MYC, FBXW7 et TP53 nombre de copies variation et d'expression dans gastrique Cancer

MYC, FBXW7
et TP53
nombre de copies variation et d'expression dans le fond de cancer gastrique
Résumé
MYC déréglementation est un événement commun carcinogenèse gastrique, généralement par suite d'une amplification génique, la translocation, ou à des mécanismes post-traductionnelles. FBXW7
est un suppresseur de tumeur p53 contrôlée qui joue un rôle dans la régulation de la sortie du cycle cellulaire et la rentrée par la dégradation des MYC.
Méthodes
Nous avons évalué MYC
, FBXW7
et TP53
nombre de copies, les niveaux d'ARNm et l'expression des protéines dans le cancer gastrique et des échantillons non appariés néoplasiques provenant de 33 patients, ainsi que dans des lignées cellulaires de l'adénocarcinome gastrique. Nous avons également déterminé le potentiel d'invasion des lignées cellulaires de cancer gastrique. Les résultats de
MYC
amplification a été observée chez 51,5% des échantillons de tumeurs gastriques. Suppression d'une copie du FBXW7
et TP53
a été observée chez 45,5% et 21,2% des tumeurs gastriques, respectivement. L'expression de l'ARNm était significativement plus élevée MYC dans les tumeurs que dans les échantillons non néoplasiques. FBXW7
et ARNm l'expression de TP53 était nettement plus faible dans les tumeurs que dans les échantillons non néoplasiques appariés. En outre, déréglementé MYC
et l'expression de l'ARNm de FBXW7 a été associée à la présence de métastases des ganglions lymphatiques et de la tumeur de stade III-IV. En outre, MYC immunocoloration était plus fréquemment observée dans de type intestinal que les cancers gastriques de type diffus et était associé à MYC
expression de l'ARNm. Des études in vitro ont montré que l'augmentation myc et une expression réduite FBXW7 est associée à un phénotype plus invasif dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Ce résultat nous a incité à enquêter sur l'activité des gélatinases MMP-2 et MMP-9 dans les deux lignées cellulaires. Les deux gélatinases sont synthétisés principalement par les cellules stromales plutôt que des cellules cancéreuses, et il a été proposé que les deux contribuent à la progression du cancer. Nous avons observé une augmentation significative de l'activité de MMP-9 dans ACP02 ACP03 par rapport aux cellules. Ces résultats ont confirmé que les cellules ACP02 ont une plus grande capacité d'invasion de cellules ACP03.
Conclusion
En conclusion, FBXW7 et MYC ARNm peuvent jouer un rôle dans le comportement agressif biologique des cellules de cancer gastrique et peuvent être un indicateur utile de mauvais pronostic. En outre, MYC est une cible candidate pour de nouvelles thérapies contre le cancer gastrique.
Mots-clés
cancer gastrique MYC FBXW7 TP53 Contexte
cancer gastrique (GC) est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès par cancer dans le monde [1]. GC est considéré comme un problème majeur de santé publique, en particulier dans les pays en développement, y compris le Brésil [2].
Un aspect fondamental de la cancérogenèse est la prolifération incontrôlée des cellules résultant de l'accumulation de changements qui favorisent l'expression ou la répression des gènes du cycle cellulaire contrôle [3].
