MYC, FBXW7 y la variación del número de copias TP53 y expresión en gástrico Cancer

MYC, FBXW7 Opiniones y TP53
variación del número de copia y de expresión en el cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

desregulación MYC es un evento común en carcinogénesis gástrica, por lo general, como consecuencia de la amplificación de genes, translocaciones cromosómicas, o mecanismos postraduccionales. FBXW7
es un supresor de tumores p53-controlado que desempeña un papel en la regulación de la salida del ciclo celular y la reentrada a través de la degradación MYC.
Métodos Se evaluaron
MYC
, FBXW7
y TP53
número de copias, los niveles de ARNm y la expresión de proteínas en el cáncer gástrico y pareadas no neoplásicas especímenes procedentes de 33 pacientes y también en líneas celulares de adenocarcinoma gástrico. También se determinó el potencial de invasión de las líneas celulares de cáncer gástrico.
: Resultados de la MYC se observó
amplificación en el 51,5% de las muestras de tumores gástricos. Se observó supresión de una copia de FBXW7 Opiniones y TP53
en el 45,5% y el 21,2% de los tumores gástricos, respectivamente. MYC
expresión mRNA fue significativamente mayor en tumores que en las muestras no neoplásicas. FBXW7 Opiniones y TP53
la expresión de ARNm fue notablemente menor en los tumores que en las muestras pareadas no neoplásicas. Por otra parte, MYC y desregulado
FBXW7
expresión de ARNm se asoció con la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos y el tumor en estadio III-IV. Además, MYC inmunotinción se observó con mayor frecuencia en los de tipo intestinal de tipo difuso cánceres gástricos y se asoció con MYC
la expresión del ARNm. Los estudios in vitro mostraron que el aumento de MYC y la reducción de expresión FBXW7 está asociada con un fenotipo más invasiva en líneas celulares de cáncer gástrico. Este resultado nos animó a investigar la actividad de las gelatinasas MMP-2 y MMP-9 en las dos líneas celulares. Ambos gelatinasas son sintetizados principalmente por las células del estroma en lugar de las células cancerosas, y se ha propuesto que ambos contribuyen a la progresión del cáncer. Se observó un aumento significativo en la actividad de MMP-9 en comparación con ACP02 ACP03 células. Estos resultados confirmaron que las células ACP02 tienen una mayor capacidad de invasión de las células ACP03.
Conclusión
En conclusión, FBXW7 y mRNA MYC pueden jugar un papel en el comportamiento biológico agresivo de células de cáncer gástrico y pueden ser un indicador útil de mal pronóstico. Por otra parte, MYC es un candidato objetivo de nuevas terapias contra el cáncer gástrico.
Palabras clave
El cáncer gástrico MYC FBXW7 TP53 Antecedentes
cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. GC se considera un importante problema de salud pública, especialmente en los países en desarrollo, entre ellos Brasil [2].
Un aspecto fundamental de la carcinogénesis es la proliferación incontrolada de células resultante de la acumulación de cambios que promueven la expresión o represión de genes de control del ciclo celular [3]. MYC
es un factor de transcripción implicado en la regulación del ciclo celular y la detención del crecimiento celular que es comúnmente desregulado en los cánceres y se ha descrito como un elemento clave de la carcinogénesis gástrica [4, 5]. Varios tipos diferentes de modificaciones postraduccionales de MYC se han descrito, incluyendo la fosforilación, acetilación, y ubiquitinación [6]. El sistema de la ubiquitina-proteasoma es la principal vía de regulación de degradación de proteínas implicadas en el control diferenciación celular y el crecimiento [7]. FBXW7
codifica una subunidad de proteína F-box del complejo /F-box Skp1 /Cul1 complejo ligasa (SCF) de la ubiquitina. SCF FBXW7 induce la degradación de los productos de genes reguladores del ciclo celular positivas, como la ciclina E
, MYC
, Notch
, JUN
, a través de la ubiquitinación dependiente de la fosforilación [8]. Entre SCF sustratos FBXW7, MYC es de particular importancia en la salida del ciclo celular, ya que se cree que desempeñan un papel en la determinación de si las células de mamíferos se dividen o no [9].
Liberalizado FBXW7
expresión es una de las principales causas de la carcinogénesis [10-12]. La pérdida de FBXW7
expresión puede conducir a myc y se ha asociado con un mal pronóstico en pacientes con cáncer gástrico [13]. Sin embargo, la activación MYC por FBXW7
pérdida desencadena la activación de p53, que desempeña un papel clave en la regulación de las respuestas celulares a daño del ADN y la expresión anormal de oncogenes. La inducción de la detención del ciclo celular por p53 permite la reparación del ADN o la apoptosis de inducción [14]. Por lo tanto, la pérdida concomitante de FBXW7 Opiniones y TP53
es necesaria para inducir inestabilidad genética y la tumorigénesis [11].
En el presente estudio, se investigó MYC
, FBXW7
y TP53
variación de copias de genes número y el ARNm y la expresión de proteínas en muestras de GC y líneas celulares de adenocarcinoma gástrico. También se evaluaron las posibles asociaciones entre nuestros resultados y las características clínico-patológicos y /o invasión y capacidad de migración de las líneas celulares.
Métodos Muestras clínicas

