MYC, FBXW7 und TP53 Kopienzahl Variation und Expression in Magen Cancer

MYC, FBXW7
und TP53
Zahlvariation kopieren und Expression in Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
MYC Deregulierung ist eine gemeinsame Veranstaltung in Magen Karzinogenese, in der Regel als Folge einer Genamplifikation, chromosomalen Translokationen oder posttranslationale Mechanismen. FBXW7
ist ein p53-gesteuerte Tumor-Suppressor, die eine Rolle bei der Regulation des Zellzyklus verlassen und Reentry über MYC-Abbau spielt.
Methoden kaufen Wir MYC
ausgewertet, FBXW7
und TP53
Kopienzahl, mRNA-Spiegel, und die Proteinexpression in Magenkrebs und gepaart nichtneoplastische Proben von 33 Patienten und auch in einem Adenokarzinom des Magens Zelllinien. Wir stellten fest, auch das Invasionspotential der Magenkrebszelllinien.
Ergebnisse
MYC
Amplifikation wurde in 51,5% der Magentumorproben beobachtet. Das Löschen einer Kopie von FBXW7
und TP53
wurde in 45,5% und 21,2% der Magentumoren beobachtet. MYC
mRNA-Expression war signifikant höher in Tumoren als in nicht-neoplastischen Proben. FBXW7
und TP53
Ausdruck mRNA deutlich geringer war in Tumoren als in gepaart nichtneoplastische Proben. Darüber hinaus dereguliert MYC
und FBXW7
mRNA-Expression wurde mit dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen und Tumorstadium III-IV verbunden. Zusätzlich wurde mehr MYC Immunfärbung häufig in Darm-Typ beobachtet als diffus-Typ Magenkrebs und wurde
mRNA-Expression mit MYC verbunden. In-vitro-Studien zeigten, dass MYC erhöht und reduziert FBXW7 Ausdruck mit einem invasiven Phänotyp bei Magenkrebs-Zelllinien verbunden ist. Dieses Ergebnis ermutigten uns die Aktivität der Gelatinasen MMP-2 und MMP-9 in beiden Zelllinien zu untersuchen. Beide Gelatinasen werden überwiegend von Stromazellen synthetisiert anstatt Krebszellen, und es wurde vorgeschlagen, daß sowohl an der Tumorprogression beitragen. Wir beobachteten eine signifikante Erhöhung der MMP-9-Aktivität in ACP02 verglichen mit ACP03-Zellen. Diese Ergebnisse bestätigten, dass ACP02 Zellen haben eine größere Invasion Fähigkeit als ACP03 Zellen.
Fazit
Abschließend FBXW7 und MYC-mRNA eine Rolle bei der aggressiven biologischen Verhalten von Magenkrebszellen spielen und kann ein nützlicher Indikator für die schlechte Prognose sein. Darüber hinaus ist MYC ein Kandidat Ziel für neue Therapien gegen Magenkrebs.