MYC est un facteur de transcription impliqué dans la régulation du cycle cellulaire et l'arrêt de la croissance cellulaire qui est couramment dérégulé dans les cancers et a été décrit comme un élément clé de la cancérogenèse gastrique [4, 5]. Plusieurs types différents de modifications post-traductionnelles de MYC ont été décrites, y compris une phosphorylation, une acétylation, une ubiquitination et [6]. Le système ubiquitine-protéasome est la principale voie de régulation de la dégradation des protéines impliquées dans la différenciation cellulaire et la croissance contrôle [7]. FBXW7
code une sous-unité de la protéine F-box du /complexe /F-box CUL1 Skp1 complexe ligase (SCF) de l'ubiquitine. SCF FBXW7 induit la dégradation des produits de gènes régulateurs du cycle cellulaire positifs, tels que la cycline E
, MYC
, NOTCH
et juin
, par la phosphorylation dépendante de l'ubiquitination [8]. Parmi EFC substrats FBXW7, MYC est d'une importance particulière dans la sortie du cycle cellulaire, car il est pensé pour jouer un rôle pour déterminer si les cellules de mammifères se partagent ou non [9] L'expression de Dérégulé FBXW7 de. Est une cause majeure de la cancérogenèse [10-12]. Perte de FBXW7 de l'expression peut conduire à MYC surexpression et a été associée à un mauvais pronostic chez les patients du GC [13]. Cependant, MYC activation par FBXW7 de la perte déclenche l'activation de p53, qui joue un rôle clé dans la régulation des réponses cellulaires aux dommages de l'ADN et de l'expression anormale des oncogènes. Induction de l'arrêt du cycle cellulaire par p53 permet la réparation de l'ADN ou de l'apoptose par induction [14]. Ainsi, la perte concomitante de FBXW7
et TP53
est nécessaire pour induire une instabilité génétique et la tumorigenèse [11].
Dans la présente étude, nous avons étudié MYC
, FBXW7
et TP53
nombre de copies du gène et de la variation de l'ARNm et l'expression de protéines dans des échantillons de GC et des lignées cellulaires de l'adénocarcinome gastrique. associations possibles entre nos résultats et les caractéristiques clinico et /ou l'invasion et de la capacité de migration des lignées cellulaires ont également été évalués.
Méthodes
les échantillons d'échantillons cliniques ont été obtenus à partir de 33 patients du GC qui ont subi un traitement chirurgical à l'João Hôpital universitaire de Barros Barreto dans l'État de Pará, Brésil. des échantillons de tissus non néoplasiques tumorales Dissected et appariés ont été immédiatement coupées de l'estomac et congelés dans l'azote liquide jusqu'à l'extraction de l'ARN.
Les caractéristiques clinicopathologiques des échantillons de patients sont présentés dans le Tableau 1. Les échantillons de GC ont été classés selon Lauren [15] . Tous les échantillons de GC montraient la présence d'Helicobacter pylori
et le facteur de virulence cagA a été déterminé par analyse PCR de l'urée et cagA

comme décrit par Clayton et al.
[16] Covacci et al.
[17], respectivement. Tous les patients avaient des antécédents négatifs de l'exposition à la chimiothérapie ou la radiothérapie avant la chirurgie, et il n'y avait pas d'autres co-occurrences de cancers diagnostiqués. Le consentement éclairé avec l'approbation du comité d'éthique de l'Université Fédérale du Pará était obtained.Table 1 MYC, variation FBXW7 et TP53 le nombre de copies, MYC et protéine p53 expression et les caractéristiques clinico de 33 patients du GC
CNV MYC
CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 copies (n = 16)
≥ 3 copies (n = 17)
p- valeur
2 copies (n = 18)
1 copie (n = 15)
p- valeur
2 copies (n = 25)
1 exemplaire (n = 7)
p - valeur
P (n = 19)
N (n = 14)
p- valeur
P (n = 6)
N (n = 25)
p- valeur
âge (y) (moyenne ± SD)
> 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2)
9
5
6 8
10 4
10
9 2
17
Sexe
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10
12
6 8
10
5
13
histopathologie
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9 1
3
8 1
10
Profondeur de l'invasion tumorale
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
métastases ganglionnaires
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10
10
15 4
13
7
5
15
Stage
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11
Négatif 4 8
7 4
11
MYC IHC 5 8
0,481
7
6
1.000
11 2
0,671
positive
11
9
11
9
14
5
p53
négatif IHC 14
12
0,398
14
12
1.000
21 4
0,157
Cellules lignes de négatif: positif 2
5 4
3 4
3
* p
< 0,05;:; P N positif.