muestras fueron obtenidas de 33 pacientes con cáncer gástrico que se sometieron a tratamiento quirúrgico en el João hospital de la Universidad de Barros Barreto en el estado de Pará, Brasil. muestras de tejidos no neoplásicos tumores disecados y pareadas se cortaron inmediatamente del estómago y se congelaron en nitrógeno líquido hasta la extracción de RNA. México La clinicopathological características de las muestras de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Las muestras de GC fueron clasificados de acuerdo a Lauren [15] . Todas las muestras de GC mostró la presencia de Helicobacter pylori
, y el factor de virulencia cagA se determinó por análisis de PCR de urea
y cagA
como se describe por Clayton et al
. [16] y Covacci et al.
[17], respectivamente. Todos los pacientes tenían antecedentes negativos de la exposición a la quimioterapia o la radioterapia antes de la cirugía, y no había otros co-ocurrencias de los cánceres diagnosticados. El consentimiento informado con la aprobación del comité de ética de la Universidad Federal de Pará fue obtained.Table 1 MYC, la variación FBXW7 y TP53 número de copias de genes, MYC y proteína p53 expresión y características clínico de 33 pacientes GC
CNV MYC
CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 copias (n = 16) guía empresas ≥ 3 copias (n = 17) guía empresas p-valor
2 copias (n = 18) guía empresas 1 copia (n = 15) guía empresas p-valor
2 copias (n = 25) guía empresas 1 copia (n = 7) guía empresas p - valor
P (n = 19) guía empresas N (n = 14) guía empresas p-valor
P (n = 6)
N (n = 25) guía empresas p-valor
Edad (a) (media ± SD) Hotel > 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2) página 9 página 5 página 6 página 8
10
4 de 10 página 9
2 17
Género
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10 página 12 página 6 página 8
10 página 5 página 13
Histopatología
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6 página 5 página 9
1 página 3 página 8
1 | 10
profundidad de la invasión tumoral
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13 página 14
20 página 6
18 página 9 página 6
21
metástasis de ganglios linfáticos
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10
10
15
4 de 13 página 7 página 5
15
Etapa
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6 página 9 página 11 página 4 página 8 página 7 página 4 página 11
MYC IHC
Negativo página 5 página 8
0,481 página 7 página 6
1.000 página 11
2 0,671
positiva página 11 página 9 página 11 página 9 página 14
5
p53 IHC
negativo página 14 página 12
0,398 página 14 página 12
1.000
21
4 de 0,157
positivo
2 5 página 4 página 3 página 4 página 3
p * Hotel < 0,05; P: positivo; N: negativo.
líneas celulares líneas celulares de adenocarcinoma gástrico
ACP02 y ACP03 [18] fueron cultivadas en medio completo RPMI (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina /estreptomicina y 1% kanamicina.
la variación del número de copias (CNV)
se extrajo el ADN usando un DNAQiamp mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Duplex cuantitativa en tiempo real PCR en tiempo real (qPCR) se realizó utilizando las sondas TaqMan FAM /MGB-etiquetado para MYC gratis (Hs01764918_cn), FBXW7 gratis (Hs01362464_cn), o TP53 gratis (Hs06423639_cn), y marcado con TAMRA VIC /TaqMan CNV ARNasa P
(Ƹ3326) se utilizó para el control interno. Todos en tiempo real qPCR reacciones se realizaron por cuadruplicado con ADNg de acuerdo con el protocolo del fabricante usando un sistema de PCR en tiempo real Fast 7500 (Life Technologies, Foster City, CA, EE.UU.). El número de copias de cada muestra se estimó mediante análisis CNV mediante Copia de llamadas Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, EE.UU.). Se utilizó ADN genómico humano conocido (Promega, Madison, EE.UU.) para la calibración.
cuantitativa en tiempo real PCR transcriptasa inversa
El ARN total se extrajo con el reactivo TRI ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, EE.UU. ) siguiendo las instrucciones del fabricante. concentración de ARN y la calidad se determinaron usando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE.UU.) y 1% geles de agarosa. El ADN complementario (ADNc) se sintetizó usando un kit de cDNA Archivo de gran capacidad de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Life Technologies, Foster City, CA, EE.UU.). En tiempo real qPCR cebadores y sondas TaqMan dirigidos MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7 gratis (Hs00217794_m1) y TP53 gratis (Hs01034249_m1) fueron adquiridos como los productos ensayos-on-Demand para la expresión génica ((Life Technologies, . foster City, CA, EE.UU.) en tiempo real qPCR se realizó utilizando un ABI Prism 7500 sistema (Life Technologies, foster City, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante GAPDH gratis (NM_002046.3;. Life Technology, EE.UU.) fue seleccionado como un control interno para el control de entrada de ARN y revertir la eficiencia de la transcripción. Todo en tiempo real qPCR reacciones para los genes diana y controles internos se realizaron por triplicado en la misma placa. la cuantificación relativa (RQ) de la expresión génica se calculó utilizando la ΔΔCt método de [19], en el que la muestra no neoplásico fue designado como un calibrador para cada muestra de tumor emparejado.
