MYC, FBXW7 a TP53 počet kópií variabilita a expresie v žalúdku Cancer

MYC, FBXW7 stroje a TP53
variácií v počte kópií a expresia v karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
MYC deregulácie je bežná udalosť v žalúdočné karcinogenézy, zvyčajne v dôsledku amplifikácie génu, chromozomálne translokácie, alebo posttranslační mechanizmy. FBXW7
je p53 riadené tumor-supresorové, že hrá úlohu v regulácii bunkového cyklu a výstupu reentry prostredníctvom degradácie MYC.
Metódy
sme hodnotili MYC
, FBXW7
a TP53
počtom kópií, mRNA a expresie proteínu v karcinómu žalúdka a párových nenádorových vzoriek od 33 pacientov, a tiež v adenokarcinóme žalúdka bunkových línií. Zistili sme tiež, invázia potenciálu rakovinových bunkových línií žalúdka.
Výsledky
MYC
amplifikácia bola pozorovaná u 51,5% žalúdočných nádorových vzoriek. Vypustenie jednej kópie FBXW7 stroje a TP53
sa pozorovala u 45,5% a 21,2% z nádorov žalúdka, resp. Myc
mRNA expresie bol u nádorov významne vyššia ako u non-neoplastických vzoriek. FBXW7 stroje a TP53
mRNA expresie bol u nádorov výrazne nižšie ako v párových nenádorových vzoriek. Okrem toho, deregulovaný MYC stroje a FBXW7
expresie mRNA bola spojená s prítomnosťou lymfatických uzlín a nádorové štádiu III-IV. Navyše, MYC imunologické bola častejšie pozorovaná črevnej typu než karcinómov žalúdka difúzneho typu a bola spojená s MYC
mRNA expresie. Štúdie in vitro ukázali, že zvýšená MYC a zníženej expresie FBXW7 je spojená s viacerými invazívne fenotypu v žalúdočnej nádorových bunkových línií. Tento výsledok nás by mali aktivitu gelatináz MMP-2 a MMP-9 v oboch bunkových líniách. Oba Gelatinasy sú syntetizované prevažne buniek strómy skôr než rakovinových buniek, a bolo navrhnuté, že prispievajú k progresii rakoviny. Pozorovali sme významné zvýšenie MMP-9 aktivity v porovnaní s ACP02 ACP03 bunkami. Tieto výsledky potvrdili, že ACP02 bunky majú väčšiu invázie schopnosťou než ACP03 buniek.
Záver
Záverom možno konštatovať, FBXW7 a MYC mRNA môže hrať úlohu v agresívnom biologickej správanie buniek karcinómu žalúdka a môže byť užitočným indikátorom zlej prognózy. Okrem toho MYC je kandidátom terčom nových liečebných postupov proti rakovine žalúdka.
Kľúčové
Karcinóm žalúdka MYC FBXW7 TP53 pozadí
rakoviny žalúdka (GC) je štvrtou najčastejšou rakovinou a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu po celom svete [1]. GC je považovaný za hlavný problém verejného zdravia, najmä v rozvojových krajinách, vrátane Brazílie [2].