gastriques lignées de cellules d'adénocarcinome ACP02 et ACP03 [18] ont été cultivées dans un milieu complet RPMI (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 1% de pénicilline /streptomycine, et 1% nombre de copies la variation de la kanamycine. (CNV)
ADN a été extrait en utilisant un kit de mini DNAQiamp (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instructions du fabricant. Duplex quantitative PCR en temps réel (en temps réel qPCR) a été réalisée en utilisant les sondes TaqMan FAM /MGB marquée pour MYC
(Hs01764918_cn), (Hs01362464_cn) de FBXW7, ou (Hs06423639_cn) de TP53, et VIC /TAMRA marqué TaqMan CNV RNAse P
(Ƹ3326) a été utilisé pour le contrôle interne. Toutes les réactions de qPCR en temps réel ont été réalisées en quadruple avec ADNg selon le protocole du fabricant en utilisant un système PCR 7500 rapide en temps réel (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Le nombre de copies de chaque échantillon a été estimé par l'analyse CNV utilisant Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Humain connu ADN génomique (Promega, Madison, USA) a été utilisé pour la calibration.
Quantitative en temps réel inverse PCR de la transcriptase ARN total a été extrait avec TRI Réactif ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, USA ) selon les instructions du fabricant. la concentration et la qualité de l'ARN ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) et 1% de gels d'agarose. L'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé en utilisant un kit High-Capacity Archive ADNc selon les recommandations du fabricant (Life Technologies, Foster City, CA, USA). En temps réel amorces qPCR et des sondes TaqMan ciblant MYC
(Hs00153408_m1), (Hs00217794_m1) de FBXW7 et TP53
(Hs01034249_m1) ont été achetés comme Assays-on-Demand Produits pour Gene Expression ((Life Technologies, . Foster City, CA, USA) en temps réel qPCR a été réalisée en utilisant un ABI Prism 7500 système (Life Technologies, Foster City, CA, USA) selon les instructions du fabricant GAPDH
(NM_002046.3;. Life Technology, USA) a été choisi comme un contrôle interne pour le suivi de l'entrée d'ARN et d'inverser l'efficacité de la transcription. Tout en temps réel des réactions qPCR de gènes cibles et les contrôles internes ont été réalisées en triple sur la même plaque. la quantification relative (RQ) de l'expression génique a été calculé en utilisant le ΔΔCt méthode [19], dans lequel l'échantillon non-néoplasique a été désigné comme un calibrateur pour chaque échantillon de tumeur appariés.
immunohistochimie
immunohistochimique analyses pour MYC et p53 ont été réalisées sur des sections chirurgicales de paraffine fixés au formol. Serial sections 3 um ont été utilisés. récupération d'antigène induite par la chaleur a été utilisé (pression commandé par microprocesseur Pascal ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Un kit d'anticorps secondaire universel conjugué à la peroxydase (Système LSAB, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) a été utilisé pour la détection avec de la diaminobenzidine (DAB) comme chromogène. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés: anticorps monoclonaux de souris dirigés contre MYC (dilution 1: 150; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, Etats-Unis et clone 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (dilution 1:50, Abnova Corp., Taipei City, Taiwan), et p53 (dilution 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Migration et invasion de dosage de l'expression de protéine positive a été définie comme une coloration nucléaire clair dans plus de 10% des cellules.
