vært assosiert med dårlig prognose i GC-pasienter [13]. Men MYC aktivering av FBXW7
tap utløser aktivering av p53, som spiller en sentral rolle i regulering av cellulære responser til DNA-skader og unormal uttrykk for onkogener. Induksjon av cellesyklus arrest av p53 åpner for DNA-reparasjon eller apoptoseinduksjon [14]. Dermed er samtidig tap av FBXW7 Hotell og TP53
nødvendig å indusere genetisk ustabilitet og tumorigenesis [11].
I denne studien undersøkte vi MYC
, FBXW7
, og TP53
genkopitallet variasjon og mRNA og protein uttrykk i GC prøver og mage adenokarsinom cellelinjer. Mulige sammenhenger mellom våre funn og clinicopathological funksjoner og /eller invasjon og migrasjon evne til cellelinjene ble også vurdert.
Metoder
kliniske prøver
Prøver ble hentet fra 33 GC pasienter som gjennomgikk kirurgisk behandling på João de Barros Barreto universitetssykehus i Pará stat, Brasil. Dissekert tumor og sammenkoblede ikke-neoplastiske vevsprøver ble umiddelbart skåret fra magen og frosset i flytende nitrogen inntil RNA-ekstraksjon.
Den clinicopathological funksjonene i pasientprøvene er vist i tabell 1. GC prøver ble klassifisert i henhold til Lauren [15] . Alle GC prøvene viste tilstedeværelsen av Helicobacter pylori
, og den CagA virulens faktor ble bestemt ved hjelp av PCR-analyse av urea og
CagA
som beskrevet av Clayton et al
. [16] og Covacci et al.
[17], respektivt. Alle pasientene hadde negative historier av eksponering for enten kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen, og det var ingen andre co-forekomster av diagnostisert kreft. Informert samtykke med godkjenning av etiske komité for Federal University of Pará var obtained.Table en MYC, FBXW7 og TP53 genkopitallet variasjon, MYC og p53 protein uttrykk og clinicopathological funksjoner i 33 GC pasienter
CNV MYC <.no> CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 eksemplarer (n = 16)
≥ 3 eksemplarer (n = 17)
p- verdi
2 eksemplarer (n = 18)
en kopi (n = 15)
p- verdi
2 eksemplarer (n = 25)
en kopi (n = 7)
p - verdien
P (n = 19)
N (n = 14)
p- verdi
P (n = 6)
N (n = 25)
p- verdi
Age (y) (gjennomsnitt ± SD)
> 50 (65.3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2)
9
5
6
8
10
4
10
9
2
17
Kjønn
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10
12
6
8
10
5
13
Histopatologi
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9
1 3
8
1 10
Dybde av tumorinvasjon
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
lymfeknutemetastaser
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10
10
15
4
13
7
5
15
Stage
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11
4
8
7
4
11
MYC IHC
Negativ
5
8
0,481
7
6
1,000
11
2
0,671
Positive
11
9
11
9
14
5
p53 IHC
Negativ
14
12
0,398
14
12
1,000
21
4
0.157
positive
2
5
4
3
4
3 product: * p
< 0,05; P: positiv N:. negativ
cellelinjer
Gastric adenocarcinoma cellelinjer ACP02 og ACP03 [18] ble dyrket i komplett RPMI-medium (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin, og 1% kanamycin.
Kopier nummer variasjon (CNV)
DNA ble ekstrahert ved hjelp av en DNAQiamp mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Duplex kvantitativ real-time PCR (real-time qPCR) ble utført ved hjelp av FAM /MGB-merket TaqMan prober for MYC plakater (Hs01764918_cn), FBXW7 plakater (Hs01362464_cn), eller TP53 plakater (Hs06423639_cn), og VIC /TAMRA-merket TaqMan CNV RNAse P product: (Ƹ3326) ble anvendt for intern kontroll. Alle sanntid qPCR reaksjoner ble utført i fire eksemplarer med gDNA henhold til produsentens protokollen ved hjelp av en 7500 Fast Real-Time PCR system (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Kopien antall av hver prøve ble anslått av CNV analyse ved hjelp av Kopier Caller Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Kjent humant genomisk DNA (Promega, Madison, USA) ble brukt for kalibrering.