inmunohistoquímica
análisis inmunohistoquímico para MYC y p53 se realizaron en secciones, quirúrgicos embebidos en parafina fijados con formalina. Se utilizaron secciones seriadas de 3 micras. antígeno de recuperación de calor inducido fue empleado (presión controlado por microprocesador Pascal ® Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.). Se utilizó un kit de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa universal (System LSAB, DakoCytomation, Carpinteria, CA, EE.UU.) para la detección con diaminobencidina (DAB) como cromógeno. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra myc (dilución 1: 150; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU. y el clon 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, EE.UU.) , FBXW7 (dilución 1:50, Abnova Corp., la ciudad de Taipei, Taiwán), y p53 (dilución 1:50; Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.). expresión de la proteína positiva se definió como la tinción nuclear clara en más de 10% de las células.
ensayo de migración y la invasión
ensayos de migración y la invasión se llevaron a cabo en una cámara de Boyden modificada con insertos de filtro (8-micras poros) para placas de 12 pocillos (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Para evaluar la invasión, los filtros se recubrieron con 10 l de Matrigel (10-13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.), mientras que en el hielo. Las células (2 × 10 5) se sembraron en la cámara superior en 1 ml de RPMI sin FBS. La cámara inferior se llenó con 1,5 ml de RPMI con FBS. Después de 48 h en cultivo, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído y post-fijaron con 0,2% de cristal violeta en metanol al 20%. Las células en el lado superior del filtro, incluyendo aquellos en el Matrigel, se eliminaron con un hisopo de algodón. células invasoras (en el lado inferior del filtro) se fotografiaron y se contaron. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Inmunofluorescencia
Las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio se fijaron con paraformaldehído al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 min, luego se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) en PBS durante 15 min y se bloquearon con albúmina de suero bovino 1% (BSA) en PBS. Las células se tiñeron con anticuerpos de ratón contra MYC (diluida 1:50; Zymed ®, EE.UU.), p53 (diluido 1:50; Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.), y FBXW7 (diluido 1:50; Abnova Corp ., ciudad de Taipei, Taiwán). Los anticuerpos primarios se revelaron usando un anticuerpo secundario anti-ratón de Alexa-568-conjugado (Invitrogen). Todas las incubaciones se llevaron a cabo durante 60 min a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con DAPI en Prolong anti-fade medio de montaje (Invitrogen). muestras de control negativo se procesaron como se describe anteriormente, excepto que se omitieron los anticuerpos primarios y se reemplazan con PBS solo.
blotting La extracción de proteínas
Western de las células se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos estándar. Brevemente, la proteína total fue extraído de células ACP02 y ACP03 usando tampón mM Tris-HCl 50 que contiene 100 mmol /L de NaCl, mM NaF 50 mM, Navo 1 4, 0.5% NP-40, y completo cóctel inhibidor de proteasa (Roche , Alemania). La concentración de proteína se estimó mediante un ensayo de Bradford (Sigma-Aldrich). Sobre 30 g de extracto de proteína total se cargó en un gel de dodecilsulfato de sodio 12% electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y electroforesis. proteínas resueltas se transfirieron a continuación del gel a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó con 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con Tris que contiene 5% de Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, EE.UU.) y después se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-MYC (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , la ciudad de Taipei, Taiwán), anti-p53 (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.), y anti-β-actina (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, EE.UU.) anticuerpos diluidos 1: 200, 1: 100, 1: 100, y 1: 2000, respectivamente. Posteriormente, las membranas se incubaron con una dilución 1: 5000 de peroxidasa de rábano (HRP) del anticuerpo anti-ratón de oveja conjugado (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada.