Migration et l'invasion des essais ont été effectués dans une chambre de Boyden modifiée avec des inserts de filtre (pores de 8 pm) pour plaques à 12 puits (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Pour évaluer l'invasion, les filtres ont été revêtues avec 10 ul de Matrigel (10-13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), tandis que sur la glace. Les cellules (2 x 10 5) ont été ensemencées dans la chambre supérieure dans 1 ml de RPMI sans SVF. La chambre inférieure a été remplie de 1,5 ml de RPMI avec du FBS. Après 48 h de culture, les cellules ont été fixées avec 4% de paraformaldehyde et post-fixées avec du violet cristal à 0,2% dans 20% de methanol. Les cellules sur le côté supérieur du filtre, y compris dans le matrigel, ont été enlevées avec un coton-tige. cellules envahissantes (sur le côté inférieur du filtre) ont été photographiées et comptées. Des expériences ont été réalisées en triple. Le plus Immunofluorescence de cellules cultivées sur des lamelles de verre ont été fixées avec 1% de paraformaldehyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 10 minutes, puis perméabilisées avec 0,5% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dans du PBS pendant 15 minutes et bloquées avec de l'albumine de sérum bovin à 1% (BSA) dans du PBS. Les cellules ont été colorées avec des anticorps de souris contre MYC (dilué 1:50; Zymed ®, USA), p53 (dilué 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), et FBXW7 (dilué 1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Taiwan). Les anticorps primaires ont été révélés en utilisant un anticorps secondaire anti-souris-Alexa 568 conjugué (Invitrogen). Toutes les incubations ont été effectuées pendant 60 minutes à température ambiante. Les noyaux ont été colorés avec DAPI anti-fade milieu de montage Prolong (Invitrogen). les échantillons témoins négatifs ont été traités comme décrit ci-dessus, sauf que les anticorps primaires ont été omis et remplacés par du PBS seul.

extraction par Western Blot de protéine à partir des cellules a été réalisée selon des procédures standard. En bref, la protéine totale a été extrait à partir de cellules ACP02 et ACP03 en utilisant un tampon 50 mM Tris-HCl contenant 100 mmol /L de NaCl, 50 mM de NaF, 1 mM NaVO 4, 0,5% de NP-40, et complète cocktail d'inhibiteurs de protéase (Roche , Allemagne). La concentration en protéine a été estimée en utilisant un dosage de Bradford (Sigma-Aldrich). Environ 30 pg d'extrait de protéine totale ont été chargés sur un gel de dodécylsulfate de sodium à 12% électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et soumis à une électrophorèse. les protéines résolues ont ensuite été transférées du gel sur une membrane de nitrocellulose. La membrane a été bloquée avec 5% de lait écrémé dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 5% de Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA), puis incubé avec un anticorps monoclonal de souris anti-MYC (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei City, Taiwan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), et anti-β-actine (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) anticorps dilués 1: 200, 1: 100, 1: 100 et 1: 2000, respectivement. Par la suite, les membranes ont été incubées avec une dilution 1: 5000 de la peroxydase de raifort (HRP) anticorps anti-souris de mouton conjugué à (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) pendant 1 h à température ambiante. Les protéines ont été visualisées par chimioluminescence amplifiée.