Kvantitativ real-time revers transkriptase PCR
Total RNA ble ekstrahert med TRI Reagens ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, USA ) etter produsentens anvisninger. RNA-konsentrasjon og kvalitet ble bestemt ved anvendelse av et Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) og 1% agarosegeler. Komplementær DNA (cDNA) ble syntetisert ved hjelp av en High-Capacity cDNA Arkiv kit i henhold til produsentens anbefalinger (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Sanntids qPCR primere og TaqMan prober rettet mot MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7 plakater (Hs00217794_m1), og TP53 plakater (Hs01034249_m1) ble kjøpt som Analyser-on-demand-produkter for Gene Expression ((Life Technologies, . Foster City, CA, USA) real time qPCR ble utført ved hjelp av en ABI Prism 7500 system (Life Technologies, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner GAPDH plakater (NM_002046.3;. Livet Technology, USA) ble valgt som en intern kontroll for overvåking av RNA-inngang og revers transkripsjon effektivitet. Alt i sanntid qPCR reaksjoner for målgener og interne kontroller ble utført i triplikat på samme plate. den relative kvantifiseringen (RQ) av genekspresjon ble beregnet ved anvendelse av ΔΔCt Fremgangsmåten [19], hvori den ikke-neoplastiske prøve ble betegnet som en kalibrator for hver sammenkoblet tumorprøve.
Immunhistokjemi
Immunhistokjemisk analyse for MYC og p53 ble utført på formalinfikserte, parafininnstøpte kirurgiske seksjoner. Serielle 3-um seksjoner ble anvendt. Heat-indusert antigen henting ble ansatt (mikroprosessorstyrt press Pascal ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). En universell peroksydase-konjugert sekundært antistoff kit (LSAB System, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) ble anvendt for påvisning med diaminobenzidin (DAB) som kromogen. Følgende primære antistoffer ble brukt: mus monoklonale antistoffer rettet mot MYC (fortynning 1: 150; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA og klone 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (fortynning 1:50, Abnova Corp., Taipei City, Taiwan), og p53 (fortynning 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Positive protein ekspresjon ble definert som klart nukleær farging på mer enn 10% av cellene.
Migrering og invasjon assay
migrering og invasjon analyser ble utført i et modifisert Boyden kammer med filterinnsatser (8-um porer) for 12-brønners plater (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). For å vurdere invasjonen, ble filtre belagt med 10 ul Matrigel (10-13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) mens på is. Celler (2 x 10 5) ble sådd ut i det øvre kammer i 1 ml RPMI uten FBS. Det nedre kammer ble fylt med 1,5 ml RPMI med FBS. Etter 48 timer i kultur ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd og post-fiksert med 0,2% krystallfiolett i 20% metanol. Celler på den øvre side av filteret, inkludert de i Matrigel, ble fjernet med en bomullspinne. Invaderende celler (på undersiden av filteret) ble fotografert og tellet. Forsøk ble utført in triplo.
Immunfluorescens
Celler dyrket på dekkglass ble fiksert med 1% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 10 minutter, deretter permeabilisert med 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i PBS i 15 minutter og blokkert med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Cellene ble farget med mus antistoffer mot MYC (fortynnet 1:50; Zymed ®, USA), p53 (fortynnet 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), og FBXW7 (fortynnet 1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Taiwan). Primære antistoffer ble avslørt ved hjelp av et anti-mus Alexa-568-konjugert sekundært antistoff (Invitrogen). Alle inkubasjoner ble utført i 60 minutter ved romtemperatur. Kjerner ble farget med DAPI i Forleng anti-fade montering medium (Invitrogen). Negative kontrollprøver ble bearbeidet som beskrevet ovenfor, bortsett fra at det primære antistoffer ble utelatt og erstattet med PBS alene.
