MYC, FBXW7 и TP53 вариации числа копий и экспрессия в желудочном Cancer

MYC, FBXW7
и TP53
копировать изменение числа и выражение в рак желудка
Аннотация
Справочная информация
MYC дерегуляции является обычным явлением в рака желудка, как правило, в результате амплификации гена, хромосомные транслокации или посттрансляционных механизмов. FBXW7
является p53 под контролем опухоль-супрессоров, который играет роль в регуляции клеточного цикла выхода и входа в атмосферу с помощью деградации MYC.
Методы
Мы оценили MYC
, FBXW7
и TP53
количество копий, уровни мРНК и экспрессию белка при раке желудка и парными неопухолевых образцов из 33 пациентов, а также в аденокарциномы желудка клеточных линий. Мы также определили вторжения потенциал желудочных линий раковых клеток.

Результаты MYC
усиление наблюдалось в 51,5% желудочных образцов опухолей. Удаление одной копии FBXW7
и TP53
наблюдалась в 45,5% и 21,2% опухолей желудка, соответственно. Мус
экспрессия мРНК в опухолях значительно выше, чем в неопухолевых образцах. FBXW7
и TP53
экспрессия мРНК в опухолях заметно ниже, чем в парных неопухолевых образцах. Кроме того, дерегулирование MYC
и FBXW7
экспрессия мРНК была связана с наличием метастазов в лимфатических узлах и опухоли стадии III-IV. Кроме того, MYC иммунное чаще наблюдалось в кишечном типа, чем рака диффузного типа язвы желудка и был связан с MYC
экспрессии мРНК. В пробирке исследования показали, что увеличение MYC и снижение экспрессии FBXW7 связано с более инвазивного фенотипа в желудочном линиях раковых клеток. Этот результат побудило нас исследовать активность желатиназ ММР-2 и ММР-9 в обеих клеточных линиях. Оба Желатиназы синтезируются преимущественно стромальных клеток, а не раковых клеток, и было высказано предположение, что оба способствуют прогрессированию рака. Мы наблюдали значительное увеличение ММР-9 активности в ACP02 по сравнению с ACP03 клетками. Эти результаты подтвердили, что ACP02 клетки имеют больше возможностей вторжения, чем клетки ACP03.
Заключение
В заключение FBXW7 и мРНК MYC может играть определенную роль в агрессивном поведении биологических клеток рака желудка и может быть полезным индикатором плохого прогноза. Кроме того, MYC является целевым кандидатом для новых методов лечения против рака желудка.
Ключевые слова
рак желудка MYC FBXW7 TP53 фон
рак желудка (GC) является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй ведущей причиной смерти от рака во всем мире [1]. GC считается серьезной проблемой общественного здравоохранения, особенно в развивающихся странах, в том числе в Бразилии [2].
Фундаментальный аспект канцерогенеза является неконтролируемое разрастание клеток в результате накопления изменений, которые способствуют экспрессии или репрессии генов клеточного цикла управления [3]. MYC
является транскрипционный фактор, участвующий в регуляции клеточного цикла и остановки роста клеток, который обычно дерегулированном при раке и была описана в качестве ключевого элемента желудочного канцерогенеза [4, 5]. Несколько различных типов посттрансляционных модификаций MYC были описаны, в том числе фосфорилирование, ацетилирование и убихитинизация [6]. Система убиквитин-протеасомный является основным деградации белков регуляторным путем, участвующий в дифференцировке клеток и рост контроля [7]. FBXW7
кодирует F-бокс белка субъединицу //F-коробки комплекса SKP1 Cul1 (SCF) убиквитинлигаза комплекса. СКФ FBXW7 вызывает деградацию продуктов положительных регуляторных генов клеточного цикла, такие как циклин E
, MYC
Нотч
и JUN
, посредством фосфорилирования-зависимой убихитинизация [8]. Среди СКФ FBXW7 субстратов, MYC имеет особое значение в выходе клеточного цикла, поскольку он, как полагают, играют определенную роль в определении того, делить клетки млекопитающих или нет [9].
Дерегулируемых FBXW7
выражение является основной причиной канцерогенеза [10-12]. Потеря FBXW7
выражение может привести к избыточной экспрессии MYC и ассоциируется с плохим прогнозом у больных ГЦ [13]. Однако активация MYC с помощью FBXW7
потери вызывает активацию р53, который играет ключевую роль в регуляции клеточных реакций на повреждение ДНК и аномальной экспрессии онкогенов. Индукция остановки клеточного цикла с помощью р53 позволяет репарации ДНК или индукции апоптоза [14]. Таким образом, сопутствующая потеря FBXW7
и TP53
необходимо вызвать генетическую нестабильность и онкогенеза [11].
В настоящем исследовании мы исследовали MYC
, FBXW7
и TP53 <бр> копии гена изменение количества и мРНК и экспрессию белка в образцах GC и желудочных линий клеток аденокарциномы. Возможные ассоциации между нашими выводами и клинико-патологическими особенностями и /или вторжения и миграции способности клеточных линий также были оценены.
Методы
клинических образцов
Образцы были получены из 33 пациентов GC, перенесших хирургическое лечение в João Больница де Баррос Баррето университет в парасостояние, Бразилия. Вскрытый опухолевые и спаренные образцы без опухолевой ткани были немедленно вырезана из желудка и замораживали в жидком азоте до экстракции РНК.
Клинико особенности образцов пациентов приведены в таблице 1. Образцы GC были классифицированы в соответствии с Lauren [15] , Все образцы ГХ показал наличие Helicobacter Pylori
, а фактор вирулентности CagA определяли с помощью ПЦР-анализа мочевина
и CagA
как описано Clayton и др
. [16] и Covacci и др.
[17], соответственно. Все пациенты имели негативные историй воздействия либо химиотерапии или лучевой терапии до операции, и не было никаких других со-вхождений диагностированных раковых образований. Информированное согласие с утверждением комитета по этике федерального университета Pará был obtained.Table 1 MYC, вариация FBXW7 и TP53 ген число копий, MYC и белок р53 экспрессия и клинико-патологические особенности 33 пациентов GC