Schlüsselwörter Magenkrebs MYC FBXW7 TP53 hintergrund und Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebsart und die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit [1]. GC gilt eine große öffentliche Gesundheit betreffen, insbesondere in Entwicklungsländern, einschließlich Brasilien [2]. Ein wesentlicher Aspekt der Karzinogenese
ist unkontrollierte Zellproliferation aus der Anhäufung von Veränderungen führt, die die Expression oder Repression der Zellzyklus-Kontrollgene fördern [3]. MYC
ist ein Transkriptionsfaktor beteiligt Regulation des Zellzyklus und Zellwachstum Verhaftung, die häufig bei Krebserkrankungen dereguliert ist und hat als ein Schlüsselelement von Magen Karzinogenese beschrieben worden [4, 5]. Mehrere verschiedene Arten von posttranslationalen Modifikationen von MYC beschrieben wurden, einschließlich Phosphorylierung, Acetylierung und Ubiquitinierung [6]. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist das wichtigste regulatorische Protein Abbauweg in der Zelldifferenzierung und Wachstumskontrolle beteiligt [7]. FBXW7 Du ein F-Box-Protein-Untereinheit des Skp1 /CUL1 /F-Box-Komplex (SCF) Ubiquitin-Ligase-Komplex kodiert. SCF FBXW7 induziert Abbau der Produkte von positiven Zellzyklus-Regulatorgene, wie Cyclin E
, MYC
, NOTCH
und Juni
, durch Phosphorylierung abhängige Ubiquitinierung [8]. Unter SCF FBXW7 Substraten ist MYC von besonderer Bedeutung bei Ausfahrt Zellzyklus, weil es gedacht wird, eine Rolle zu spielen bei der Bestimmung, ob Säugetierzellen teilen oder nicht. [9]
deregulierten FBXW7
Ausdruck ist eine der Hauptursachen der Karzinogenese [10-12]. Der Verlust der FBXW7
Ausdruck kann zu MYC Überexpression führen und hat mit einer schlechten Prognose bei GC-Patienten [13] in Verbindung gebracht worden. Jedoch MYC Aktivierung durch FBXW7
Verlust löst die Aktivierung von p53, das bei der Regulation von zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden und abnormale Expression von Onkogenen eine Schlüsselrolle spielt. Induktion von Zellzyklusarrest durch p53 ermöglicht DNA Reparatur oder Apoptoseinduktion [14]. So ist damit einhergehenden Verlust von FBXW7
und TP53
notwendigen genetischen Instabilität und tumorigenesis zu induzieren [11]. In der vorliegenden Studie
untersuchten wir MYC
, FBXW7
und TP53
Genkopienzahl Variation und mRNA und Protein-Expression in GC-Proben und Linien Magen-Zelle Adenokarzinom. Mögliche Verbindungen zwischen unseren Erkenntnissen und der klinisch-pathologischen Merkmale und /oder Invasion und Migrationsfähigkeit der Zelllinien wurden ebenfalls bewertet.
Methoden
Klinische Proben
Proben von 33 GC-Patienten gewonnen wurden, die an der João chirurgische Behandlung unterzog de Barros Barreto University Hospital in Staat Pará, Brasilien. Dissected Tumor und gepaarte nicht-neoplastischen Gewebeproben wurden sofort aus dem Magen ausgeschnitten und in flüssigem Stickstoff bis zur RNA-Extraktion eingefroren. Die klinisch-pathologischen Eigenschaften der Patientenproben Was sind in Tabelle 1 GC-Proben wurden klassifiziert gezeigt nach Lauren [15] . Alle GC-Proben zeigten das Vorhandensein von Helicobacter pylori
und der cagA Virulenzfaktor wurde durch PCR-Analyse von Urea
ermittelt und cagA
wie von Clayton et al
beschrieben. [16] und Covacci et al.
[17], respectively. Alle Patienten hatten negative Historien der Exposition gegenüber entweder Chemotherapie oder Strahlentherapie vor der Operation, und es gab keine andere Kookkurrenzen der diagnostizierten Krebserkrankungen. Eine Einverständniserklärung mit Zustimmung der Ethikkommission der Bundesuniversität von Pará war obtained.Table 1 MYC, FBXW7 und TP53 Genkopienzahl Variation, MYC und p53-Protein-Expression und klinisch-pathologischen Eigenschaften von 33 GC-Patienten CNV MYC

CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 Kopien (n = 16)
≥ 3 Kopien (n = 17)
p-Wert
2 Kopien (n = 18)
1 Kopie (n = 15)
p-Wert
2 Kopien (n = 25)
1 Kopie (n = 7)
p - Wert
P (n = 19)
N (n = 14)
p-Wert
P (n = 6)
N (n = 25)
p-Wert
Alter (y) (Mittelwert ± SD)
> 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2)
9
5
6 8 10
4 10
9 2
17
Geschlecht
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8 10
12
6 8 10
5
13
Histopathologie
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9 seite 1 von 3
8 1 10
Tiefe der Tumorinvasion
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6 18
9
6 21
Lymphknotenmetastase
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10 10
15
4 13
7
5
15
Bühne
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11
4
8 7
4 11
MYC IHC
Negative
5
8 0.481
7
6 1.000
11 2
0.671
Positive
11
9
11
9
14
5
p53 Negative
14
12
0.398
14
12
1.000
21
4 0.157
IHC positive
2 5
4 3
4 3
* p
< 0,05; P: positiv; N:. negativen
Zelllinien
Gastric Adenokarzinom-Zellinien ACP02 und ACP03 [18] wurden in komplettem RPMI-Medium (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin /Streptomycin und 1% Kanamycin.