Western blotting
Protein ekstraksjon fra celler ble utført i henhold til standardprosedyrer. I korthet, ble totalt protein ekstrahert fra ACP02 og ACP03 celler ved hjelp av 50 mM Tris-HCl-buffer inneholdende 100 mmol /l NaCl, 50 mM NaF, 1 mM NAVO 4, 0,5% NP-40, og fullstendig protease inhibitor cocktail (Roche , Tyskland). Proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved hjelp av en Bradford-analyse (Sigma-Aldrich). Omtrent 30 ug av total proteinekstrakt ble applisert på en 12% natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) gel og elektroforert. Løst proteiner ble så overført fra gelen til en nitrocellulosemembran. Membranen ble blokkert med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 5% Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) og deretter inkubert med muse-monoklonalt anti-myc (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei City, Taiwan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), og anti-β-aktin (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) antistoffer fortynnet 1: 200, 1: 100, 1: 100 og 1: 2000, respektivt. Deretter ble membranene inkubert med en 1: 5000 fortynning av pepperrotperoksydase (HRP) -konjugert sau anti-mus-antistoff (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) i 1 time ved romtemperatur. Proteinene ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens.
Zymografi
ACP02 og ACP03 celler (5 × 10 4 av hver) ble belagt og lov til å overholde og spre i minst 8 timer. Adherente celler ble vasket tre ganger med PBS, og dyrkningsmediet ble erstattet med serum-fritt medium i 24 timer. Aktiviteten av MMP2 og MMP9 i det kondisjonerte medium ble bedømt ved zymografi. Kondisjonert medium ble samlet, konsentrert (Microcon 30 K, Millipore Merck, Darmstadt, Tyskland) og resuspendert i SDS-PAGE prøvebuffer (uten β-merkaptoetanol). De resterende cellene ble lysert og proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved hjelp av en BCA assay (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). En total på 1 ug protein fra hvert kondisjonert medium ble separert på 10% polyakrylamidgeler inneholdende 0,2% gelatin. Etter elektroforese, ble gelene vasket i 2,5% Triton X-100 i 30 minutter og deretter ekvilibrert i 10 mM Tris (pH 8,0) og inkubert ved 37 ° C i 16-24 timer i en utvikling buffer inneholdende 50 mM Tris (pH 8,0 ), 5 mM CaCl 2, og 0,02% NaN 3. Gelene ble beiset med 0,2% Coomassie blått R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) og avfarget med 1: 1 eddiksyre /metanol-oppløsning. Forsøk ble utført in triplo. Zymographic band, som er en indikasjon på MMP-aktivitet, ble kvantifisert ved å skanne densitometri.
Statistiske analyser
normaliteten av variable fordelinger ble bestemt ved bruk av Shapiro-Wilk test. Sammenhenger mellom MYC
, FBXW7
, og TP53
kopiere nummer variasjon, mRNA nivåer, protein uttrykk, clinicopathological funksjoner, og celle invasjon og migrasjon evne ble analysert ved hjelp av chi-square (χ 2) og Mann-Whitney tester. Korrelasjon mellom ekspresjon av de forskjellige mål-mRNA-er ble bestemt ved bruk av Spearmans test, hvor en verdi under 0,3 indikerte en svak korrelasjon, 0,3-0,7 indikert en korrelasjon medium, og verdier over 0,7 viste en sterk korrelasjon. Data er vist som median og interkvartilt område; p mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant verdier. Search Results
Gastric vevsprøver viste forsterkning av MYC Hotell og sletting av FBXW7 Hotell og TP53
Tre eller flere eksemplarer av MYC
ble funnet i 51,5% (17/33) av gastrisk tumorceller. I motsetning til 45,5% (15/33) og 21,2% (7/33) av magekreftceller inneholdt bare ett eksemplar av FBXW7 Hotell og TP53
hhv.
Sammenheng mellom clinicopathological funksjoner og MYC
, er FBXW7
, og TP53
kopiere nummer oppsummert i tabell 1. en gastric svulst som inneholdt tre eksemplarer av TP53
ble utelukket fra chi-kvadrat analyse. Ingen sammenheng ble funnet mellom kopi antall variant av gener studert og clinicopathological funksjoner.