Základné aspekt karcinogenézy je nekontrolované proliferácie buniek vyplývajúcej z nahromadenia zmien, ktoré podporujú expresiu alebo potláčanie bunkový cyklus regulačných génov [3]. MYC
je transkripčný faktor podieľa na regulácii bunkového cyklu a bunkového rastu zatknutie, ktorý sa bežne deregulované u rakovín a bol popisovaný ako kľúčový prvok žalúdočné karcinogenéze [4, 5]. Niekoľko rôznych typov posttranslačních modifikácií myc boli popísané, vrátane fosforylácie, acetylácia a ubiquitinace [6]. Ubiquitin-proteasomu systém je hlavným degradácie proteínov regulačné dráhy podieľa na diferenciáciu buniek a rastu kontroly [7]. FBXW7
kóduje proteín podjednotky F-box na Skp1 /Cul1 /F-box komplexu (VVP) ubikvitin ligázu zložité. SCF FBXW7 indukuje degradáciu produktov pozitívnych génov bunkového cyklu regulačného orgánu, ako je cyklin E
MYC
zárezov stroje a JUN
prostredníctvom fosforylácie závislé ubiquitinace [8]. Medzi SCF FBXW7 substrátov, MYC je obzvlášť dôležité v výjazde bunkového cyklu, pretože sa predpokladá, že hrajú úlohu pri určovaní, či cicavčie bunky sa rozdelia, alebo nie. [9]
deregulovaný FBXW7
expresie je hlavnou príčinou karcinogenese [10-12]. Strata FBXW7
expresie môže viesť k nadmernej expresii MYC a bola spojená so zlou prognózou u pacientov s GC [13]. Avšak, MYC aktivácia FBXW7
stratou spúšťa aktiváciu proteínu p53, ktorý hrá kľúčovú úlohu v regulácii bunkovej reakcie na poškodenie DNA a abnormálne expresie onkogénov. Indukcia zastavenia bunkového cyklu p53 umožňuje opravy DNA alebo indukciu apoptózy [14]. Tak, súčasnou stratou FBXW7 stroje a TP53
je nevyhnutná pre genetické nestability a tumorigeneze [11].
V tejto štúdii sme skúmali MYC
FBXW7 stroje a TP53
kópie génu počet variácií a mRNA a expresie proteínov vo vzorkách GC a adenokarcinóme žalúdka bunkových línií. Možné spojenie medzi našich zistení a klinicko-funkcií a /alebo inváziu a migračné schopnosti bunkové línie boli tiež hodnotené.
Metódy
klinických vzoriek
Vzorky boli získané zo 33 pacientov, ktorí podstúpili GC chirurgické ošetrenie v João de Barros Barreto Fakultnej nemocnice stať Pará, Brazília. Členitý nádorové a párové vzorky non-neoplastické tkanivá boli okamžite rez od žalúdka a zmrazený v kvapalnom dusíku až do extrakcie RNA.
Klinicko vlastnosti vzoriek pacientov sú uvedené v tabuľke 1. Vzorky GC boli klasifikované podľa Lauren [15] , Všetky vzorky GC ukázala prítomnosť Helicobacter pylori stroje a ČAGA faktor virulencie bola stanovená pomocou PCR analýzou močoviny stroje a ČAGA
ako je popísané v Clayton et al
. [16] a Covacci et al.
[17], v tomto poradí. Všetci pacienti mali negatívny minulosti vystavenie buď chemoterapiu alebo rádioterapiu pred operáciou, a neboli zistené žiadne ďalšie spolupracovníci výskyty diagnostikovaných nádorov. Informovaný súhlas so súhlasom etickej komisie Federálneho University of Pará bol obtained.Table 1 MYC, FBXW7 a TP53 kópie génu číslo variácie, MYC a proteín p53 expresie a klinicko-patologické charakteristiky 33 pacientov GC
CNV Myc
CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 kópie (n = 16)
≥ 3 kópií (n = 17)
p hodnota
2 kópie (n = 18)
1 výtlačok (n = 15)
p hodnota
2 kópie (n = 25)
1 copy (n = 7)
p - hodnota
P (n = 19)
N (n = 14)
p hodnota
P (n = 6)
N (n = 25)
p hodnota
Age (y) (priemer ± SD) Hotel > 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2)
9
5
6
8
10
4
10
9
2
17
Pohlavie
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10
12
6
8
10
5
13
Histopatologické
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9
1 Sims 3
8
1
10
Hĺbka invázie tumoru
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
metastáz do lymfatických uzlín
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10
10
15
4
13
7
5
15
Stage
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11
4
8
7
4.