Zymographie
ACP02 et cellules ACP03 (5 x 10 4 de chaque) ont été étalées et autorisés à adhérer et se propager pendant au moins 8 h. Les cellules adhérentes ont été lavées trois fois avec du PBS et le milieu de culture a été remplacé par du milieu sans sérum pendant 24 h. L'activité de MMP-2 et de la MMP9 dans le milieu conditionné a été évaluée par zymographie. le milieu conditionné est recueilli, concentré (Microcon 30 K, Merck Chemicals, Darmstadt, Allemagne) et remises en suspension dans du tampon d'échantillon SDS-PAGE (sans β-mercaptoéthanol). Les cellules restantes ont été lysées et la concentration en protéine a été estimée en utilisant un dosage BCA (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Un total de 1 ug de protéine provenant de chaque milieu conditionné a été séparé sur 10% de gels de Polyacrylamide contenant 0,2% de gélatine. Après électrophorèse, les gels ont été lavés dans 2,5% de Triton X-100 pendant 30 min, puis équilibrée dans 10 mM de Tris (pH 8,0) et incubées à 37 ° C pendant 16 à 24 h dans un tampon de développement contenant du Tris 50 mM (pH 8,0 ), 5 mM CaCl 2, et 0,02% NaN 3. Les gels ont été colorés avec 0,2% bleu de Coomassie R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) et décolorés avec 1: solution acide /méthanol 1 acétique. Des expériences ont été réalisées en triple. bandes zymographique, qui sont indicatifs de l'activité MMP, ont été quantifiées par densitométrie à balayage de. Les analyses statistiques
La normalité des distributions variables a été déterminée en utilisant le test de Shapiro-Wilk. Les associations entre MYC
, FBXW7
et TP53
copient nombre variation, les taux d'ARNm, l'expression des protéines, les caractéristiques clinicopathologiques, et la capacité d'invasion et la migration cellulaire ont été analysées en utilisant le chi carré (χ 2) et teste de Mann-Whitney. Corrélation entre l'expression des différents ARNm cibles a été déterminée en utilisant le test de Spearman, dans lequel une valeur inférieure à 0,3 indique une faible corrélation, de 0,3 à 0,7 indique une corrélation moyenne, et les valeurs supérieures à 0,7 indique une corrélation forte. Les données sont présentées comme la gamme médiane et interquartile; Résultats de valeurs p inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.
échantillons de tumeurs gastriques ont montré l'amplification de MYC
et la suppression de FBXW7
et TP53
Trois ou plusieurs copies de MYC
ont été trouvés dans 51,5% (17/33) des cellules tumorales gastriques. En revanche, 45,5% (15/33) et 21,2% (7/33) des cellules tumorales gastriques ne contenait qu'une seule copie du FBXW7
et TP53
, respectivement.
L'association entre les caractéristiques clinico et MYC
, FBXW7
et TP53
nombre de copies sont résumées dans le tableau 1. Une tumeur gastrique qui contenait trois copies de TP53
été exclus de l'analyse du chi carré. Aucune association n'a été trouvée entre le nombre de copies variation des gènes étudiés et les caractéristiques clinico.
MYC
expression de l'ARNm était plus élevée dans les tumeurs que dans les échantillons non-néoplasiques, tandis que FBXW7
et TP53
expression de l'ARNm était plus faible dans la tumeur spécimens
le niveau de MYC de l'ARNm (2,01 ± 1,72 fois choisir) d'expression dans des échantillons de tissu tumoral était significativement plus élevée que dans les tissus non-néoplasiques (p = 0,0002), alors que le niveau de FBXW7
d'expression ARNm (0,53 ± 0,40 fois le changement) et TP53 de l'ARNm (0,84 ± 0,55 fois le changement) dans des échantillons de tissu tumoral était significativement plus faible que dans les tissus non-néoplasiques (p < 0,0001 et p = 0,0011, respectivement). Nous ne avons trouvé une corrélation significative entre MYC
, FBXW7
, et l'expression de l'ARNm de TP53 (MYC
/FBXW7
ARNm r = -0,3464, p = 0,0562; MYC
/ARNm r TP53 = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7
/TP53
ARNm r = -0,0745, p = 0,4747). Ainsi, seule une tendance à la corrélation entre une augmentation MYC
expression de l'ARNm et une diminution de l'expression de l'ARNm de FBXW7 a été détectée.