CNV MYC

ХНОП FBXW7


ХНОП TP53


IHC MYC

IHC p53


2-х экземплярах (п = 16)

≥ 3 копии (п = 17)

p- значение


2-х экземплярах (п = 18)

1 копия (п = 15)

p- значение


2-х экземплярах (п = 25)

1 экземпляр (п = 7)

р - значение


Р (п = 19)

N (N = 14)

p- значение


Р (п = 6)

N (N = 25)

p- значение


Возраст (лет) (среднее ± SD)
> 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2)
9 страница 5 из 6
8
10 4
10
9 страница 2 17
Пол
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10
12
6
8
10 страница 5 из 13
гистопатология
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6 страница 5 из 9
1 страница 3 из 8
1
10
Глубина инвазии опухоли
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
узел метастаз лимфа
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10
10
15 4
13
7 страница 5 из 15
этап
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11 4
8
7 4
11
Мус IHC
Отрицательная страница 5 из 8
0,481
7
6
+1,000
11 страница 2 0,671
Положительный
11
9
11
9
14 <бр> 5
p53 IHC
Негативный
14
12
0,398
14
12
+1,000
21 4
0,157
Положительный
2 страница 5 4 страница 3 из 4 страница 3 * р
&л; 0,05; P: положительная; N:. отрицательна
клеточные линии
аденокарциномы желудка клеточные линии ACP02 и ACP03 [18], культивировали в полной среде RPMI (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина /стрептомицина и 1% канамицина.
Копировать номер вариации (CNV)
ДНК экстрагировали с использованием DNAQiamp мини-набор (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями изготовителя. Двухуровневые количественный ПЦР в реальном времени (в режиме реального времени КПЦР) проводили с использованием FAM /MGB-меченых зондов TaqMan для MYC
(Hs01764918_cn), FBXW7
(Hs01362464_cn) или TP53
(Hs06423639_cn), и ИКС /TAMRA-меченные TaqMan ХНОП РНКазы Р
(Ƹ3326) был использован для внутреннего контроля. Все в режиме реального времени КПЦР реакции проводили в четырех экземплярах с гДНК в соответствии с протоколом производителя с использованием 7500 Fast Real-Time PCR системы (Life Technologies, Фостер-Сити, штат Калифорния, США). Число копий каждого образца оценивали с помощью анализа с использованием CNV Copy Software V1.0 Caller (Life Technologies, Фостер Сити, Калифорния, США). ДНК Известные геномную (Promega, Мэдисон, США) использовали для калибровки.
Количественные в режиме реального времени с использованием обратной транскриптазы ПЦР
Суммарную РНК экстрагировали с TRI Реагент ® Solution (Life Technologies, Carlbad, Калифорния, США ) в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрация РНК и качество определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop (Thermo Scientific, Уилмингтон, Делавэр, США) и 1% агарозном геле. Комплементарной ДНК (кДНК) синтезируют с использованием большой емкости кДНК Archive комплект в соответствии с рекомендациями производителя (Life Technologies, Фостер-Сити, штат Калифорния, США). В режиме реального времени КПЦР праймеры и зонды TaqMan таргетингом MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7
(Hs00217794_m1) и TP53
(Hs01034249_m1) были приобретены в качестве Assays по запросу Продукты для экспрессии генов ((Life Technologies, . Фостер Сити, Калифорния, США) в режиме реального времени КПЦР проводили с использованием 7500 системы ABI Prism (Life Technologies, Foster City, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя GAPDH
(NM_002046.3;. Life Technology, USA) был выбран в качестве внутреннего контроля для контроля ввода РНК и обратной эффективность транскрипции. Все в режиме реального времени КПЦР реакции для генов-мишеней и механизмов внутреннего контроля были выполнены в трех экземплярах на том же планшете. относительный количественное (RQ) экспрессии гена рассчитывали с использованием ΔΔCt метод [19], в котором неопухолевых образец был определен в качестве калибратора для каждого образца опухоли парного.
Иммуногистохимия
иммуногистохимического анализа для MYC и р53 были выполнены на фиксированных формалином, залитых парафином хирургических участков. были использованы серийные 3 мкм секции. Тепло-индуцированный извлечения антигена был использован (управляемый микропроцессором давление Паскаль ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Универсальный Комплект вторичного антитела, конъюгированные с пероксидазой (LSAB система, DakoCytomation, Карпинтерия, CA, USA) использовали для обнаружения с диаминобензидина (DAB) в качестве хромогена. Были использованы следующие первичные антитела: моноклональные мышиные антитела против MYC (разведение 1: 150; SC-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA и клон 9Е10, Zymed ®, Сан-Франциско, штат Калифорния, США) , FBXW7 (разведение 1:50, Abnova Corp., Тайбэй, Тайвань) и p53 (разведение 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Положительная экспрессия белка была определена как ясном ядерное окрашивание в более чем 10% клеток.
Миграции и инвазии анализ