11
myc IHC
Negative
5
8
0,481
7
6
1,000
11
2
0,671
Pozitívne
11
9
11
9
14
5
p53 IHC
Negatívne
14
12
0,398
14
12
1,000
21
4
0,157
pozitívny
2
5
4 Sims 3
4 Sims 3
* p Hotel &0,05; P: pozitívny; N :. negatívny
bunkových línií
adenokarcinóme žalúdka bunkové línie ACP02 a ACP03 [18] boli kultivované v kompletnom médiu RPMI (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) doplneného sérom 10% fetálne bovinné (FBS), 1% penicilín /streptomycín, a 1% kanamycín.
variácií v počte kópií (CNV)
DNA bola extrahovaná za použitia DNAQiamp mini kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa inštrukcií výrobcu. Duplex kvantitatívnej PCR v reálnom čase (real-time qPCR) bola vykonávaná s použitím FAM /MGB značených TaqMan sond pre MYC
(Hs01764918_cn), FBXW7
(Hs01362464_cn), alebo TP53
(Hs06423639_cn), a VIC /TAMRA-značený TaqMan CNV RNázy P
(Ƹ3326), bol použitý pre vnútorné kontroly. Všetky real-time qPCR reakcie boli vykonávané v štyroch s gDNA podľa protokolu výrobcu s použitím 7500 Fast real-time PCR systém (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Počet kópií každej vzorky bola odhadnutá CNV analýzu pomocou Copy volajúceho Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Známe ľudskej genómovej DNA (Promega, Madison, USA) bol použitý pre kalibráciu.
Kvantitatívne real-time PCR s reverznej transkriptázy
Celková RNA bola extrahovaná TRI činidla ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, USA ) podľa inštrukcií výrobcu. Koncentrácia RNA a kvalita boli stanovené za použitia spektrofotometra Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) a 1% agarosových géloch. Komplementárna DNA (cDNA) sa pripraví za použitia High-Capacity cDNA Archive kit podľa odporúčania výrobcu (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Real-time qPCR priméry a TaqMan sondy zamerané MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7
(Hs00217794_m1), a TP53
(Hs01034249_m1) boli zakúpené ako produkty Testy-on-Demand pre génovú expresiu ((Life Technologies, , Foster City, CA, USA) v reálnom čase qPCR bola vykonaná za použitia ABI Prism 7500 systém (Life Technologies, Foster City, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu GAPDH
(NM_002046.3 ,. Life Technology, USA) bol vybraný ako vnútorná kontrola na monitorovanie vstupnej RNA a reverznej účinnosti transkripcie. Všetko v reálnom čase qPCR reakcia pre cieľové gény a internej kontroly boli vykonané v troch vyhotoveniach na tú istú dosku. relatívnej kvantifikácie (RQ) génovej expresie bola vypočítaná s použitím ΔΔCt spôsob [19], v ktorom je ne-neoplastickým vzorka bol označený ako kalibrátora pre každý spárovaný vzorku nádoru.
Imunohistochémia
Imunohistochemické analýzy pre MYC a p53 boli vykonané na formalínom fixovaných, parafínových chirurgické sekcií. bola použitá sériová 3-um rezy. Načítanie antigén tepelne indukovanej bol použitý (mikroprocesorom riadený tlak Pascal ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Súprava sekundárne protilátka univerzálny peroxidázou konjugovanou (LSAB System, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) bol použitý pre detekciu s Diaminobenzidine (DAB) ako chromogénu. Boli použité nasledujúce primárne protilátky: myšou monoklonálne protilátky namierené proti MYC (riedenie 1: 150, SC-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA a klonovať 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (riedenie 1:50, Abnova Corp., Taipei City, Taiwan), a p53 (riedenie 1:50, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Pozitívna expresia proteínu bola definovaná ako číreho nukleárna farbenie u viac ako 10% buniek.
Migrácia a invázia test
migrácie a invázie Testy boli vykonávané v upravenom Boyden komory s filtračnej vložky (8-um pórov) pre 12-jamkové dosky (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Pre posúdenie inváziu, filtre boli potiahnuté 10 ul Matrigel (10 až 13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), zatiaľ čo na ľade. Bunky (2 x 10 5), boli umiestnené do hornej komory v 1 ml RPMI bez FBS. Spodná komora bola naplnená 1,5 ml RPMI s FBS. Po 48 hodinách v kultúre boli bunky fixované 4% paraformaldehydom a post-fixné s 0,2% kryštalickej fialovej v 20% metanolu. Bunky na hornej strane filtra, vrátane tých, ktoré sa v Matrigelu, boli odstránené s vatovým tampónom. Napadajúce bunky (na spodnej strane filtra) boli fotografované a počítané. Pokusy boli vykonané v troch opakovaniach.