Le tableau 2 résume les associations entre les différentes caractéristiques clinico-pathologiques et les RQ de MYC
, FBXW7
, et l'expression de l'ARNm de TP53 dans la tumeur et les échantillons non néoplasiques appariés. Une augmentation de la MYC
niveau de l'ARNm a été associé à la présence de métastases des ganglions lymphatiques (p = 0,016) et GC stade tumoral III-IV (p = 0,036). Une réduction significative du niveau d'ARNm de FBXW7 a également été associée à la métastase de nœud présence lymphatique (p = 0,015) et la tumeur de stade III-IV (p = 0,008) .Table 2 MYC, FBXW7 et TP53 ARNm niveaux d'expression et les facteurs clinicopathologiques de
n de 33 patients atteints de cancer gastrique (%)
MYC
p- valeur
FBXW7

valeur p-
TP53
p- valeur
Median ± IQR
médian ± IQR
médian ± IQR
âge (y) (moyenne ± SD)
> 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%)
2,04 ± 1,35
0.8873
0,55 ± 0,37
0,9247
0,86 ± 0,62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%)
1,44 ± 4,88 0,53 ± 0,50

0,94 ± 1,65
15 (45,5%)
Sexe Homme
2.01 ± 1.01
0,4065
0,53 ± 0,22
0,6353
0,89 ± 0,58
0,8125
Femme
18 (54,5%)
1,67 ± 2,03 0,56 ± 0,56

0,87 ± 0.69
22 (66,7%)
histopathologie de Intestinal
2,06 ± 0,99
0,3525
0,53 ± 0,16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
dIFFUSE
11 (33,3%)
1,40 ± 2,32 ± 0,74 0,77

0,94 ± 0,38
Profondeur de T1 de l'invasion tumorale
6 (18,2%)
0,89 ± 0,47
0,0857
0,88 ± 0,58
0,0678
0,85 ± 0,15
0,7069
T2-T4 27 (81,8%)
2,08 ± 1,42 0,53 ± 0,43

0,91 ± 0,79
métastases ganglionnaires
13 (39,4%)
Absent
0,98 ± 1,09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0,84 ± 0,44
0,6121
Présenter
20 (60,6%)
2,10 ± 2,20
0,46 ± 0,38
0,94 ± 0,79
Stage
I-II
18 (54,5%)
1,39 ± 1,23
0,0362 *
0,57 ± 0,38
0.0380 *
0,83 ± 0,55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2,41 ± 2,79 0,34 ± 0,45

0,96 ± 1,19
MYC IHC
20 (60,6%)
positif
2.18 ± 1.59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0,81 ± 0,57
0,1372
négatif
13 (39,4%)
0,89 ± 0,85
0,58 ± 0,53 ± 0,90 0,99

p53 IHC
7 (21,2%) positif
4,25 ± 6,53
0,0891
0,64 ± 0,68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
négatif
26 (78,8%)
2,00 ± 1,44 0,55 ± 0,35

0,87 ± 0,60
* p
< 0,05; IQR:. Interquartile MYC nucléaire protéine coloration de gamme est associée à coloration positive de type intestinal GC pour MYC nucléaire et p53 a été trouvé dans 64,5% (20/31) et 19,4% (6/31) des échantillons de GC , respectivement (figure 1). Pas de positivité a été trouvé pour FBXW7. Le tableau 1 résume les caractéristiques clinico et MYC et les résultats de p53 immunocoloration. L'expression de MYC était plus fréquente dans le type intestinal que le type diffus GC (p = 0,007). En outre, MYC immunocoloration a été associée à une augmentation MYC
niveau de l'ARNm (p = 0,0022). Aucune association n'a été trouvée entre p53 immunocoloration et les caractéristiques clinico, le nombre de copies de TP53 ou TP53
expression de l'ARNm. Figure 1 L'analyse immunohistochimique de MYC et p53 expression de la protéine dans GC. (A) Négatif immunocoloration MYC dans le type diffus GC; (B) MYC de positivité immunitaire chez type intestinal GC; (C) immunomarquage p53 positive dans le type diffus GC; Comparaison de (D) p53 positivité immunitaire chez type intestinal GC (grossissement x 40). De lignées cellulaires ACP02 et ACP03
Les deux cellules ACP02 et ACP03 contenait trois
copies MYC et un seul FBXW7
copie . Le nombre de copies de TP53 de n'a pas été déterminée dans les deux lignées cellulaires. Par rapport à l'expression de l'ARNm dans les cellules ACP03, les cellules ACP02 ont exprimé un niveau plus élevé de MYC
(1,34 fois) et des niveaux inférieurs de FBXW7
et TP53 de l'ARNm (0.62- et 0,73 fois, respectivement).