Zymography
ACP02 y células ACP03 (5 × 10 4 de cada uno) se sembraron y se dejaron adherir y extender por lo menos durante 8 h. Las células adherentes se lavaron tres veces con PBS, y el medio de cultivo fue reemplazado con medio libre de suero durante 24 h. La actividad de MMP2 y MMP9 en el medio condicionado se evaluó por zimografía. se recogió el medio acondicionado, se concentró (Microcon 30 K, Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) y se resuspendieron en tampón de muestra SDS-PAGE (sin β-mercaptoetanol). Las células restantes se sometieron a lisis y la concentración de proteína se estimó utilizando un ensayo BCA (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Un total de 1 g de proteína de cada medio acondicionado se separó en 10% geles de poliacrilamida que contienen 0,2% de gelatina. Después de la electroforesis, los geles se lavaron en 2,5% de Triton X-100 durante 30 min, después se equilibró en Tris 10 mM (pH 8,0) y se incubaron a 37 ° C durante 16 a 24 h en un tampón de desarrollo que contenía Tris 50 mM (pH 8,0 ), 5 mM CaCl 2, y 0,02% NaN 3. Los geles se tiñeron con 0,2% de Coomassie R250 azul (GE Amersham, Piscataway, NJ, EE.UU.) y destained con 1: solución de ácido /metanol 1 acético. Los experimentos se realizaron por triplicado. zymographic bandas, que son indicativos de la actividad de MMP, se cuantificaron por densitometría de barrido analiza.
estadístico
Se determinó la normalidad de las distribuciones de variables mediante el test de Shapiro-Wilk. Se analizaron las asociaciones entre MYC
, FBXW7
y TP53
variación del número de copia, los niveles de mRNA, expresión de la proteína, características clínico-patológicas, y la invasión celular y la migración capacidad utilizando el chi-cuadrado (χ 2) y prueba de Mann-Whitney. Correlación entre la expresión de los diferentes ARNm diana se determinó mediante la prueba de Spearman, en la que un valor inferior a 0,3 indica una correlación débil, 0,3-0,7 indica una correlación medio, y valores por encima de 0,7 indica una correlación fuerte. Los datos se muestran como la mediana y rango intercuartil; valores de p inferior a 0,05 se consideró significativo.
: Resultados de la muestras de tumor gástrico mostraron amplificación de MYC
y supresión de FBXW7 Opiniones y TP53
Tres o más copias de MYC
se encontraron en 51,5% (17/33) de las células tumorales gástricas. Por el contrario, el 45,5% (15/33) y el 21,2% (7/33) de las células tumorales gástricas contenida sólo una copia del FBXW7 Opiniones y TP53
, respectivamente.
La asociación entre las características clínico-patológicos y MYC
, FBXW7
y TP53
número de copias se resumen en la Tabla 1. Un tumor gástrico que contenía tres copias de TP53
fue excluido del análisis de chi-cuadrado. No se encontró asociación entre la variación del número de copias de los genes estudiados y las características clínico-patológicas.
MYC
expresión mRNA fue mayor en los tumores que en las muestras no tumorales, mientras que FBXW7 Opiniones y TP53
la expresión de ARNm fue menor en el tumor especímenes comentario el nivel de expresión de ARNm
MYC (2,01 ± 1,72 veces el cambio) en muestras de tejido tumoral fue significativamente mayor que en el tejido no neoplásico (p = 0,0002), mientras que el nivel de expresión de FBXW7
ARNm (0,53 ± 0,40 veces el cambio) y TP53
ARNm (0,84 ± 0,55 veces el cambio) en muestras de tejido tumoral fue significativamente menor que en el tejido no neoplásico (p < 0,0001 yp = 0,0011, respectivamente). No se encontró una correlación significativa entre MYC
, FBXW7
y TP53
expresión de ARNm (MYC
/FBXW7
ARNm r = -0.3464, p = 0,0562; MYC
/TP53
ARNm r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7
/TP53
ARNm r = -0.0745, p = 0,4747). Por lo tanto, sólo se detectó una tendencia hacia la correlación entre el aumento de MYC
la expresión de ARNm y una disminución en la expresión de ARNm FBXW7
.
La Tabla 2 resume las asociaciones entre diversas características clinicopatológicas y la RQ de MYC
, FBXW7
y TP53
expresión de mRNA en tumor y no neoplásicas especímenes emparejados. Un aumento en MYC
nivel de ARNm se asoció con la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos (p = 0,016) y GC estadio tumoral III-IV (p = 0,036). Una reducción significativa en FBXW7
nivel de ARNm también se asoció con la metástasis en los ganglios linfáticos presencia (p = 0,015) y tumor en estadio III-IV (p = 0,008) .Tabla 2 MYC, FBXW7 mRNA y TP53 niveles de expresión y clinicopathological factores de 33 pacientes con cáncer gástrico
n (%) guía empresas MYC
p-valor
FBXW7

