MYC, FBXW7 ja TP53 kopioluvun vaihtelua ja ilmaisun Mahalaukun Cancer

MYC, FBXW7
ja TP53
kopioluvun vaihtelua ja ilmaisun mahasyövän
tiivistelmä
tausta
MYC vapauttaminen on yleinen tapahtuma mahasyövän, yleensä seurauksena geenin monistamisen, kromosomitranslokaation tai posttranslationaalinen mekanismeja. FBXW7
on p53-ohjattu kasvain-vaimennin, joka on rooli säätelyssä solusyklin exit ja paluu kautta MYC hajoamista. Tool Menetelmät
Kartoitimme MYC
, FBXW7
, ja TP53
kopiomäärä, mRNA-tasoja, ja proteiinin ilmentymistä mahasyövän ja pariksi ei-neoplastisia näytteitä 33 potilaista ja myös mahalaukun adenokarsinooman solulinjoja. Olemme myös päättäneet hyökkäyksen mahdollisuudet mahasyövän solulinjoissa.
Tulokset
MYC
vahvistus havaittiin 51,5% mahakasvaimen näytteitä. Poistetaan yksi kopio FBXW7
ja TP53
havaittiin 45,5% ja 21,2% mahalaukun kasvaimet, vastaavasti. MYC
mRNA-ekspressio oli merkittävästi suurempi kasvaimia kuin ei-neoplastisia näytteitä. FBXW7
ja TP53
mRNA ilmentyminen oli selvästi vähemmän kasvaimia kuin pariksi ei-neoplastisia yksilöitä. Lisäksi vapautettu MYC
ja FBXW7
mRNA ilmentyminen liittyi läsnäolo imusolmuke etäpesäke ja kasvaimen vaiheen III-IV. Lisäksi MYC immunovärjäytyminen havaittiin useammin suolen-tyypin kuin diffuusi-tyypin syöpien ja liittyi MYC
mRNA ilmaisun. In vitro tutkimukset osoittivat, että lisääntynyt MYC ja vähentää FBXW7 ilmentyminen liittyy enemmän invasiivisen fenotyypin mahasyövässä solulinjoissa. Tämä tulos kannusti meitä aktiivisuuden tutkimiseksi gelatinaasien MMP-2 ja MMP-9 molemmissa solulinjoissa. Molemmat gelatinaasit syntetisoidaan pääasiassa stroomasolut sijaan syöpäsoluja, ja on ehdotettu, että molemmat edistävät syövän etenemisessä. Havaitsimme merkittävän kasvun MMP-9: n aktiivisuutta ACP02 verrattuna ACP03 soluihin. Nämä tulokset vahvistivat, että ACP02 soluissa on suurempi hyökkäyksen valmiudet kuin ACP03 soluja.
Päätelmä
Johtopäätöksenä FBXW7 ja MYC mRNA voi olla rooli aggressiivinen biologinen käyttäytyminen mahasyövän solujen ja saattaa olla hyödyllinen indikaattori huonoon ennusteeseen. Lisäksi MYC on ehdolla tavoite uusia hoitoja vastaan ​​mahasyövässä.
Avainsanat
Mahasyöpää MYC FBXW7 TP53 Background
Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. GC pidetään merkittävä kansanterveydellinen huolenaihe, erityisesti kehitysmaissa, kuten Brasiliassa [2].
Perusolemukseen syövän on hallitsematon solujen lisääntymistä johtuvat kertyminen muutoksia, jotka edistävät ilmentymistä tai tukahduttaminen solusyklin-ohjaus geenien [3]. MYC
on transkriptiotekijä osallistuu solukierron säätelyssä ja solujen kasvun pysähtymisen, joka on yleisesti vapautettu syövät ja on kuvattu keskeisenä osana mahasyövän [4, 5]. Useita erilaisia ​​translaation jälkeisiä modifikaatioita MYC on kuvattu, mukaan lukien fosforylaatio, asetylaatio, ja ubikitinaatio [6]. Ubikitiinipromoottori-proteasomin järjestelmä on tärkeä proteiinien hajoamista sääntelyyn reitin osallistuvat solujen erilaistumiseen ja kasvuun valvonta [7]. FBXW7
koodaa F-box-proteiinin alayksikköä Skp1 /Cul1 /F-box kompleksi (SCF) ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen. SCF FBXW7 indusoi hajoamisen tuotteiden positiivisen solusyklin säätelygeenien, kuten sykliini E
, MYC
, NOTCH
, ja kesäkuu
kautta fosforylaatio riippuva ubikinaa- [8]. Niistä SCF FBXW7 alustoille, MYC on erityisen tärkeää solusyklin poistua koska sen ajatellaan olevan rooli päätettäessä nisäkkäiden solujen jakautuessa tai [9].