анализов миграции и инвазии проводились в модифицированной Бойденом камере с фильтрующими вставками (8 мкм поры) для 12-луночные планшеты (BD Biosciences, San Jose, CA, США). Для оценки вторжения, фильтры покрывали 10 мкл Матригель (10-13 мг /мл) (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния, США), а на льду. Клетки (2 × 10 5) высевали в верхнюю часть камеры, в 1 мл среды RPMI без FBS. Нижняя палата была заполнена 1,5 мл RPMI с FBS. Через 48 часов культивирования клетки фиксировали 4% параформальдегидом и фиксировали 0,2% кристаллическим фиолетовым в 20% метанола. Клетки на верхней стороне фильтра, в том числе в Матригель, были удалены с помощью ватного тампона. Вторгаясь клетки (на нижней стороне фильтра) были сфотографированы и подсчитывали. Эксперименты проводили в трех повторностях.
Иммунофлуоресценции
Клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали 1% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 10 мин, затем делают проницаемыми с 0,5% тритона Х-100 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США) в PBS в течение 15 минут и блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS. Клетки окрашивали мышиными антителами против MYC (разведенный в соотношении 1:50; Zymed ®, США), р53 (разбавленный 1:50; DakoCytomation, Карпинтерия, CA, США), и FBXW7 (разбавленный 1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Тайвань). Первичные антитела были обнаружены с помощью анти-мышь Alexa-568-конъюгированного вторичного антитела (Invitrogen). Все инкубации проводили в течение 60 мин при комнатной температуре. Ядра окрашивали DAPI в Prolong анти-выцветанию монтажной среды (Invitrogen). Отрицательные контрольные образцы были обработаны, как описано выше, за исключением того, что первичные антитела были опущены и заменены только PBS.
Вестерн-блоттинга
экстракции белка из клеток проводили в соответствии со стандартными процедурами. Если коротко, то общий белок экстрагируют из клеток ACP02 и ACP03 с использованием буфера 50 мМ Трис-HCl, содержащего 100 ммоль /л NaCl, 50 мМ NaF, 1 мМ Navo <суб> 4, 0,5% NP-40, и полный коктейль ингибиторов протеаз (Roche , Германия). Концентрацию белка оценивали с использованием анализа Бредфорда (Sigma-Aldrich). Около 30 мкг общего белкового экстракта загружали на 12% додецилсульфата-электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) гель натрия и подвергали электрофорезу. Протеины затем переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном солевом растворе, содержащем 5% Tween (Sigma-Aldrich, Сант-Луис, штат Миссури, США), а затем инкубировали с мышиными моноклональными анти-Myc (Santa Cruz Biotechnology), анти-FBXW7 (Abnova , Тайбэй, Тайвань), анти-р53 (DakoCytomation, Карпинтерия, CA, США), и анти-β-актина (Sigma-Aldrich, Сант-Луис, Миссури, США) антитела разводили в соотношении 1: 200, 1: 100, 1: 100 и 1: 2000 соответственно. Затем мембраны инкубировали с 1: 5000 разбавлении с пероксидазой хрена (HRP) овечьего антитела против мыши (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) в течение 1 ч при комнатной температуре. Белки визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции.
Зимографии
ACP02 и клетки ACP03 (5 × 10 4 из каждого) высевают и позволило придерживаться и распространяться, по крайней мере, 8 часов. Прилипшие клетки промывали три раза PBS, и культуральную среду заменяли не содержащей сыворотки среде в течение 24 ч. Активность ММР2 и ММР9 в кондиционированной среде была оценена с помощью зимографии. Кондиционированную среду собирали, концентрировали (Microcon 30 К, Merck Millipore, Дармштадт, Германия) и ресуспендировали в SDS-PAGE буфере для образцов (без -меркаптоэтанол). Остальные клетки лизируют и концентрацию белка оценивали с помощью ВСА анализа (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). В общей сложности 1 мкг белка из каждой кондиционированной среды разделяли на 10% полиакриламидном геле, содержащем 0,2% желатина. После электрофореза гели промывали в 2,5% Triton X-100 в течение 30 мин, затем уравновешивали в 10 мМ Трис (рН 8,0) и инкубировали при 37 ° С в течение 16-24 ч в буфере, содержащем 50 развития мМ Трис (рН 8,0 ), 5 мМ CaCl <суб> 2, и 0,02% NaN <югу> 3. Гели окрашивали 0,2% кумасси синим R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) и обесцвечивают с 1: 1 раствора уксусной кислоты с /метанол. Эксперименты проводили в трех повторностях. Zymographic полосы, которые свидетельствуют о ММР активности, были определены количественно с помощью сканирующей денситометрии.
Статистический анализ
Нормальность переменных распределений определяли с помощью теста Шапиро-Wilk. Ассоциации между MYC
, FBXW7
и TP53
копировать изменение количества, уровни мРНК, экспрессию белка, функции, клинико и инвазии и миграции клеток способность были проанализированы с помощью хи-квадрат (χ 2) и Манна-Уитни тесты. Корреляция между экспрессией различных целевых мРНК определяли с помощью теста Спирмена, в котором значение ниже 0,3 показывал слабую корреляцию, 0,3-0,7 показали среднюю корреляцию, а значения выше 0,7 указывают на сильную корреляцию. Данные представлены в виде среднего и межквартильного диапазона; Значения Р менее 0,05 считались значимыми.