valor p
TP53
p-valor
La mediana ± IQR
La mediana ± IQR
La mediana ± IQR
Edad (a) (media ± SD) Hotel > 50 (65,3 ± 9,1) página 19 (57,6%)
2,04 ± 1,35
0,8873
0,55 ± 0,37
0,9247
0,86 ± 0,62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2) página 14 (42,4%)
1,44 ± 4,88 0,53 ± 0,50

0,94 ± 1,65
Sexo Masculino

15 (45,5%)
2.01 ± 1.01
0,4065
0,53 ± 0,22
0,6353
0,89 ± 0,58
0,8125
Mujer
18 (54,5%)
1,67 ± 2,03 0,56 ± 0,56

0,87 ± 0,69
Histopatología
intestinal
22 (66,7%)
2,06 ± 0,99 0,3525

0,53 ± 0,16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
Difuso página 11 (33,3%)
1,40 ± 2,32 0,77 ± 0,74

0,94 ± 0,38
profundidad de la invasión tumoral
T1 página 6 (18,2%)
0,89 ± 0,47
0,0857
0,88 ± 0,58
0,0678
0,85 ± 0,15
0,7069
T2-T4
27 (81,8%)
2,08 ± 1,42 0,53 ± 0,43

0,91 ± 0,79
metástasis de ganglios linfáticos
Ausente página 13 (39,4%)
0,98 ± 1,09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0,84 ± 0,44
0,6121
presente
20 (60,6%)
2.10 ± 2.20
0,46 ± 0,38 0,94 ± 0,79

Etapa
I-II
18 (54,5%)
1,39 ± 1,23
0,0362 *
0,57 ± 0,38 0,0380
*
0,83 ± 0,55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2,41 ± 2,79 0,34 ± 0,45

0,96 ± 1,19
MYC IHC
positivo
20 (60,6%)
2,18 ± 1,59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0,81 ± 0,57
0,1372
negativo página 13 (39,4%)
0,89 ± 0,85 0,58 ± 0,53

0.99 ± 0.90
p53 IHC
positivo página 7 (21,2%)
4,25 ± 6,53
0,0891
0,64 ± 0,68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
negativo
26 (78,8%)
2,00 ± 1,44 0,55 ± 0,35