Vapautettiin FBXW7
ilme on suurin syy syövän [10-12]. Menetys FBXW7
ilmaisun voi johtaa MYC yli-ilmentymisen ja on yhteydessä huonoon ennusteeseen GC potilailla [13]. Kuitenkin MYC aktivaatio FBXW7
menetys laukaisee aktivoituminen p53, jolla on keskeinen rooli sääntelyn soluvasteiden DNA-vaurioita ja epänormaali ilmentyminen onkogeenien. Solusyklin pidättäneet p53 mahdollistaa DNA: n korjaukseen tai apoptoosin [14]. Siten samanaikainen menetys FBXW7
ja TP53
on tarpeen aiheuttaa geneettinen epävakaus ja kasvaimen kehittymisen [11].
Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet MYC
, FBXW7
, ja TP53
geenikopiomäärä vaihtelua ja mRNA- ja proteiinin ilmentyminen in GC näytteiden ja mahalaukun adenokarsinooman solulinjoja. Mahdolliset assosiaatiot havaintomme ja kliinis-ja /tai hyökkäyksen ja migraatiokykyä solulinjoista arvioitiin myös. Tool Menetelmät
Kliiniset näytteet
Näytteet saatiin 33 GC potilailla, joille tehtiin kirurginen hoito on João de Barros Barreto yliopistosairaala Pará valtiossa Brasiliassa. Dissected kasvain ja pariksi ei-kasvainkudoksessa näytteet leikattiin välittömästi vatsaan ja jäädytettiin nestemäisessä typessä, kunnes RNA.
Kliinis-potilaan näytteet on esitetty taulukossa 1. GC näytteet luokitellaan Lauren [15] . Kaikki GC näytteet osoittivat läsnäolon Helicobacter pylori
, ja Caga virulenssitekijäksi määritettiin PCR-analyysillä urean
ja Caga
kuten ovat kuvanneet Clayton et al
. [16] ja Covacci et ai.
[17], vastaavasti. Kaikilla potilailla oli negatiivinen historiaa altistumisen joko kemoterapian tai sädehoidon ennen leikkausta, ja ei ollut muita yhteistyössä esiintymiä diagnosoitu syöpiä. Tietoon perustuva suostumus luvalla eettisen komitean liittovaltion yliopiston Pará oli obtained.Table 1 MYC, FBXW7 ja TP53-geenin kopioluvun vaihtelu, MYC ja p53-proteiinin ilmentymisen ja kliinis-33 GC potilaiden
CNV MYC

CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 kappaletta (n = 16)
≥ 3 kopiota (n = 17)
p arvo
2: sta (n = 18)
1 kappale (n = 15)
p arvo
2: sta (n = 25)
1 kappale (n = 7)
p - arvo
P (n = 19)
N (n = 14)
p arvo
P (n = 6)
N (n = 25)
p arvo
Ikä (y) (keskiarvo ± SD) B > 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2) B-9
5
6
8
10
4
10
9
2
17
Sukupuoli
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10
12
6
8
10
5
13
Histopatoloqia
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9
1
3
8
1
10
syvyys kasvaimen invaasio
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
Imusolmuke etäpesäke
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10
10
15
4
13
7
5
15
Stage
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11
4
8
7
4
11
MYC IHC
Negatiivinen
5
8
0,481
7
6
1,000
11
2
0,671
Positiivinen
11
9
11
9
14
5
p53 IHC
Negative
14
12
0,398
14
12
1,000
21
4
0,157
positiivinen
2
5
4
3
4
3
* p
< 0,05; P: positiivinen; N: negatiivinen.
Cells linjat
Mahalaukun adenokarsinooma solulinjoja ACP02 ja ACP03 [18] viljeltiin täydellisessä RPMI (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 1% kanamysiini.