Результаты Желудочный образцов опухолей показал усиление MYC
и удаление FBXW7
и TP53

Три или более копий MYC
были обнаружены в 51,5% (17/33) желудочных опухолевых клеток. В противоположность этому, 45,5% (15/33) и 21,2% (7/33) желудочных опухолевых клеток содержала только одну копию FBXW7
и TP53
соответственно.
Связь между клинико-патологическими особенностями и MYC
, FBXW7
и TP53
число копий обобщены в таблице 1. Один из желудка опухоль, которая содержала три копии TP53
был исключен из хи-квадрат анализа. Никакой связи не было найдено между количеством копий вариации генов, изученных и клинико-патологическими особенностями.
MYC
экспрессии мРНК в опухолях выше, чем в неопухолевых образцах, в то время как FBXW7
и TP53
экспрессия мРНК была ниже в образцов опухоли
уровень экспрессии Мус
мРНК (2,01 ± 1,72 раза изменение) в образцах опухолевой ткани была значительно выше, чем в неопухолевых ткани (р = 0,0002), в то время как уровень экспрессии FBXW7
мРНК (0,53 ± 0,40 раза изменить) и TP53
мРНК (0,84 ± 0,55 раза изменение) в образцах опухолевой ткани была значительно ниже, чем в неопухолевых ткани (р &ЛТ; 0,0001 и р = 0,0011 соответственно). Мы не обнаружили существенную корреляцию между MYC
, FBXW7
и TP53
экспрессии мРНК (MYC
/FBXW7
мРНК г = -0,3464, р = 0,0562; MYC
/TP53
мРНК г = 0,0950, р = 0,6113; FBXW7
/TP53
мРНК г = -0,0745, р = 0,4747). Таким образом, была обнаружена лишь тенденция к корреляции между увеличением MYC
экспрессии мРНК и уменьшение FBXW7
экспрессии мРНК.
В таблице 2 показаны связи между различными клинико-патологическими особенностями и RQ из MYC
, FBXW7
и TP53
экспрессии мРНК в опухоли и спаренные неопухолевых образцов. Увеличение MYC
уровня мРНК была связана с наличием метастазов в лимфатических узлах (р = 0,016) и хромато опухолевой стадии III-IV (р = 0,036). Значительное снижение FBXW7
уровня мРНК также был связан с метастазированием наличие лимфатических узлов (р = 0,015) и опухолевой стадии III-IV (р = 0,008) .table 2 MYC, уровни экспрессии мРНК FBXW7 и TP53 и клинико-патологические факторы 33 больных раком желудка

п (%)