0,87 ± 0,60
p * Hotel < 0,05; IQR:. Rango intercuartil
tinción de proteínas nucleares MYC se asocia con el de tipo intestinal GC
tinción positiva para MYC nuclear y p53 se encontró en el 64,5% (20/31) y 19,4% (6/31) de las muestras de GC , respectivamente (Figura 1). No se encontró positividad para FBXW7. La Tabla 1 resume las características clínico-patológicos y MYC y p53 resultados de inmunotinción. La expresión de MYC fue más frecuente en el tipo intestinal que los de tipo difuso GC (p = 0,007). Por otra parte, MYC inmunotinción se asoció con mayor MYC
nivel de mRNA (p = 0,0022). No se encontró asociación entre la inmunotinción de p53 y las características clínico-patológicas, TP53
número de copias, o TP53
la expresión del ARNm. Figura 1 El análisis inmunohistoquímico de MYC y la expresión de la proteína p53 en GC. (A) inmunotinción MYC negativo en-tipo difuso GC; (B) MYC positividad inmune de tipo intestinal en GC; (C) inmunotinción positiva de p53 en el tipo difuso GC; (D) p53 positividad inmune de tipo intestinal en GC (ampliación × 40).
Comparación de líneas celulares ACP02 y ACP03
Tanto las células ACP02 y ACP03 contenía tres copias
MYC y sólo una copia FBXW7
. El número de copias de TP53
era indeterminado en ambas líneas celulares. En comparación con la expresión de mRNA en células ACP03, ACP02 células expresan un mayor nivel de MYC gratis (1,34 veces) y los niveles más bajos de FBXW7 Opiniones y TP53
ARNm (0.62- y 0,73 veces, respectivamente). Western blot reveló que la expresión de MYC fue significativamente mayor en las células de ACP02 ACP03 células (p = 0,048). Además, la expresión FBXW7 fue significativamente menor en las células que ACP02 ACP03 células (p = 0,049). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en la expresión de p53 entre las líneas celulares (p = 0,077) (Figura 2A-B).
Análisis de inmunofluorescencia de ambas proteínas mostró un patrón puntiforme de etiquetado, apoyando los resultados de la transferencia Western que muestra un aumento de la reducción de MYC y en la expresión en las células FBXW7 ACP02 comparación con ACP03 (Figura 2). los resultados del ensayo de invasión de Matrigel mostraron que las células ACP02 eran más invasivo que ACP03 células (p = 0,001). los resultados del ensayo de migración mostraron que menos células ACP02 migraron en comparación con ACP03 células (p = 0,0028) (Figura 2C-D). Figura 2 MYC, la expresión FBXW7 y p53, la migración y la capacidad de invasión en ACP02 y ACP03. (A) enseñar Gráfica media ± desviación estándar de MYC, FBXW7 y expresión de la proteína p53 en ACP02 y ACP03. Estas proteínas se normalizaron al nivel de actina beta; (B) Los datos representativos de MYC, FBXW7 y la expresión de la proteína p53; (C-D) Los gráficos muestran la media ± SD de la migración y las células invasoras triplica ensayo; (E) Los resultados representativos de MYC, FBXW7 e inmunofluorescencia p53
La Ambos ACP02 y ACP03 células presentados cuatro bandas de actividad gelatinasa: MMP-9. Latente (92 kDa), MMP-9 activa (88 kDa), MMP-2 latente ( 72 kDa), y MMP-2 activa (66 kDa) (Figura 3). No se encontraron diferencias significativas en la MMP-9 latente (p = 0,9788), MMP-2 activa (p = 0,7848), y MMP-2 latente (p = 0,1678) entre las células ACP02 y ACP03. Sin embargo, se encontraron diferencias significativas entre las células ACP02 y ACP03 con respecto a la MMP-9 activa (p = 0,0182). Figura 3 Análisis zimografía de gelatina Representante de MMP-2 y MMP-9 en ACP02 y ACP03. Se cumple (a) Las bandas correspondientes a ambas formas latente y activa de MMP-2 y MMP-9 en ACP02 y ACP03. Los análisis densitométricos son de las bandas correspondientes a las formas latentes y activas de MMP-2 (B) y MMP-9 (C).
Discusión En el presente estudio, se observó que MYC
se aumentó la expresión de ARNm en muestras de GC en comparación con las correspondientes muestras no neoplásicas. Además, a nuestro entender, este es el primer estudio en reportar una asociación entre el aumento de MYC
la expresión del ARNm y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos y CG en estadio III-IV, lo que refuerza la idea de que MYC
desregulación es un fuerte factor de malignidad en GC.
Adams et al
. [20] y Leder et al.