Imunofluorescencie
bunky kultivované na sklenených krycích sklíčkach boli fixované 1% paraformaldehydom vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) po dobu 10 minút, potom sa permeabilizovány 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) v PBS po dobu 15 minút a blokované 1% hovädzím sérovým albumínom (BSA) v PBS. Bunky boli zafarbené s myšími protilátkami proti MYC (zriedený 1:50; Zymed ®, USA), p53 (zriedený 1:50, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), a FBXW7 (zriedený 1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Taiwan). Primárne protilátky boli detekovaná s použitím anti-myšou Alexa-568-konjugované sekundárnej protilátky (Invitrogen). Všetky inkubácie sa vykonávali po dobu 60 minút pri teplote miestnosti. Jadrá bola farbená DAPI vo predĺžiť anti-fade montovacího média (Invitrogen). Negatívne kontrolné vzorky boli spracované ako je popísané vyššie s tým rozdielom, že primárna protilátky boli vypustené a nahradené samotným PBS.
Western blotting
extrakcie proteínu z buniek bola vykonaná v súlade so štandardnými postupmi. V stručnosti, celková bielkovina bola extrahovaná z buniek ACP02 a ACP03 za použitia 50 mM Tris-HCl pufra, ktorý obsahuje 100 mmol /l NaCl, 50 mM NaF, 1 mM NAVO 4, 0,5% NP-40, a kompletné koktejlom inhibítora proteázy (Roche , Nemecko). Koncentrácia proteínu bola odhadnutá s použitím testu Bradford (Sigma-Aldrich). Asi 30 ug celkového proteínového extraktu sa nanesie na 12% dodecylsulfát sodný, gélová elektroforéza sulfát-polyakrylamid (SDS-PAGE), gélu a elektroforeticky. Vyriešené proteíny potom boli prenesené z gélu na nitrocelulózové membránu. Membrána bola blokovaná 5% netučného mlieka v Tris-pufrovanom soľnom roztoku obsahujúcom 5% Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA), a potom inkubované s myšou monoklonálnou anti-myc (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei City, Taiwan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), a anti-β-aktínu (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) protilátky v riedení 1: 200, 1: 100, 1: 100 a 1: 2000, v danom poradí. Následne boli membrány inkubovali s 1: 5000 riedenie s chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou ovčej anti-myšou protilátky (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Proteíny boli vizualizované zosilnenou chemiluminiscenčnej metódy.
Zymografií
ACP02 a ACP03 bunky (5 x 10 4 každého) boli vrúbľovať a nechajú priľnúť a šíriť po dobu najmenej 8 hodín. Adherentní bunky boli premyté trikrát s PBS, a kultivačné médium bolo nahradené médiom po dobu 24 hodín bez séra. Aktivita MMP2 a MMP9 do kondicionovaného média bola hodnotená zymografie. Kondicionované médium sa oddelí, zahustí sa (MicroCon 30 K, Merck Millipore, Darmstadt, Nemecko) a resuspendované v SDS-PAGE vzorkovej pufra (bez beta-mercaptoetanolu). Zostávajúce bunky boli lyžovanie a koncentrácia proteínu bola odhadnutá s použitím BCA (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Celkom 1 ug proteínu z každého upraveného média sa rozdelí na 10% polyakrylamidových géloch obsahujúcich 0,2% želatíny. Po elektroforéze boli gély premyjú v 2,5% Triton X-100 po dobu 30 min, potom sa do rovnovážneho stavu v 10 mM Tris (pH 8,0) a inkubuje sa pri teplote 37 ° C počas 16-24 hodín vo vývojovom pufri obsahujúcom 50 mM Tris (pH 8,0 ), 5 mM CaCl 2 a 0,02% NaN 3. Gély boli zafarbené 0,2% Coomassie blue R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) a odfarbí sa 1: 1 ľadovej kyseliny octovej /metanolu. Pokusy boli vykonané v troch opakovaniach. Zymographic pásy, ktoré indikujú MMP, boli kvantifikované skenovanie denzitometria.