MYC
mRNA uttrykk var høyere i tumorer enn i ikke-neoplastiske eksemplarer, mens FBXW7 Hotell og TP53
mRNA uttrykk var lavere i tumorprøver
ekspresjonsnivået av MYC
mRNA (2,01 ± 1,72 ganger endring) i tumor vevsprøver var betydelig høyere enn i ikke-neoplastisk vev (p = 0,0002), mens ekspresjonsnivået av FBXW7
mRNA (0,53 ± 0,40 ganger endring) og TP53
mRNA (0,84 ± 0,55 ganger endring) i tumor vevsprøver var betydelig lavere enn i ikke-neoplastisk vev (p < 0,0001 og p = 0,0011, henholdsvis). Vi fant ikke signifikant korrelasjon mellom MYC
, FBXW7
, og TP53
mRNA uttrykk (MYC Twitter /FBXW7
mRNA r = -0,3464, p = 0,0562; MYC Twitter /TP53
mRNA r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7 Twitter /TP53
mRNA r = -0,0745, p = 0,4747). Således ble bare en tendens til sammenheng mellom økning i MYC
mRNA-ekspresjon og en reduksjon i FBXW7
mRNA-ekspresjon detektert.
Tabell 2 oppsummerer assosiasjoner mellom forskjellige clinicopathological trekk og RQ av MYC
, FBXW7
, og TP53
mRNA uttrykk i tumor og sammenkoblede røyk neoplastiske prøver. En økning i MYC
mRNA-nivået ble assosiert med tilstedeværelse av lymfeknutemetastaser (p = 0,016) og GC tumor stadium III-IV (p = 0,036). En betydelig reduksjon i FBXW7
mRNA-nivået ble også assosiert med tilstedeværelse lymfeknutemetastase (p = 0,015) og tumor stadium III-IV (p = 0,008) .table 2 MYC, FBXW7 og TP53 mRNA-ekspresjonsnivåene og clinicopathological faktorene 33 mage kreftpasienter
n (%)
MYC
p- verdi
FBXW7

p- verdi
TP53
p- verdi
Median ± IQR
Median ± IQR
Median ± IQR
Age (y) (gjennomsnitt ± SD)
> 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%)
2.04 ± 1.35
0,8873
0,55 ± 0,37
0,9247
0,86 ± 0,62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%)
1,44 ± 4,88
0,53 ± 0,50
0,94 ± 1,65
Kjønn
Mann fra 15 (45,5%)
2.01 ± 1.01
0,4065
0,53 ± 0,22
0,6353
0,89 ± 0,58
0,8125
Kvinne
18 (54,5%)
1,67 ± 2,03
0,56 ± 0,56
0,87 ± 0,69
Histopatologi
Tarm
22 (66,7%)
2.06 ± 0.99
0,3525
0,53 ± 0,16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
Diffuse
11 (33,3%)
1.40 ± 2.32
0,77 ± 0,74
0,94 ± 0,38
Dybde av tumorinvasjon
T1
6 (18,2%)
0,89 ± 0,47
0,0857
0,88 ± 0,58
0,0678
0,85 ± 0,15
0,7069
T2-T4
27 (81,8%)
2.08 ± 1.42
0,53 ± 0,43
0,91 ± 0,79
lymfeknutemetastaser
Fraværende
13 (39,4%)
0,98 ± 1,09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0,84 ± 0,44
0,6121
Presenter
20 (60,6%)
2,10 ± 2,20
0,46 ± 0,38
0,94 ± 0,79
Stage
I-II
18 (54,5%)
1.39 ± 1.23
0,0362 *
0,57 ± 0,38
0,0380 *
0,83 ± 0,55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2.41 ± 2.79
0,34 ± 0,45
0.96 ± 1.19
MYC IHC
Positiv
20 (60,6%)
2.18 ± 1.59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0,81 ± 0,57
0,1372
Negativ
13 (39,4%)
0,89 ± 0,85
0,58 ± 0,53
0,99 ± 0,90
p53 IHC
Positiv
7 (21,2%)
4,25 ± 6,53
0,0891
0,64 ± 0,68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
Negativ
26 (78,8%)
2,00 ± 1,44
0,55 ± 0,35
0,87 ± 0,60
* p
< 0,05; IQR. Interkvartilt Nuclear MYC protein flekker utvalg
er assosiert med tarm-type GC
positiv farging for atom MYC og p53 ble funnet i 64,5% (20/31) og 19,4% (6/31) av GC prøver henholdsvis (figur 1). Ingen positivitet ble funnet for FBXW7. Tabell 1 oppsummerer clinicopathological funksjoner og MYC og p53 farging resultater. Uttrykk av MYC var hyppigere i intestinal-type enn diffuse-type GC (p = 0,007). Videre ble MYC immunofarging assosiert med økt MYC
mRNA nivå (p = 0,0022). Ingen sammenheng ble funnet mellom p53 farging og clinicopathological egenskaper, TP53
kopiantall, eller TP53
mRNA uttrykk. Figur 1 Immunhistokjemisk analyse av MYC og p53 protein uttrykk i GC. (A) Negativ MYC immunfarging i diffust-type GC; (B) MYC immun positivitet i intestinal-type GC; (C) Positiv p53 immunfarging i diffust-type GC; (D) p53 immun positivitet i intestinal-type GC (forstørrelse × 40). Host Sammenligning av ACP02 og ACP03 cellelinjer
Begge ACP02 og ACP03 cellene inneholdt tre MYC
eksemplarer og bare en FBXW7
kopi . Antallet TP53
eksemplarer var ubestemt i begge cellelinjer. Sammenlignet med mRNA-ekspresjon i celler ACP03, ACP02 celler uttrykte et høyere nivå av MYC plakater (1,34 ganger) og lavere nivåer av FBXW7
og TP53
mRNA (0.62- og 0,73 ganger respektivt,).