MYC


p- значение


FBXW7


p- значение


TP53


p- значение


Медиана ± IQR
Медиана ± IQR
Медиана ± IQR
Возраст (Y) (среднее ± SD)
> 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%)
2,04 ± 1,35
0.8873
0,55 ± 0,37 <бр> 0,9247
0,86 ± 0,62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%) 1,44 ±
4,88 ± 0,53
0,50
0,94 ± 1,65 <бр> Гендер
Male
15 (45,5%)
2.01 ± 1.01
0,4065
0,53 ± 0,22
0,6353
0,89 ± 0,58
0,8125
Женский <бр> 18 (54,5%)
1,67 ± 2,03 0,56 ±
0,56
0,87 ± 0,69
гистопатологией
кишечными
22 (66,7%)
2,06 ± 0,99
0,3525
0,53 ± 0,16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
Диффузный
11 (33,3%) 1,40 ±
2,32
0,77 ± 0,74 0,94 ±
0,38
Глубина инвазии опухоли
T1
6 (18,2%)
0,89 ± 0,47
0.0857
0,88 ± 0,58
0,0678
0,85 ± 0,15
0.7069
T2-T4
27 (81,8%)
2,08 ± 1,42 0,53 ±
0,43
0,91 ± 0,79
лимфоузлов метастаз
отсутствующего
13 (39,4%)
0,98 ± 1,09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0,84 ± 0,44
0,6121
Представить
20 (60,6%)
2.10 ± 2.20
0,46 ± 0,38 0,94 ±
0,79
Этап
I-II
18 (54,5%)
1,39 ± 1,23
0.0362
* 0,57 ± 0,38
0.0380 *
0,83 ± 0,55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%) ± 2,41
2,79
0,34 ± 0,45 ± 0,96
1,19
MYC IHC
позитиве
20 (60,6%)
2,18 ± 1,59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0,81 ± 0,57
0,1372
отрицательный
13 (39,4%)
0,89 ± 0,85 0,58 ±
0,53
0,99 ± 0,90
p53 IHC
позитиве
7 (21,2%)
4,25 ± 6,53
0.0891
0,64 ± 0,68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
Отрицательный
26 (78,8%)
2,00 ± 1,44 0,55 ±
0,35 ± 0,87
0,60
* р
&л; 0,05; МКР:. Межквартильный
диапазон белка окрашивания Ядерный MYC связан с кишечно-типа GC
положительное окрашивание для ядерной MYC и р53 был обнаружен в 64,5% (20/31) и 19,4% (6/31) образцов GC соответственно (рисунок 1). Ни один положительность не было найдено для FBXW7. В таблице 1 приведены особенности и клинико-MYC и результаты р53 иммунным окрашиванием. Выражение MYC был более частым в кишечном типа, чем диффузного типа GC (р = 0,007). Кроме того, MYC иммунное был связан с увеличением MYC
уровня мРНК (р = 0,0022). Никакой связи не было найдено между р53 иммунным окрашиванием и клинико-патологическими характеристиками, TP53
количестве копий, или TP53
экспрессии мРНК. Рисунок 1 иммуногистохимический анализ MYC и экспрессии белка р53 в GC. (A) Отрицательный иммунное MYC в диффузного типа GC; (B) MYC иммунной позитивности в кишечном типа GC; (C) Положительный иммунное р53 в диффузного типа GC; (D) P53 иммунной положительности в кишечном типа GC (увеличение × 40).
Сравнение клеточных линий ACP02 и ACP03
Оба ACP02 и ACP03 клетки содержали три Мус
копии и только один FBXW7
копию , Число TP53
копий была неопределенная в обеих клеточных линиях. По сравнению с экспрессии мРНК в клетках ACP03, ACP02 клетки экспрессируют более высокий уровень MYC
(1,34 раза) и более низкие уровни FBXW7
и TP53
мРНК (0.62- и 0,73 раза, соответственно).
Вестерн-блот-анализ показал, что экспрессия MYC была значительно выше в клетках ACP02 чем ACP03 клеток (р = 0,048). Кроме того, экспрессия FBXW7 была значительно ниже в клетках ACP02 чем ACP03 клеток (р = 0,049). Тем не менее, не было никаких существенных различий в экспрессии р53 между клеточными линиями (р = 0,077) (рис 2А-В).