Štatistických analýz
normalita variabilných rozvodov bola stanovená pomocou testu Shapiro-Wilk. Asociácia medzi MYC
FBXW7 stroje a TP53
variácií v počte kópií, hladiny mRNA, expresie proteínov, klinicko-patologické rysy a invázie buniek a migračnej schopnosti boli analyzované pomocou chi-kvadrát (χ 2) a Mann-Whitney testuje. Korelácia medzi expresiou rôznych cieľových mRNA bola stanovená za použitia Spearmanův test, v ktorom je hodnota nižšia ako 0,3 uvedenú slabú koreláciu, 0,3-0,7 uvedené stredné koreláciu, a hodnoty nad 0,7 ukázali silnú koreláciu. Dáta sú uvedené ako stredné a interkvartilný rozsahu; P hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za významné.
Výsledky
nádor žalúdka vzorky vykazovali zosilnenie MYC stroje a vypustenie FBXW7 stroje a TP53
tri alebo viac kópií MYC
boli nájdené v 51,5% (17/33) žalúdočného nádorových buniek. Na rozdiel od 45,5% (15/33) a 21,2% (7/33) žalúdočného nádorových buniek obsahovala iba jednu kópiu FBXW7 stroje a TP53
, resp.
Pridruženie medzi klinicko-funkcií a MYC
, FBXW7 stroje a TP53
počet kópií sú zhrnuté v tabuľke 1. Jeden nádor žalúdka, ktorá obsahovala tri kópie TP53
bol vylúčený z analýzy chi-kvadrát. Nebola nájdená súvislosť medzi počtu kópií variácie génov študovaných a klinicko-funkcií.
MYC
mRNA expresia bola u nádorov vyššia ako u nenádorových vzoriek, zatiaľ čo FBXW7 stroje a TP53
mRNA expresie bol nižší v nádore vzorky
úroveň prejavenia myc mRNA
(2,01 ± 1,72 násobné zmeny) vo vzorkách nádorovom tkanive bol významne vyšší ako u non-neoplastické tkaniva (p = 0,0002), zatiaľ čo úrovňou expresie FBXW7
mRNA (0,53 ± 0,40 krát zmeny) a TP53
mRNA (0,84 ± 0,55 krát zmeny) v tkanivových vzorkách nádoru bol významne nižší ako u non-neoplastické tkaniva (p 0,0001 a p = 0,0011, respektíve). Sme nezistili významnú koreláciu medzi MYC
FBXW7 stroje a TP53
mRNA (MYC
/FBXW7
mRNA r = -0,3464, p = 0,0562; MYC
/TP53
mRNA r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7
/TP53
mRNA r = -0,0745, p = 0,4747). Takto bola zistená len tendencia k korelácia medzi zvýšením MYC
expresie mRNA a zníženie FBXW7
mRNA expresie.