Kopioi numero vaihtelu (CNV) B DNA uutettiin käyttämällä DNAQiamp mini (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Duplex kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (real-time qPCR) suoritettiin käyttäen FAM /MGB-leimattua TaqMan-koettimia MYC
(Hs01764918_cn), FBXW7
(Hs01362464_cn), tai TP53
(Hs06423639_cn), ja VIC /TAMRA-leimatun TaqMan CNV RNaasia P
(Ƹ3326) käytettiin sisäisen valvonnan. Kaikki reaaliaikaiset qPCR reaktiot suoritettiin neljänä rinnakkaisena kanssa gDNA mukaan valmistajan protokollan avulla 7500 Fast Real-Time PCR-järjestelmän (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Kopioluku kunkin näytteen arvioitiin CNV analyysi käyttämällä Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Tunnettu ihmisen genomista DNA: ta (Promega, Madison, USA) käytettiin kalibrointiin.
Kvantitatiivinen reaaliaikainen käänteistranskriptaasi-PCR
Kokonais-RNA uutettiin TRI Reagent ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, USA ) seuraten valmistajan ohjeita. RNA-pitoisuus ja laatu määritettiin käyttämällä NanoDrop spektrofotometrillä (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) ja 1% agaroosigeeleillä. Täydentävä DNA (cDNA) syntetisoitiin käyttäen High-Capacity cDNA Archive Kit mukaan valmistajan suositusten (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Reaaliaikainen qPCR alukkeita ja Taqman kohdistaminen MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7
(Hs00217794_m1), ja TP53
(Hs01034249_m1) ostettiin määritykset-on-Demand Tuotteet Gene Expression ((Life Technologies, Foster City, CA, USA). Reaaliaikainen qPCR suoritettiin käyttäen ABI Prism 7500 järjestelmän (Life Technologies, Foster City, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. GAPDH
(NM_002046.3; Life Technology, USA) valittiin sisäisenä kontrollina seurantaan RNA tulon ja käänteinen transkriptio tehokkuutta. Kaikkien reaaliaikaisia ​​qPCR reaktioita kohdegeenien ja sisäiset kontrollit tehtiin kolmena rinnakkaisena samalla levyllä. suhteellinen kvantifiointi (RQ) geenin ilmentymisen laskettiin ΔΔCt menetelmä [19], jossa ei-neoplastisia näyte nimettiin kalibraattori kullekin pareittain kasvainnäyte.
immunohistokemia
immunohistokemiallinen analyysit MYC ja p53 tehtiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kirurgisen osissa. Serial 3-um: n leikkeitä käytettiin. Lämmön aiheuttama antigeeni haku käytettiin (mikroprosessoriohjattu paine Pascal ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Universaali peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kit (LSAB System, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) käytettiin havaitsemiseen diaminobentsidiinillä (DAB) kromogeenina. Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: hiiren monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja MYC (laimennus 1: 150, sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ja kloonata 9E10 Zymedin ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (laimennus 1:50, Abnova Corp., Taipei, Taiwan), ja p53 (laimennus 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Positiivinen -proteiiniekspressio määriteltiin selkeät tumavärjäystä yli 10% soluista.
Muuttoliike ja invaasiomääritys
Muuttoliike ja invaasio määritykset suoritettiin modifioidulla Boyden kammio suodatin insertit (8 um huokosia) varten 12-kuoppaisille levyille (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Arvioida invaasio, suodattimet päällystettiin 10 ui matrigeelin (10-13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) jäissä pitäen. Solut (2 x 10 5) maljattiin saliin 1 ml RPMI ilman FBS. Alempi kammio täytettiin 1,5 ml: lla RPMI kanssa FBS: ää. 48 tunnin kuluttua viljelmässä, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja post-kiinteä 0,2% kristalliviolettia 20% metanolia. Solujen yläpuolella suodattimen, mukaan lukien Matrigel, poistettiin pumpulipuikolla. Tunkeutuvat solut (alemmalla puolella suodatin) valokuvattiin ja laskettiin. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.