Иммунофлуоресценции анализ обоих белков показал наростом образец маркировки, поддерживая результаты вестерн-блоттинга, иллюстрирующие увеличение снижение MYC и в выражении FBXW7 в клетках ACP02 по сравнению с ACP03 (рисунок 2). Матригель инвазия Результаты анализа показали, что ACP02 клетки были более агрессивны, чем ACP03 клеток (р = 0,001). Результаты анализа миграции показали, что меньшее количество ACP02 клетки мигрировали по сравнению с ACP03 клеток (р = 0,0028) (рис 2C-D). Рисунок 2 MYC, экспрессия FBXW7 и р53, миграция и инвазия способность в ACP02 и ACP03. (A) График показывают среднее ± стандартное отклонение от MYC, FBXW7 и экспрессии белка р53 в ACP02 и ACP03. Эти белки были нормализованы до уровня бета-актина; (Б) данные репрезентативными MYC, FBXW7 и экспрессии белка р53; (C-D) Графики показывают среднее ± стандартное отклонение миграции и инвазивных клеток утраивает анализ; (Е) Представитель результаты MYC, FBXW7 и p53 иммунофлюоресценции
Оба ACP02 и ACP03 клетки представлены четыре желатиназа полосы активности:. ММР-9 латентный (92 кДа), ММР-9 активных (88 кДа), ММР-2 латентный ( 72 кД), и ММР-2 активные (66 кДа) (рисунок 3). Мы не обнаружили никаких существенных различий в ММР-9 латентной (р = 0.9788), ММР-2 активен (р = 0,7848), и ММР-2 латентный (р = 0,1678) между ACP02 и ACP03 клеток. Тем не менее, были обнаружены значительные различия между ACP02 и ACP03 клеток по отношению к ММР-9 активных (р = 0,0182). Рисунок 3 репрезентативный анализ желатина зимографии ММР-2 и ММР-9 активности в ACP02 и ACP03. (A) Полосы, соответствующие обоим латентных и активных форм ММР-2 и ММР-9 наблюдались в ACP02 и ACP03. Денситометрические анализы полос, соответствующих скрытых и активных форм ММР-2 (В) и ММР-9.
Обсуждение
В текущем исследовании, мы наблюдали, что MYC
экспрессия мРНК была увеличена (C) в образцах GC по сравнению с соответствующими неопухолевых образцов. Кроме того, насколько нам известно, это первое исследование, чтобы сообщить о связи между увеличением MYC
экспрессии мРНК и наличие метастазов в лимфатических узлах и CG стадии III-IV, усиливая идею, что Myc
дерегулирование является сильным фактор для злокачественной опухоли в GC.
Адамс и др
. [20] и Leder и др.
[21] показано, что Myc
экспрессия мРНК дерегулирование может способствовать развитию рака в трансгенных мышах. Увеличение Мус
уровня мРНК в злокачественных опухолях человека может быть результатом как прямых, так и косвенных механизмов, которые могли бы иметь несколько объяснений. Во-первых, Мус
усиление является наиболее распространенным механизмом Мус
дерегулирования в [5] GC. Этот механизм приводит к увеличению производства онкогенных продуктов в количествах, которые превышают транскрипционный способность нормального гена двойного копирования. Здесь мы наблюдали три или более копий гена Myc
в 51,5% желудочных образцов опухолей. Предыдущие исследования нашей группы также показали, что Myc
амплификации или трисомия хромосомы 8, на котором MYC