Tabuľke 2 sú zhrnuté vzťahy medzi rôznymi funkciami a klinicko-RQ myc
, FBXW7 stroje a TP53
mRNA expresie v nádore a párové nenádorových vzorky. Zvýšenie MYC
úrovni mRNA bola spojená s prítomnosťou lymfatických uzlín (p = 0,016) a GC tumor štádiu III-IV (p = 0,036). Významné zníženie hladiny mRNA FBXW7
bol tiež spájaný s metastázami prítomnosť lymfatických uzlín (p = 0,015) a nádorové štádiu III-IV (p = 0,008) .Table 2 MYC, FBXW7 a TP53 mRNA expresné hladiny a klinicko-patologické faktory 33 onkologickí pacienti žalúdočnej
n (%)
MYC
p hodnota
FBXW7

p hodnota
TP53
p hodnota
Median ± IQR
Median ± IQR
Median ± IQR
vek (y) (priemer ± SD) Hotel > 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%)
2,04 ± 1,35
0.8873
0,55 ± 0,37
0,9247
0,86 ± 0,62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%)
1,44 ± 4,88
0,53 ± 0,50
0,94 ± 1,65
rodovej rovnosti
Male
15 (45,5%)
2.01 ± 1,01
0,4065
0,53 ± 0,22
0,6353
0,89 ± 0,58
0,8125
Žena
18 (54,5%)
1,67 ± 2,03
0,56 ± 0,56
0,87 ± 0,69
histopathology
črevných
22 (66,7%)
2,06 ± 0,99
0,3525
0,53 ± 0,16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
Difúzna
11 (33,3%)
1,40 ± 2,32
0,77 ± 0,74
0,94 ± 0,38
Hĺbka invázie tumoru
T1
6 (18,2%)
0,89 ± 0,47
0.0857
0,88 ± 0,58
0,0678
0,85 ± 0,15
0.7069
T2-T4
27 (81,8%)
2.08 ± 1,42
0,53 ± 0,43
0,91 ± 0,79
lymfatických uzlín
neprítomný
13 (39,4%)
0,98 ± 1,09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0,84 ± 0,44
0,6121
Prezentujte
20 (60,6%)
2.10 ± 2.20
0,46 ± 0,38
0,94 ± 0,79
Stage
I-II
18 (54,5%)
1,39 ± 1,23
0,0362 *
0,57 ± 0,38
0.0380 *
0,83 ± 0,55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2,41 ± 2,79
0,34 ± 0,45
0,96 ± 1,19
MYC IHC
pozitívne
20 (60,6%)
2,18 ± 1,59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0,81 ± 0,57
0,1372
Negatívne
13 (39,4%)
0,89 ± 0,85
0,58 ± 0,53
0,99 ± 0,90
p53 IHC
pozitívny
7 (21,2%)
4,25 ± 6,53
0.0891
0,64 ± 0,68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
Negatívne
26 (78,8%)
2,00 ± 1,44
0,55 ± 0,35
0,87 ± 0,60
* p Hotel < 0,05; IQR :. medzikvartilové rozsah
farbenie jadrových MYC proteín je spojená s črevnou-Type GC
pozitívne farbenie pre jadrovú MYC a p53 bola zistená u 64,5% (20/31) a 19,4% (6/31) zo vzoriek GC , v uvedenom poradí (obrázok 1). Žiadne pozitivita bol nájdený FBXW7. Tabuľka 1 zhŕňa klinicko-patologické rysy a myc a výsledky p53 imunobarvení. Expresia MYC bol črevnej typu častejšie než difúzna typu GC (p = 0,007). Okrem toho, MYC imunologické sa vo zvýšenej miere MYC
úrovni mRNA (p = 0,0022). Nebola nájdená súvislosť medzi p53 immunostaining a klinicko-charakteristiky, TP53
počtu kópií, alebo TP53
mRNA expresie. Obrázok 1 Imunohistochemické analýza MYC a expresie proteínu p53 v GC. (A) Negatívny MYC imunologické v difúznej typu GC; (B) MYC imúnny pozitivity v črevnej typu GC; (C) Pozitívny p53 imunologické v difúznej typu GC; (D) P53 imunitného pozitivita črevného typu GC (zväčšenie x 40).
Porovnanie bunkových línií ACP02 a ACP03
Obaja ACP02 a ACP03 bunky obsahoval tri myc
kópií a iba jeden FBXW7
kópiu , Počet kópií TP53
bol neurčený v oboch bunkových líniách. V porovnaní s expresiou mRNA v bunkách ACP03, ACP02 bunky exprimovali vyššej úrovne MYC
(1,34-násobné), a nižšou úrovňou FBXW7 stroje a TP53
mRNA (0.62- a 0,73-krát, v tomto poradí).