Immunofluoresenssi
Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyjä kiinnitettiin 1% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 10 minuutin ajan, sitten läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) PBS: ssä 15 minuutin ajan ja blokattiin 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) PBS: ssä. Solut värjättiin hiiren vasta-aineita MYC (laimennettu 1:50; Zymedin ®, USA), p53 (laimennettu 1:50; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), ja FBXW7 (laimennettu 1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Taiwan). Ensisijainen vasta-aineet paljastettiin käyttäen anti-hiiri-Alexa-568-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Invitrogen). Kaikki inkuboinnit suoritettiin 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tumat värjättiin DAPI in Prolong antihäipyminen kiinnitysväliaine (Invitrogen). Negatiivinen kontrolli näytteitä käsiteltiin, kuten edellä on kuvattu paitsi, että ensisijainen vasta-aineet jätettiin pois ja korvattiin PBS: llä yksinään.
Western blotting
Proteiinin uutto soluista suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Lyhyesti, kokonais-proteiini uutettiin ACP02 ja ACP03-soluihin käyttäen 50 mM Tris-HCl-puskuria, joka sisälsi 100 mmol /l NaCI: a, 50 mM NaF, 1 mM NAvó 4, 0,5% NP-40, ja täydellinen proteaasiestäjäseostabletit (Roche , Saksa). Proteiinipitoisuus arvioitiin käyttäen Bradfordin määritystä (Sigma-Aldrich). Noin 30 ug kokonais-proteiinin uute ladattiin 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) geelillä ja elektroforeesi. Erotetut proteiinit siirrettiin sitten geelistä nitroselluloosakalvolle. Membraani blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 5% Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) ja sitten inkuboitiin hiiren monoklonaalisten anti-MYC (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei, Taiwan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), ja anti-β-aktiini (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) vasta-aineet laimennettiin 1: 200, 1: 100, 1: 100, ja 1: 2000, vastaavasti. Tämän jälkeen membraaneja inkuboitiin 1: 5000 laimennos piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua lampaan anti-hiiri-vasta-ainetta (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiinit visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi.
Zymografia
ACP02 ja ACP03 soluja (5 x 10 4 kumpaakin) maljattiin ja annettiin kiinnittyä ja levitä vähintään 8 tuntia. Kiinnittyneet solut pestiin kolme kertaa PBS: llä, ja elatusaine korvattiin seerumittomalla alustalla 24 tuntia. Aktiivisuus MMP2 ja MMP9 että elatusaine arvioitiin tsymografialla. Elatusaine kerätään talteen, konsentroidaan (Microcon 30 K, Merck Millipore, Darmstadt, Saksa) ja suspendoitiin uudelleen SDS-PAGE-näytepuskuria (ilman β-merkaptoetanolia). Jäljellä olevat solut hajotettiin ja proteiinipitoisuus arvioitiin käyttäen BCA-määritystä (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Yhteensä 1 ug proteiinia kustakin elatusaine erotettiin 10% polyakryyliamidigeeleillä, joka sisälsi 0,2% gelatiinia. Elektroforeesin jälkeen geelit pestiin 2,5% Triton X-100: ssa 30 min, sitten tasapainotettu 10 mM Tris (pH 8,0) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 16-24 tunnin ajan kehitykseen, joka sisälsi 50 mM Tris (pH 8,0 ), 5 mM CaCI 2, ja 0,02% NaN 3. Geelit värjättiin 0,2% Coomassie Blue R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) ja väri poistettiin 1: 1 etikkahappo /metanoli liuosta. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tsymografisen bändejä, jotka ilmentävät MMP toimintaa, kvantitoitiin skannausdensitometrialla.
Tilastolliset analyysit
normaaliuden muuttujan jakaumat määritettiin käyttämällä Shapiro-Wilk testi. Associations välillä MYC
, FBXW7
, ja TP53
kopioluvun vaihtelu, mRNA-tasot, proteiinin ilmentyminen, kliinis-, ja solujen invaasiota ja migraatiokykyä analysoitiin käyttäen chi-neliö (χ 2) ja Mann-Whitney-testit. Korrelaatio ilmentyminen eri kohde-mRNA: määritettiin käyttäen Spearmanin testiä, jossa arvo alle 0,3 osoitti heikko korrelaatio, 0,3-0,7 osoitti keskipitkän korrelaatio, ja arvot yli 0,7 osoitti vahva korrelaatio. Data näytetään mediaani ja kvartiilivälin pituus; p-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.