Western blot-analyser viste at MYC ekspresjon var betydelig høyere i cellene ACP02 enn ACP03 celler (p = 0,048). Videre FBXW7 uttrykk var betydelig lavere i ACP02 celler enn ACP03 celler (p = 0,049). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i p53-ekspresjon mellom cellelinjer (p = 0,077) (figur 2A-B).
Immunofluorescens-analyse av begge proteiner viste et punktformet mønster av merking, og støtter Western blot resultater som viser en økning i MYC og reduksjon i FBXW7 ekspresjon i ACP02 celler sammenlignet med ACP03 (figur 2). Matrigel invasjonen analyseresultatene viste at ACP02 celler var mer omfattende enn ACP03 celler (p = 0,001). Migrasjon analyseresultatene viste at færre ACP02 celler migrert sammenlignet med ACP03 celler (p = 0,0028) (figur 2C-D). Figur 2 MYC, FBXW7 og p53 uttrykk, migrasjon og invasjon evne i ACP02 og ACP03. (A) Diagram viser gjennomsnitt ± SD av MYC, FBXW7 og p53 protein uttrykk i ACP02 og ACP03. Disse proteinene ble normalisert til nivået av beta-aktin; (B) Representative data av MYC, FBXW7 og p53 protein uttrykk; (C-D) Grafer viser gjennomsnitt ± SD av migrasjon og invasive celler triplicates analysen; (E) Representative resultatene av MYC, FBXW7 og p53 immunfluorescens
Både ACP02 og ACP03 celler som presenteres fire gelatinase aktivitet band:. MMP-9 latent (92 kDa), MMP-9 aktiv (88 kDa), MMP-2 latent ( 72 kDa) og MMP-2 aktiv (66 kDa) (figur 3). Vi fant ingen signifikante forskjeller i MMP-9 latent (p = 0,9788), MMP-2 aktiv (p = 0,7848), og MMP-2 latent (p = 0,1678) mellom ACP02 og ACP03 celler. Men signifikante forskjeller ble funnet mellom ACP02 og ACP03 celler med hensyn til MMP-9 aktiv (p = 0,0182). Figur 3 Representative gelatin zymografi analyse av MMP-2 og MMP-9 aktivitet i ACP02 og ACP03. (A) bånd tilsvarende både latent og aktive former av MMP-2 og MMP-9 ble observert i ACP02 og ACP03. Densitometriske analyser er av bandene som tilsvarer latent og aktive former av MMP-2 (B) og MMP-9 (C).
Diskusjon
I denne studien har vi observert at MYC
mRNA uttrykk ble økt i GC prøvene sammenlignet med tilsvarende ikke-neoplastiske prøver. I tillegg til vår kunnskap, er dette den første studien for å rapportere en sammenheng mellom økt MYC
mRNA uttrykk og tilstedeværelse av lymfeknutemetastaser og CG stadium III-IV, forsterker ideen om at MYC
deregulering er en sterk faktor for malignitet i GC.
Adams et al
. [20] og Leder et al.