Kopienzahl Variation (CNV)
DNA extrahiert wurde unter Verwendung eines DNAQiamp Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Duplex quantitative real-time PCR (qPCR) wurde unter Verwendung der FAM /interpretiert MGB-markierte TaqMan Sonden für MYC
(Hs01764918_cn), FBXW7
(Hs01362464_cn) oder TP53
(Hs06423639_cn) und VIC /TAMRA-markierte TaqMan CNV RNAse P
(Ƹ3326) wurde für die interne Kontrolle verwendet. Alle Echtzeit-qPCR Reaktionen wurden in vierfacher Ausfertigung mit gDNA nach dem Protokoll des Herstellers mit einem 7500 Fast Real-Time-PCR-System (Life Technologies, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Die Kopienzahl jeder Probe wurde durch CNV-Analyse unter Verwendung Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA) geschätzt. Bekannte humaner genomischer DNA (Promega, Madison, USA) wurde für die Kalibrierung verwendet.
Quantitative Echtzeit-Transkriptase-PCR
Gesamt-RNA umgekehrt wurde mit TRI Reagenz extrahiert ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, USA folgende) die Anweisungen des Herstellers. RNA-Konzentration und Qualität wurden unter Verwendung eines ND-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) und 1% Agarose-Gelen bestimmt. Komplementäre DNA (cDNA) wurde unter Verwendung einer High-Capacity cDNA Archive Kit synthetisiert gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Real-time qPCR-Primer und TaqMan-Sonden Targeting MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7
(Hs00217794_m1) und TP53
(Hs01034249_m1) wurden als Assays-on-Demand-Produkte für die Genexpression ((Life Technologies erworben haben, . Foster City, CA, USA) Echtzeit-qPCR durchgeführt wurde mit einem ABI Prism 7500-System (Life Technologies, Foster City, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers GAPDH
(NM_002046.3;. Life Technology, USA) zur Überwachung von RNA-Eingang wurde als interne Kontrolle ausgewählt und die Transkriptionseffizienz umgekehrt. Alle Echtzeit-qPCR Reaktionen für Zielgene und die internen Kontrollen in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden, auf der gleichen Platte. die relative Quantifizierung (RQ) der Genexpression berechnet wurde die ΔΔCt mit Methode [19], in dem die nicht-neoplastischen Probe wurde als Kalibrator für jede gepaarte Tumorprobe bezeichnet.
Immunohistochemistry
Immunhistochemische für MYC wurden und p53 an Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitten durchgeführt chirurgischen analysiert. Serie 3-um-Schnitte wurden verwendet. Hitze-induzierte Antigen-Retrieval verwendet wurde (mikroprozessorgesteuerte Druck Pascal ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Eine universelle Peroxidase-konjugiertem sekundärem Antikörper-Kit (LSAB System DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) wurde für die Detektion mit Diaminobenzidin (DAB) als Chromogen verwendet. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: monoklonalen Maus-Antikörper, die gegen MYC (Verdünnung 1: 150; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA und klonen 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (Verdünnung 1:50 Abnova Corp., Taipei City, Taiwan) und p53 (Verdünnung 01.50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Positive Proteinexpression wurde als klare Kernfärbung definiert in mehr als 10% der Zellen.