Western blot a révélé que l'expression des analyses MYC était significativement plus élevée que dans les cellules ACP02 ACP03 cellules (p = 0,048). En outre, l'expression FBXW7 était significativement plus faible dans les cellules ACP02 que ACP03 cellules (p = 0,049). Cependant, il n'y avait pas de différence significative de l'expression de p53 entre les lignées cellulaires (p = 0,077) (figure 2A-B). Analyse
Immunofluorescence des deux protéines a présenté un modèle ponctuel de l'étiquetage, en soutenant les résultats du transfert de Western montrant une augmentation de réduction myc et l'expression dans des cellules FBXW7 ACP02 par rapport ACP03 (figure 2). les résultats d'analyse d'invasion de Matrigel ont montré que les cellules ACP02 étaient plus invasive que ACP03 cellules (p = 0,001). Les résultats d'analyse de la migration ont montré que moins de cellules ACP02 migrés par rapport aux cellules ACP03 (p = 0,0028) (figure 2C-D). Figure 2 MYC, FBXW7 et p53 expression, la migration et la capacité d'invasion en ACP02 et ACP03. (A) Graphique émission moyenne ± SD de MYC, FBXW7 et p53 expression de la protéine dans ACP02 et ACP03. Ces protéines ont été normalisées par rapport au taux de bêta actine; (B) des données représentatives de MYC, FBXW7 et l'expression de la protéine p53; (C-D) Les graphiques montrent la moyenne ± SD de la migration et les cellules invasives triplicats dosage; (E) Les résultats représentatifs de MYC, FBXW7 et p53 immunofluorescence
deux ACP02 et ACP03 cellules présentées quatre bandes d'activité de gélatinase:. MMP-9 latente (92 kDa), MMP-9 active (88 kDa), MMP-2 latent ( 72 kDa), MMP-2 et active (66 kDa) (figure 3). Nous avons trouvé aucune différence significative dans la MMP-9 latente (p = 0,9788), la MMP-2 activée (p = 0,7848) et de la MMP-2 latent (p = 0,1678) entre les cellules et ACP02 ACP03. Toutefois, des différences significatives ont été trouvées entre les cellules ACP02 et ACP03 par rapport à la MMP-9 active (p = 0,0182). La figure 3 représentant une analyse de gélatine zymographie de MMP-2 et MMP-9 dans l'activité et ACP02 ACP03. (A) Les bandes correspondant aux deux formes latentes et actives de MMP-2 et MMP-9 ont été observées dans ACP02 et ACP03. analyses densitométriques sont des bandes correspondant à l'état latent et des formes actives de MMP-2 (B) et MMP-9 (C) Discussion de
. Dans la présente étude, nous avons observé que MYC
expression de l'ARNm a été augmentée dans les échantillons de GC par rapport aux échantillons non néoplasique correspondante. De plus, à notre connaissance, ceci est la première étude à signaler une association entre l'augmentation de MYC
expression de l'ARNm et la présence de métastases dans les ganglions lymphatiques et CG stade III-IV, ce qui renforce l'idée que MYC de la déréglementation est une forte facteur de malignité en GC.
Adams et al
. [20] et Leder et al.