[21] demostraron que la desregulación
MYC expresión del ARNm puede promover el desarrollo de cáncer en modelos de ratones transgénicos. El aumento de MYC
nivel de ARNm en los cánceres humanos puede ser el resultado de ambos mecanismos directos e indirectos, que podrían tener varias explicaciones. En primer lugar, MYC
amplificación es el mecanismo más común de MYC
desregulación en [5] GC. Este mecanismo conduce a una mayor producción de productos oncogénicos en cantidades que exceden la capacidad de la transcripción de un gen normal doble copia. A continuación, se observaron tres o más copias MYC
de genes en el 51,5% de las muestras de tumores gástricos. Estudios previos de nuestro grupo también mostraron que MYC
amplificación o trisomía del cromosoma 8, en el que se encuentra MYC
, estuvo presente en todas las muestras examinadas GC de personas en el norte de Brasil, así como en líneas celulares establecidas por GC nuestro grupo de tumores de pacientes brasileños [18, 22-27]. La presencia de MYC
amplificación también se ha informado en muestras de plasma de individuos con GC [28]. Sin embargo, ninguna asociación directa entre MYC
copiar la variación del número y la expresión de ARNm se detectó en el presente estudio.
En segundo lugar, el aumento de la expresión de ARNm de MYC
pueden resultar de la recombinación consistente entre el locus de inmunoglobulina (Ig) y la MYC
oncogén. Este fenómeno se describe con frecuencia en el linfoma de Burkitt y se asocia con una vida media más larga de MYC
mRNA en las células afectadas [29]. Anteriormente, nuestro grupo de investigación observó MYC
inserciones en de tipo difuso GC principalmente en los cromosomas que se asignan a los genes de inmunoglobulinas (cromosomas 2, 14 y 22) [26]. Por lo tanto, translocaciones cromosómicas que implican el MYC
locus (8q24) de tipo difuso CG en las personas del norte de Brasil también podrían reflejar un aumento en el nivel de ARNm
MYC.
Inmunohistoquímica (IHC) análisis reveló que la expresión de MYC es más frecuentemente encontrado en el tipo intestinal GC de muestras GC-tipo difuso. Estas alteraciones podrían dar lugar a una proteína MYC anormal que no es reconocido por cualquiera de los anticuerpos utilizados en el presente estudio. Por otra parte, se observó una asociación entre MYC
nivel de expresión del ARNm y la tinción MYC. Además, los mecanismos posttranscriptional control de estabilidad MYC [6, 30]. MYC
desregulación se ha asociado con la pérdida de FBXW7
, un gen supresor de tumores haploinsufficient. En general, FBXW7
pérdida puede ser causada por la pérdida de heterozigosidad (LOH) y la mutación [30]. La pérdida en el 4T, el FBXW7
locus, es una alteraciones cromosómicas recurrentes en GC [31, 32], y FBXW7
mutaciones se han encontrado en 3,7-6% de los tumores gástricos [12]. En
el presente estudio, se observó sólo una copia del gen FBXW7
en 45.16% de los tumores gástricos estudiados. Curiosamente, FBXW7
la expresión de ARNm en muestras de GC se reduce notablemente en comparación con el correspondiente tejido no neoplásico. Además, FBXW7
desregulación expresión de ARNm se asoció con la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos y la etapa GC III-IV, como también se observó con MYC
mRNA. Estos resultados corroboran el trabajo de Yokobori et al.
[13], que también mostró una asociación entre la reducción de la expresión de ARNm FBXW7
y metástasis en los ganglios linfáticos que contribuye al potencial maligno de las células de GC y da como resultado un mal pronóstico. Por otra parte, se observó que la expresión de MYC Opiniones y FBXW7
ARNm tendía a estar inversamente relacionada en el presente estudio.
Varios estudios mostraron que MYC
inactivación suprime los tumores en los animales, lo que sugiere que MYC
puede ser una diana molecular en el tratamiento del cáncer [33-35]. Alternativamente, Soucek y col
. [36] propusieron que FBXW7 podría facilitar la "terapia de la latencia del tumor". Por lo tanto, la degradación por MYC FBXW7 no sólo puede inducir un estado de latencia del tumor, pero también podría tener un efecto anti-tumoral. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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