Migration und Invasion Assay
Migration und Invasion Assays wurden in einer modifizierten Boyden-Kammer mit Filtereinsätzen (8 um-Poren) durchgeführt für 12-Well-Platten (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Zur Beurteilung der Invasion Filter wurden mit 10 &mgr; l Matrigel (10-13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) beschichtet, während auf Eis. Zellen (2 × 10 5) wurden in 1 ml RPMI ohne FBS in die obere Kammer plattiert. Die untere Kammer wird mit 1,5 ml RPMI mit FBS gefüllt. Nach 48 h in Kultur, mit 4% Paraformaldehyd nachfixiert und mit 0,2% Kristallviolett-Zellen wurden in 20% Methanol fixiert. Zellen auf der oberen Seite des Filters, auch in dem Matrigel wurden mit einem Baumwolltupfer entfernt. Eindringenden Zellen (auf der unteren Seite des Filters) wurden photographiert und gezählt. Experimente wurden dreifach durchgeführt.
Immunofluorescence
Zellen auf Glasdeckgläschen gezüchtet wurden für 10 min mit 1% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert, dann permeabilisiert mit 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in PBS für 15 min und mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockiert. Die Zellen wurden mit Maus-Antikörpern gegen MYC gefärbt (1:50; Zymed ®, USA), p53 (1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), und FBXW7 (1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Taiwan). Primäre Antikörper wurden unter Verwendung eines anti-Maus-Alexa-568-konjugierten sekundären Antikörper (Invitrogen) offenbart. Alle Inkubationen wurden für 60 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Kerne wurden mit DAPI in Prolong anti-fade Eindeckmediums (Invitrogen) gefärbt. Negative Kontrollproben wurden wie zuvor beschrieben verarbeitet, außer daß die primären Antikörper wurden mit PBS allein weggelassen und ersetzt werden.
Western-Blotting
Protein Extraktion aus Zellen wurde nach Standardverfahren durchgeführt. Kurz gesagt, wurde Gesamtprotein aus ACP02 und ACP03 Zellen extrahiert unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 100 mmol /L NaCl, 50 mM NaF, 1 mM NaVO 4, 0,5% NP-40, und vollständige Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche , Deutschland). Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Bradford-Assays (Sigma-Aldrich) geschätzt. Etwa 30 &mgr; g Gesamtproteinextrakt wurde auf eine 12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetragen und einer Elektrophorese geladen. Trennten Proteine ​​wurden dann aus dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Die Membran wurde mit 5% fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 5% Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) blockiert und dann mit monoklonalen Maus-Anti-MYC (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova inkubiert 200, 1:, Taipei City, Taiwan), Anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), und anti-β-Aktin (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) Antikörper verdünnt 1 100, 1: 100 und 1: 2000, respectively. 5000-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten Schaf-Anti-Maus-Antikörper (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) für 1 h bei Raumtemperatur: Anschließend wurden die Membranen mit einer 1 inkubiert. Proteine ​​wurden durch verstärkte Chemilumineszenz sichtbar gemacht.
Zymographie
ACP02 und ACP03-Zellen (5 × 10 4 von jedem) wurden plattiert und man ließ sie anhaften und ausbreiten für mindestens 8 h. Adhärente Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und das Kulturmedium wurde mit serumfreiem Medium für 24 h ersetzt. Die Aktivität von MMP2 und MMP9 in dem konditionierten Medium wurde durch Zymographie untersucht. Das konditionierte Medium wurde gesammelt, konzentriert (Microcon 30 K, Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) pelletiert und in SDS-PAGE-Probenpuffer (ohne β-Mercaptoethanol). Die verbleibenden Zellen wurden lysiert und die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Assay (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA) abgeschätzt. Insgesamt 1 &mgr; g Protein von jedem konditionierte Medium wurde auf 10% Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt, das 0,2% Gelatine. Nach der Elektrophorese wurden die Gele für 30 min in 2,5% Triton X-100 gewaschen, dann in 10 mM Tris (pH 8,0) und bei 37 ° C für 16-24 h in einem Entwicklungspuffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 8,0 inkubiert ), 5 mM CaCl 2 und 0,02% NaN 3. Die Gele wurden mit 0,2% Coomassie Blau R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) gefärbt und entfärbt mit 1: 1 Essigsäure /Methanol-Lösung. Experimente wurden dreifach durchgeführt. Zymographische Bänder, die bezeichnend für die MMP-Aktivität sind, wurden durch Scanning-Densitometrie quantifiziert.