[21] ont démontré que l'expression de l'ARNm de la dérégulation de MYC peut favoriser le développement du cancer dans des modèles de souris transgéniques. L'augmentation du niveau d'ARNm de MYC dans les cancers humains peut résulter tant des mécanismes directs et indirects, ce qui pourrait avoir plusieurs explications. Tout d'abord, MYC de l'amplification est le mécanisme le plus commun de MYC de la déréglementation en GC [5]. Ce mécanisme conduit à une production accrue de produits oncogènes en quantités qui dépassent la capacité de transcription d'un gène de copie recto normal. Ici, nous avons observé trois ou plus MYC copies
géniques dans 51,5% des tumeurs gastriques spécimens. Des études antérieures de notre groupe ont également montré que MYC de l'amplification ou la trisomie du chromosome 8, sur lequel MYC
est situé, était présent dans tous les échantillons de GC examinés par des particuliers dans le nord du Brésil, ainsi que dans des lignées cellulaires de GC établies par notre groupe de tumeurs de patients brésiliens [18, 22-27]. La présence d'une amplification MYC
a également été rapportée dans des échantillons de plasma d'individus avec GC [28]. Cependant, aucune association directe entre MYC
nombre de copies variation et de l'expression de l'ARNm a été détecté dans la présente étude.
Deuxièmement, l'augmentation de MYC
expression de l'ARNm peut résulter d'une recombinaison cohérente entre l'immunoglobuline (Ig) locus et le MYC
oncogène. Ce phénomène est fréquemment décrit dans le lymphome de Burkitt et est associé à une demi-vie plus longue de MYC de l'ARNm dans les cellules affectées [29]. Auparavant, notre groupe de recherche a observé MYC de les insertions dans de type diffuse GC principalement dans les chromosomes qui sont mappés à des gènes d'immunoglobulines (chromosomes 2, 14 et 22) [26]. Ainsi, translocation impliquant le MYC
locus (8q24) dans le type diffus CG chez les personnes du Nord du Brésil pourraient également refléter une augmentation de MYC
niveau de l'ARNm.
Immunohistochimie (IHC) analyse a révélé que l'expression de MYC est plus fréquemment trouvés dans de type intestinal GC que les spécimens de GC de type diffus. Ces modifications pourraient conduire à une protéine MYC anormale non reconnu par l'une des anticorps utilisés dans la présente étude. De plus, nous avons observé une association entre MYC
niveau d'expression de l'ARNm et MYC coloration. En outre, les mécanismes de contrôle de la stabilité post-transcriptionnels MYC [6, 30]. MYC de la déréglementation a été associée à la perte de FBXW7
, un gène suppresseur de tumeur haploinsuffisant. D'une manière générale, la perte de FBXW7 peut être causée par la perte d'hétérozygotie (LOH) et la mutation [30]. La perte au 4q, le locus du FBXW7, est récurrent des altérations chromosomiques dans GC [31, 32], et FBXW7 de les mutations ont été trouvées dans 3.7-6% des tumeurs gastriques [12]. Dans
la présente étude, nous avons observé une seule copie du gène de la FBXW7 dans 45,16% des tumeurs gastriques étudiés. Fait intéressant, l'expression de l'ARNm de FBXW7 dans des échantillons de GC est nettement diminué par rapport à un tissu non néoplasique correspondante. En outre, l'expression d'ARNm de la dérégulation de FBXW7 était associée à la présence de métastases des ganglions lymphatiques et du stade de la CG III-IV, comme cela a été également observée avec MYC d'ARNm. Ces résultats corroborent les travaux de Yokobori el al.
[13], qui a également montré une association entre l'expression de l'ARNm et des ganglions lymphatiques de la métastase de réduction FBXW7 qui contribue au potentiel malin des cellules du GC et des résultats dans un mauvais pronostic. De plus, nous avons observé que l'expression de Myc hôtels et FBXW7 de l'ARNm ont tendance à être inversement corrélée à la présente étude.
Plusieurs études ont montré que l'inactivation MYC
supprime les tumeurs chez les animaux, ce qui suggère que MYC
peut être une cible moléculaire dans le traitement du cancer [33-35]. Alternativement, Soucek et al
. [36] a proposé que FBXW7 pourrait faciliter la «thérapie de dormance tumorale". Ainsi, la dégradation par MYC FBXW7 peut non seulement induire un état de dormance tumorale, mais pourrait aussi avoir un effet anti-tumoral. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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