находится, присутствует во всех образцах GC обследованных от физических лиц в Северной Бразилии, а также в линиях клеток GC, установленных наша группа из опухолей бразильских пациентов [18, 22-27]. Присутствие MYC
амплификации также сообщалось в образцах плазмы от лиц с GC [28]. Тем не менее, прямой связи между MYC
не копировать изменение количества и экспрессии мРНК был обнаружен в данном исследовании.
Во-вторых, увеличение MYC
экспрессии мРНК может быть результатом последовательной рекомбинации между иммуноглобулин (Ig) и локус MYC
онкоген. Это явление часто описывается в лимфомы Беркитта и ассоциируется с более длительным периодом полураспада Мус
мРНК в пораженных клеток [29]. Ранее наша исследовательская группа наблюдается Мус
вставки в диффузного типа GC в основном в хромосомы, которые отображаются с генами иммуноглобулинов (хромосомы 2, 14 и 22) [26]. Таким образом, хромосомные транслокации, вовлекающие MYC
локус (8q24) в диффузного типа CG в отдельных лиц из Северной Бразилии может также отражать увеличение MYC
уровня мРНК.
Иммуногистохимии (IHC) анализ показал, что экспрессия MYC является чаще всего встречается в кишечном типа GC, чем образцы GC диффузного типа. Эти изменения могут привести к ненормальной белка MYC, который не распознается ни одним из антител, используемых в данном исследовании. Кроме того, мы наблюдали связь между MYC
уровнем экспрессии мРНК и MYC окрашивания. Кроме того, посттранскрипционные механизмы контроля MYC стабильность [6, 30]. Мус
дерегулирование была связана с потерей FBXW7
, в haploinsufficient ген-супрессор опухолей. В общем, FBXW7
потеря может быть вызвана потерей гетерозиготности (LOH) и мутации [30]. Потери в 4К, в FBXW7
локуса, является повторяющимся хромосомные изменения в GC [31, 32], и FBXW7
мутации были найдены в 3.7-6% от опухоли желудка [12]. В
в настоящем исследовании мы наблюдали только одна копия гена FBXW7
в 45,16% желудочных опухолей изученных. Интересно, что FBXW7
экспрессия мРНК в образцах GC заметно снизилась по сравнению с соответствующим неопухолевых ткани. Кроме того, FBXW7
экспрессия мРНК дерегулирование была связана с наличием метастазов в лимфатических узлах и ГХ стадии III-IV, а также наблюдалось с Myc
мРНК. Эти данные подтверждают работу Yokobori Эль-Аль.
[13], которые также показали связь между пониженными FBXW7
узла метастазирования экспрессии мРНК и лимфы, что способствует злокачественному потенциала GC клеток и приводит к неблагоприятным прогнозом. Кроме того, мы наблюдали, что экспрессия MYC
и FBXW7
мРНК имели тенденцию быть обратно коррелируют в настоящем исследовании.
Несколько исследований показали, что MYC
инактивация подавляет опухоли у животных, предполагая, что MYC <бр> может быть молекулярной мишенью при лечении рака [33-35]. В качестве альтернативы, Соучек и др
. [36] предположил, что FBXW7 может облегчить "опухоль дремоты терапии". Таким образом, деградация Myc путем FBXW7 может не только вызвать состояние опухоли покоя, но может также иметь противоопухолевый эффект. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• хеликобактерной инфекции и циркулирующие уровни грелина - систематический обзор
• "Ускоренный" реабилитация после резекции желудка рака: опыт 80 последовательных случаев