Statistische Analysen
Die Normalität der variablen Verteilung bestimmt die Shapiro-Wilk-Test. Assoziationen zwischen MYC
, FBXW7
und TP53
Zahländerung zu kopieren, mRNA-Spiegel, Proteinexpression, klinisch-pathologischen Eigenschaften und Zellinvasion und Migrationsfähigkeit wurden mit dem Chi-Quadrat analysiert (χ 2) und Mann-Whitney-Tests. Die Korrelation zwischen der Expression der verschiedenen Ziel-mRNAs wurde mit Spearman-Test bestimmt, in dem ein Wert unter 0,3 eine schwache Korrelation angegeben ist, angegeben 0,3-0,7 eine mittlere Korrelation und Werte über 0,7 zeigte eine starke Korrelation. Die Daten werden als Median und Interquartilbereich gezeigt; p-Werte von weniger als 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Ergebnisse | Magentumorproben zeigte Amplifikation von MYC
und Löschen von FBXW7
und TP53
Drei oder mehr Kopien von MYC
wurden in 51,5% (17/33) der Magentumorzellen gefunden. Im Gegensatz dazu 45,5% (15/33) und 21,2% (7/33) der Zellen Magentumor enthielt nur eine Kopie von FBXW7
und TP53
sind.
Der Zusammenhang zwischen klinisch-pathologischen Eigenschaften und MYC
, FBXW7
und TP53
Nummer kopieren ist in Tabelle 1 Ein Magentumor zusammengefasst, die drei Kopien von TP53 enthielt
von der Chi-Quadrat-Analyse ausgeschlossen wurde. Es wurde kein Zusammenhang zwischen der Kopienzahl Variation der Gene untersucht und klinisch-pathologischen Eigenschaften gefunden.
MYC
mRNA-Expression war höher bei Tumoren als in nicht-neoplastischen Proben, während FBXW7
und TP53
Ausdruck mRNA war niedriger in Tumorproben
die Expression von MYC
mRNA (2,01 ± 1,72-fache Veränderung) in Tumorgewebeproben war signifikant höher als in nicht-neoplastischen Gewebe (p = 0,0002), während die Expression von FBXW7
mRNA (0,53 ± 0,40-fache Veränderung) und TP53
mRNA (0,84 ± 0,55-fache Veränderung) in Proben Tumorgewebe war signifikant niedriger als in nicht-neoplastischen Gewebe (p < 0,0001 und p = 0,0011, respectively). Wir haben nicht eine signifikante Korrelation zwischen MYC
, FBXW7
und TP53
mRNA-Expression (MYC
/FBXW7
mRNA r = -0,3464, p = 0,0562 finden, MYC
/TP53
mRNA r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7
/TP53
mRNA r = -0,0745, p = 0,4747). Somit wurde nur eine Tendenz zur Korrelation zwischen einem Anstieg der MYC
mRNA-Expression und eine Verringerung in FBXW7
mRNA-Expression nachgewiesen.