[21] har vist at MYC
mRNA-ekspresjon dereguleringen kan bidra til utvikling av kreft i transgene musemodeller. Økningen i MYC
mRNA nivå i humane kreftformer kan skyldes både direkte og indirekte mekanismer, som kan ha flere forklaringer. For det første er MYC
amplifikasjon den mest vanlige mekanismen for MYC
deregulering i GC [5]. Denne mekanismen fører til økt produksjon av onkogene produkter i mengder som overskrider den transkripsjonelle kapasiteten av en vanlig dobbel kopigen. Her observerte vi tre eller flere MYC
genkopier i 51,5% av mage svulster prøver. Tidligere studier fra vårt gruppe viste også at MYC
amplifikasjon eller trisomy av kromosom 8, på hvilken MYC
ligger, var til stede i alle GC undersøkte prøvene fra individer i Nord-Brasil, samt i GC-cellelinjer etablert etter vår gruppe fra svulster i brasilianske pasienter [18, 22-27]. Tilstedeværelsen av MYC
forsterkning er også blitt rapportert i plasmaprøver fra individer med GC [28]. Imidlertid ingen direkte sammenheng mellom myc
kopitall variasjon og mRNA-ekspresjon ble påvist i den foreliggende undersøkelse.
For det andre, var økningen i MYC
mRNA-ekspresjon kan resultere fra konsistent rekombinasjon mellom immunoglobulin (Ig) locus og den MYC
onkogen. Dette fenomenet er ofte beskrevet i Burkitt lymfom og er forbundet med en lengre halveringstid på MYC
mRNA i rammede celler [29]. Tidligere observert vår forskningsgruppe MYC
innsettinger i diffuse-type GC hovedsakelig i kromosomer som er tilordnet gener av immunglobuliner (kromosomer 2, 14 og 22) [26]. Dermed kan translokasjon involverer MYC
locus (8q24) i diffuse-type CG hos personer fra Nord-Brasil også gjenspeile en økning i MYC
mRNA nivå.
Immunohistochemistry (IHC) analyse viste at MYC uttrykk er mer ofte funnet i intestinal-type GC enn diffus-type GC prøver. Disse forandringer kan føre til en unormal MYC protein som ikke gjenkjennes av hver av antistoffene anvendt i denne studien. Videre observerte vi en sammenheng mellom MYC
mRNA uttrykk nivå og MYC farging. Videre posttranskripsjonelt mekanismer styrer MYC stabilitet [6, 30]. MYC
deregulering har vært assosiert med tap av FBXW7
, en haploinsufficient tumor suppressor genet. Generelt kan FBXW7
tap være forårsaket av tap av heterozygositet (LOH) og mutasjon [30]. Tapet på 4Q, det FBXW7
locus, er et tilbakevendende kromosom endringer i GC [31, 32], og FBXW7
mutasjoner er funnet i 3,7 til 6% av mage svulster [12].
I denne studien, observerte vi bare én kopi av FBXW7
genet i 45,16% av mage svulster studert. Interessant er FBXW7
mRNA uttrykk i GC prøvene markert redusert sammenlignet med tilsvarende ikke-neoplastisk vev. I tillegg ble FBXW7
mRNA-ekspresjon deregulering assosiert med tilstedeværelse av lymfeknutemetastase og GC stadium III-IV, som ble også observert med MYC
mRNA. Disse funnene underbygge arbeidet Yokobori el al.
[13], som også viste en sammenheng mellom redusert FBXW7
mRNA uttrykk og lymfeknutemetastase som bidrar til ondartet potensialet i GC celler og fører til dårlig prognose. Videre observerte vi at uttrykket av MYC Hotell og FBXW7
mRNA tendens til å være omvendt korrelert i denne studien.
Flere studier viste at MYC
inaktive undertrykker svulster i dyr, noe som tyder på at MYC
kan være en molekylære mål i kreftbehandling [33-35]. Alternativt Soucek et al
. [36] foreslått at FBXW7 kan lette "svulst dvalen terapi". Således kan MYC degradering ved FBXW7 ikke bare indusere en tilstand av svulst uvirksom, men kan også ha en anti-tumoreffekt. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Helicobacter pylori infeksjon og sirkulerende ghrelin nivåer - En systematisk review
• "Fast track" rehabilitering etter magekreft reseksjon: erfaring med 80 sammenhengende cases