Western blot analýzy bolo zistené, že expresia MYC bola významne vyššia u ACP02 bunkách než ACP03 buniek (p = 0,048). Navyše FBXW7 expresie bola v ACP02 bunkách než ACP03 buniek (p = 0,049), výrazne nižšie. Avšak, neexistuje žiadny významný rozdiel v expresii p53 medzi bunkových línií (p = 0,077) (obr 2A-B).
Imunofluorescenčný analýza oboch proteínov ukázala bodový vzor označovania, podporovať Western blot zobrazenie výsledkov zvýšenie MYC a zníženie FBXW7 expresiu v bunkách v porovnaní s ACP02 ACP03 (obrázok 2). Matrigel invázie Výsledky testu ukázali, že bunky boli ACP02 viac invazívna než ACP03 buniek (p = 0,001). Výsledky testu ukázali, že migrácia menej ACP02 bunky prenesené v porovnaní s ACP03 bunkami (p = 0,0028) (Obrázok 2C-D). Obrázok 2 MYC, FBXW7 a p53, migrácia a invázia schopnosť v ACP02 a ACP03. (A) Graf ukazujú priemer ± SD zo MYC, FBXW7 a expresiu proteínu p53 v ACP02 a ACP03. Tieto proteíny boli normalizované na úroveň beta aktínu; (B) Reprezentatívne údaje MYC, FBXW7 a expresie proteínu p53; (C-D) Grafy ukazujú priemer ± SD migrácie a invazívnych buniek trojmo test; (E) Reprezentatívne výsledky MYC, FBXW7 a p53 imunofluorescencie
Obaja ACP02 a ACP03 buniek prezentované štyri pásma gelatinasy aktivita :. MMP-9 latentný (92 kDa), MMP-9 aktívne (88 kDa), MMP-2 latentný ( 72 kDa), a MMP-2 je aktívna (66 kDa) (obrázok 3). Zistili sme žiadne významné rozdiely v MMP-9, latentný (p = 0.9788), MMP-2 je aktívny (p = 0,7848), a MMP-2 latentný (p = 0,1678) medzi ACP02 a ACP03 buniek. Avšak, bolo zistené významné rozdiely medzi ACP02 a ACP03 buniek s ohľadom na MMP-9, aktívny (p = 0,0182). Obrázok 3 reprezentatívnu analýzu želatína zymografií z MMP-2 a MMP-9 aktivity v ACP02 a ACP03. (A) skupiny zodpovedajúce obom latentné a aktívnej formy MMP-2 a MMP-9 boli pozorované ACP02 a ACP03. Denzitometrické analýzy sú z pásov zodpovedajúcich latentnej a aktívnej formy MMP-2 (B) a MMP-9 (C).
Diskusia
V tejto štúdii sme pozorovali, že MYC
expresie mRNA bola zvýšená vo vzorkách GC v porovnaní so zodpovedajúcimi non-neoplastických vzoriek. Okrem toho, ak je nám známe, jedná sa o prvú štúdiu, ktorá hlási súvislosť medzi zvýšenou MYC
expresie mRNA a prítomnosť lymfatických uzlín a CG štádiu III-IV, posilňuje myšlienku, že myc
deregulácie je silný faktorom pre malígne ochorenie v GC.
Adams et al
. [20] a Leder et al.
[21] preukázali, že myc mRNA expresie
deregulácie môže podporiť vývoj rakoviny v transgénnych myšiach modeloch. Zvýšenie MYC
úrovni mRNA v ľudských rakovín môžu vyplývať z priamych aj nepriamych mechanizmov, ktoré by mohli mať niekoľko vysvetlení. Po prvé, Myc
zosilnenie je najčastejší mechanizmus myc
deregulácie v GC [5]. Tento mechanizmus vedie k zvýšenej produkcii onkogénnych produktov, v množstve, ktoré presahujú transkripčný schopnosti normálneho génu dvojité kopírovanie. Tu sme pozorovali tri alebo viac myc
génových kópií v 51,5% vzoriek nádorov žalúdka. Predchádzajúce štúdie z našej skupiny, tiež ukázala, že myc
zosilnenie alebo Trizomia chromozómu 8, na ktorom je umiestnený MYC
, bol prítomný vo všetkých vzorkách GC skúmaných od jednotlivcov v severnej Brazílii, rovnako ako v bunkových líniách GC stanovených naša skupina z nádorov brazílskych pacientov [18, 22-27]. Prítomnosť MYC
amplifikácia bola tiež hlásená vo vzorkách plazmy od osôb s GC [28]. Avšak, žiadny priamy vzťah medzi myc
kopírovať bol zistený počet variácií a expresie mRNA v tejto štúdii.