Tabelle 2 sind die Verbindungen zwischen verschiedenen klinisch-pathologischen Eigenschaften und dem RQ von MYC
FBXW7,
und TP53
mRNA-Expression in Tumor und gepaart nichtneoplastische Proben. Eine Erhöhung der MYC
mRNA-Ebene wurde mit dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen (p = 0,016) und GC Tumorstadium III-IV (p = 0,036) zugeordnet ist. Eine signifikante Reduktion der FBXW7
mRNA-Ebene wurde auch mit der Anwesenheit Lymphknotenmetastasen (p = 0,015) und Tumor-Stadium III-IV (p = 0,008) .Tabelle 2 MYC, FBXW7 und TP53 mRNA Expression und klinisch-pathologischen Faktoren, die von 33 Magenkrebs-Patienten
n (%)
MYC
p-Wert
FBXW7

p-Wert
TP53
p-Wert
Median ± IQB
Median ± IQB
Median ± IQB
Alter (y) (Mittelwert ± SD)
> 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%)
2,04 ± 1,35
0,8873
0,55 ± 0,37
0,9247
0,86 ± 0,62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%) 1,44 ± 4,88
0,53 ± 0,50
0,94 ± 1,65

Gender
Male
15 (45,5%)
2,01 ± 1,01
0,4065
0,53 ± 0,22
0,6353
0,89 ± 0,58
0,8125
Weiblich
18 (54,5%)
1,67 ± 2,03
0,56 ± 0,56
0,87 ± 0,69
Histopathologie
Intestinale
22 (66,7%)
2,06 ± 0,99
0,3525
0,53 ± 0,16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
Diffuse
11 (33,3%)
1,40 ± 2,32
0,77 ± 0,74
0,94 ± 0,38
Tiefe von T1
Tumorinvasion
6 (18,2%)
0,89 ± 0,47
0,0857
0,88 ± 0,58
0,0678
0,85 ± 0,15
0,7069
T2-T4
27 (81,8%)
2,08 ± 1,42
0,53 ± 0,43
0,91 ± 0,79
Lymphknotenmetastase
Absent
13 (39.4%)
0,98 ± 1,09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0,84 ± 0,44
0,6121
20 (60,6%) Präsentieren
2,10 ± 2,20
0,46 ± 0,38
0,94 ± 0,79
Bühne
I-II
18 (54,5%)
1,39 ± 1,23
0,0362 *
0,57 ± 0,38
0,0380 *
0,83 ± 0,55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2,41 ± 2,79
0,34 ± 0,45
0,96 ± 1,19
MYC IHC
Positive
20 (60,6%)
2,18 ± 1,59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0,81 ± 0,57
0,1372
Negative
13 (39,4%)
0,89 ± 0,85
0,58 ± 0,53
0,99 ± 0,90
p53 IHC
Positive
7 (21,2%)
4,25 ± 6,53
0,0891
0,64 ± 0,68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
Negative
26 (78,8%)
2,00 ± 1,44
0,55 ± 0,35
0,87 ± 0,60
* p
< 0,05; IQB. Quartilabstand
Nuclear MYC Protein-Färbung mit Darm-Typ GC
Eine positive Färbung für Kern MYC und p53 assoziiert ist, wurde in 64,5% (20/31) und 19,4% (6/31) der GC-Proben gefunden bzw. (Abbildung 1). Keine Positivität wurde für FBXW7 gefunden. Tabelle 1 fasst die klinisch-pathologischen Eigenschaften und MYC und p53-Immunfärbung Ergebnisse. Die Expression von MYC war häufiger in Darm-Typ als diffus-Typ GC (p = 0,007). Darüber hinaus wurde MYC Immunfärbung mit erhöhter MYC
mRNA-Ebene (p = 0,0022) assoziiert. Es wurde kein Zusammenhang zwischen p53-Immunfärbung und klinisch-pathologischen Merkmale, TP53
Kopienzahl oder TP53
mRNA-Expression gefunden. Abbildung 1 Immunhistochemische Analyse von MYC und p53-Proteinexpression in GC. (A) Negative MYC Immunfärbung bei diffusem-Typ GC; (B) MYC Immun Positivität in Darm-Typ GC; (C) Positive p53-Immunfärbung bei diffusem-Typ GC; (D) p53 Immun Positivität in Darm-Typ GC (Vergrößerung × 40).
Von ACP02 und ACP03 Zelllinien
Beide ACP02 und ACP03 Zellen enthielt drei MYC
Kopien und nur ein FBXW7
Kopie . Die Anzahl der Kopien TP53
war unbestimmt in beiden Zelllinien. Im Vergleich mit mRNA-Expression in ACP03 Zellen, ausgedrückt ACP02 Zellen ein höheres Maß an MYC
(1,34-fach) und unteren Ebenen der FBXW7
und TP53
mRNA (0.62- und 0,73-fache, beziehungsweise).
Western-Blot-Analysen zeigten, dass MYC-Expression war signifikant höher in ACP02 Zellen als ACP03 Zellen (p = 0,048). Darüber hinaus war FBXW7 Expression signifikant niedriger in ACP02 Zellen als ACP03 Zellen (p = 0,049). Es gibt jedoch keinen signifikanten Unterschied in p53-Expression zwischen den Zelllinien war (p = 0,077) (2A-B).
Immunofluoreszenzanalyse beider Proteine ​​eine punkt- Markierungsmuster zeigte die Western-Blot-Ergebnisse unterstützen eine Erhöhung zeigt, MYC und Reduktion in FBXW7 Expression in ACP02-Zellen im Vergleich mit ACP03 (Abbildung 2). Matrigel Invasionsassay Ergebnisse zeigten, dass ACP02 Zellen waren invasiv als ACP03 Zellen (p = 0,001). Migration Assay-Ergebnisse zeigten, dass weniger ACP02 migrierten Zellen im Vergleich mit ACP03-Zellen (p = 0,0028) (2C-D). Abbildung 2 MYC, FBXW7 und p53-Expression, Migration und Invasion Fähigkeit in ACP02 und ACP03. (A) bedeuten Graph zeigen ± SD von MYC, FBXW7 und p53-Proteinexpression in ACP02 und ACP03. Diese Proteine ​​wurden auf das Niveau von Beta-Aktin normalisiert; (B) Repräsentative Daten von MYC, FBXW7 und p53-Protein-Expression; (C-D) Diagramme zeigen Mittelwert ± SD von Migration und invasive Zellen verdreifacht Assay; (E) Repräsentative Ergebnisse von MYC, FBXW7 und p53 Immun
Sowohl ACP02 und ACP03 Zellen vier Gelatinaseaktivität Bands vorgestellt. MMP-9 latent (92 kDa), MMP-9 aktiv (88 kDa), MMP-2 latente ( 72 kDa) und MMP-2 aktiv (66 kDa) (Abbildung 3). Wir fanden keine signifikanten Unterschiede in der MMP-9 latent (p = 0,9788), MMP-2 aktiv (p = 0,7848) und MMP-2 latent (p = 0,1678) zwischen ACP02 und ACP03-Zellen. Jedoch wurden signifikante Unterschiede zwischen ACP02 und ACP03 Zellen gegenüber MMP-9 aktiv (p = 0,0182) gefunden. Abbildung 3 Representative Gelatine-Zymographie Analyse der MMP-2 und MMP-9-Aktivität in ACP02 und ACP03. (A) Bands sowohl latenten und aktiven Formen von MMP-2 und MMP-9 entsprachen, wurden in ACP02 und ACP03 beobachtet. Densitometrische Analysen sind der Bänder latenten und aktiven Formen von MMP-2 entspricht, (B) und MMP-9 (C).
Diskussion
In der aktuellen Studie haben wir festgestellt, dass MYC
mRNA-Expression erhöht wurde in GC-Proben im Vergleich zu nicht-neoplastischen Proben entspricht. Zusätzlich zu unserem Wissen ist dies die erste Studie einen Zusammenhang zwischen erhöhten MYC
mRNA-Expression und das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen und CG Stadium III-IV zu berichten, verstärken die Idee, dass MYC
Deregulierung ein stark Faktor für Malignität in GC.
Adams et al
. [20] und Leder et al.
[21] gezeigt, dass MYC
mRNA Expression Deregulierung der Entwicklung von Krebs in transgenen Mausmodellen fördern können. Der Anstieg der MYC
mRNA-Ebene in menschlichen Krebserkrankungen können entstehen durch direkte und indirekte Mechanismen, die mehrere Erklärungen haben könnte. Zuerst MYC
Amplifikation ist die häufigste Mechanismus der MYC
Deregulierung in GC [5]. Dieser Mechanismus führt zu einer erhöhten Produktion von onkogenen Produkten in Mengen, die die Transkriptionskapazität eines normalen Doppelkopie-Gen nicht überschreiten. Hier beobachteten wir drei oder mehr MYC
Genkopien in 51,5% der Magentumoren Proben. Frühere Studien aus unserer Gruppe zeigte auch, dass MYC
Verstärkung oder Trisomie von Chromosom 8, auf dem MYC
befindet, in allen GC-Proben vorhanden war, von Einzelpersonen in Nordbrasilien geprüft sowie in GC-Zelllinien etabliert durch unsere Gruppe von Tumoren der brasilianischen Patienten [18, 22-27]. Die Anwesenheit von MYC
Amplifikation auch in Plasmaproben von Personen mit GC [28] berichtet. Jedoch wurde in der vorliegenden Studie nachgewiesen kein direkter Zusammenhang zwischen MYC
Kopienzahl Variation und mRNA-Expression.