Po druhé, zvýšenie MYC
mRNA expresia môže viesť od stálej rekombinácie medzi imunoglobulínu (Ig) a lokuse myc
onkogénu. Tento jav je často opísaný v Burkittovho lymfómu a je spojená s dlhším polčasom myc mRNA
v postihnutých bunkách [29]. Predtým sa naša výskumná skupina pozorované myc
vloženie do difúzna typu GC predovšetkým do chromozómov, ktoré sú namapované na gény imunoglobulínov (chromozómov 2, 14 a 22) [26]. Tak, chromozomálne translokácie zahŕňajúci myc
lokuse (8q24) v difúznej typu CG u jedincov zo severnej Brazílie by tiež odráža zvýšenie MYC
úrovni mRNA.
Imunohistochémia (IHC) analýza ukázala, že výraz je MYC častejšia u črevnej typu GC než exemplárov GC difúzneho typu. Tieto zmeny by mohli viesť k abnormálnym MYC proteín, ktorý nie je rozpoznaný jednou z protilátok použitých v tejto štúdii. Okrem toho sme pozorovali súvislosť medzi MYC
úrovne expresie mRNA a MYC farbenie. Okrem toho, posttranskripční kontrolné mechanizmy MYC stabilitu [6, 30]. Myc
deregulácie bola spojená so stratou FBXW7
, je haploinsufficient tumor supresorového génu. Všeobecne platí, že FBXW7
strata môže byť spôsobená stratou heterozygotnosti (LOH) a mutácie [30]. Strata na 4Q, na FBXW7
lokuse, je opakujúci sa chromozomálne zmeny v GC [31, 32], a FBXW7
mutácie boli nájdené v 3.7-6% z nádorov žalúdka [12]. V
súčasná štúdie, sme pozorovali iba jednu kópiu génu FBXW7
v 45,16% z nádorov žalúdka študovaných. Je zaujímavé, že FBXW7
expresie mRNA vo vzorkách GC sa výrazne znížila v porovnaní so zodpovedajúcimi ne-neoplastickou tkanivo. Okrem toho, FBXW7
expresie mRNA deregulácie bola spojená s prítomnosťou lymfatických uzlín a GC fázy III-IV, ako bolo tiež pozorované u myc
mRNA. Tieto zistenia potvrdzujú prácu Yokobori el al.
[13], ktoré tiež ukázala spojenie medzi obmedzenou schopnosťou FBXW7
expresie mRNA a lymfatických uzlín, ktoré sa podieľa na malígne potenciálu GC buniek a má za následok zlou prognózou. Navyše sme pozorovali, že expresie MYC stroje a FBXW7
mRNA tendenciu byť nepriamo úmerná v tejto štúdii.
Niekoľko štúdií ukázalo, že MYC
inaktiváciu potláča nádorov u zvierat, čo naznačuje, že MYC
môže byť molekulárnym cieľom v liečbe rakoviny [33-35]. Alternatívne, Souček a kol
. [36] navrhla FBXW7 mohlo uľahčiť "nádoru spánku terapia". Tak, degradácia myc tým FBXW7 môžu nielen vyvolať stav nádoru vegetačného pokoja, ale môže mať aj protinádorový účinok. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Infekcia Helicobacter pylori a cirkulujúce hladiny ghrelinu - systematická kontrola
• "Fast track" rehabilitácia po resekcii rakoviny žalúdka: skúsenosti s kapacitou 80 po sebe idúcich prípadov