Zweitens aus konsistente Rekombination zwischen dem Immunglobulin (Ig) Locus der Anstieg der MYC
mRNA-Expression führen und das MYC Onkogen
. Dieses Phänomen wird in Burkitt-Lymphom häufig beschrieben und wird mit einer längeren Halbwertszeit von MYC
mRNA in betroffenen Zellen [29] verbunden. Zuvor beobachtet unsere Forschungsgruppe MYC
Einfügungen in diffusem-Typ GC hauptsächlich in Form von Chromosomen, die Gene von Immunglobulinen (Chromosomen 2, 14 und 22) abgebildet werden [26]. So chromosomalen Translokationen des MYC
Locus beteiligt (8q24) in diffusen Typ CG bei Personen aus Nordbrasilien auch eine Zunahme der MYC
mRNA-Ebene widerspiegeln könnten.
Immunhistochemie (IHC) Analyse ergab, dass MYC Ausdruck häufiger in Darm-Typ GC als diffus-Typ GC Proben gefunden. Diese Veränderungen können zu einem abnormalen MYC Proteins führen, die nicht durch eine der verwendeten Antikörper in der vorliegenden Untersuchung erkannt wird. Darüber hinaus beobachteten wir eine Assoziation zwischen MYC
mRNA-Expression Ebene und MYC-Färbung. Darüber hinaus steuern posttranskritionelle Mechanismen MYC Stabilität [6, 30]. MYC
Deregulierung hat mit dem Verlust von FBXW7
in Verbindung gebracht worden, ein haploinsufficient Tumor-Suppressor-Gen. Im Allgemeinen FBXW7
Verlust kann durch den Verlust der Heterozygotie (LOH) und Mutation [30] ausgelöst werden. Der Verlust bei 4Q, die FBXW7
Locus, ist eine wiederkehrende chromosomale Veränderungen in GC [31, 32], und FBXW7
Mutationen in 3,7-6% der Magentumoren [12] gefunden.
in der vorliegenden Studie beobachteten wir nur eine Kopie des FBXW7
Gens in 45,16% der Magentumoren untersucht. Interessanterweise wird FBXW7
mRNA-Expression in GC-Proben deutlich verringert im Vergleich zu nicht-neoplastischen Gewebe entspricht. Zusätzlich wurde FBXW7
mRNA Expression Deregulierung mit dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen und GC Stadium III-IV verbunden sind, wie auch bei MYC
mRNA beobachtet wurde. Diese Ergebnisse bestätigen die Arbeit von Yokobori el al.
[13], die auch eine Assoziation zwischen reduziert FBXW7
mRNA-Expression und Lymphknotenmetastasen zeigte, die dem malignen Potential von GC-Zellen und führt zu einer schlechten Prognose beiträgt. Außerdem beobachteten wir, dass die Expression von Myc
und FBXW7
mRNA tendenziell umgekehrt in der vorliegenden Studie zu korrelieren.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass MYC
Inaktivierung Tumoren in Tieren unterdrückt, was nahe legt, dass MYC
kann ein molekulares Ziel in der Krebsbehandlung [33-35] sein. Alternativ Soucek et al
. [36] vorgeschlagen, dass FBXW7 könnte "Tumor Dormanz Therapie" erleichtern. Somit kann MYC Abbau durch FBXW7 nicht nur einen Zustand der Tumor Dormanz induzieren, sondern auch eine Antitumorwirkung haben könnte. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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