Tulokset
Mahalaukun Tuumorinäytteet antoi monistuksen MYC
ja poistetaan FBXW7
ja TP53
Kolme tai useampia kopioita MYC
havaittiin 51,5% (17/33) mahalaukun syöpäsoluja. Sen sijaan, 45,5% (15/33) ja 21,2% (7/33) mahalaukun tuumorisolujen sisälsi vain yhden kopion FBXW7
ja TP53
, vastaavasti.
Välinen yhteys kliinis ja MYC
, FBXW7
, ja TP53
kopioluvun on yhteenveto taulukossa 1. Yksi mahakasvaimen joka sisälsi kolme kopiota TP53
jätettiin chi-neliö analyysi. Ei assosioitunut kopioluvun vaihtelu geenien tutkittu ja kliinis.
MYC
mRNA ilmaisu oli suurempi kasvaimia kuin ei-neoplastisia yksilöitä, kun taas FBXW7
ja TP53
mRNA-ekspressio oli alhaisempi kasvaimen yksilöt
ilmentymisen taso MYC
mRNA (2,01 ± 1,72 kertainen muutos) kasvainkudoksessa näytteissä oli merkittävästi suurempi kuin ei-kasvainkudoksessa (p = 0,0002), kun taas ilmentymistaso FBXW7
mRNA (0,53 ± 0,40 kertainen muutos) ja TP53
mRNA (0,84 ± 0,55 kertainen muutos) kasvaimen kudosnäytteiden oli merkittävästi alhaisempi kuin ei-kasvainkudoksessa (p < 0,0001 ja p = 0,0011, vastaavasti). Emme löydä merkittävä korrelaatio MYC
, FBXW7
, ja TP53
mRNA: n ilmentymisen (MYC
/FBXW7
mRNA r = -0,3464, p = 0,0562; MYC Twitter /TP53
mRNA r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7
/TP53
mRNA r = -0,0745, p = 0,4747). Näin ollen vain taipumusta korrelaatio kasvu MYC
mRNA: n ilmentymisen ja lasku FBXW7
mRNA: n ekspressio havaittiin.
Taulukossa 2 esitetään yhteenveto yhdistysten eri kliinis ja RQ MYC
, FBXW7
, ja TP53
mRNA: n ilmentymisen kasvaimen ja pariksi ei-neoplastisia yksilöitä. Nostamalla MYC
mRNA tasolla liittyi läsnäolo imusolmuke etäpesäke (p = 0,016) ja GC kasvain vaiheen III-IV (p = 0,036). Merkittävä väheneminen FBXW7
mRNA tasolla liittyi myös läsnä imusolmuke etäpesäke (p = 0,015) ja kasvaimen vaiheen III-IV (p = 0,008) .table 2 MYC, FBXW7 ja TP53 mRNA ekspressiotasot ja kliinis tekijät 33 mahasyöpäpotilaista
n (%)
MYC
p arvo
FBXW7

p arvo
TP53
p arvo
mediaani ± IQR
mediaani ± IQR
mediaani ± IQR
Ikä (y) (keskiarvo ± SD) B > 50 (65,3 ± 9,1)
19 (57,6%) B 2,04 ± 1,35
0,8873
0,55 ± 0,37
0,9247
0,86 ± 0,62
0,7409
≤50 (42,1 ± 8,2)
14 (42,4%)
1,44 ± 4,88
0,53 ± 0,50
0,94 ± 1,65
Sukupuoli
Mies
15 (45,5%)
2,01 ± 1,01
0,4065
0,53 ± 0,22
0,6353
0,89 ± 0,58
0,8125
Female
18 (54,5%) B 1,67 ± 2,03
0,56 ± 0,56
0,87 ± 0,69
histopatologia
Suoliston
22 (66,7%) B 2,06 ± 0,99
0,3525
0,53 ± 0,16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
Diffuusi
11 (33,3%)
1,40 ± 2,32
0,77 ± 0,74
0,94 ± 0,38
syvyys kasvaimen invaasion
T1
6 (18,2%) B 0,89 ± 0,47
0,0857
0,88 ± 0,58
0,0678
0,85 ± 0,15
0,7069
T2-T4
27 (81,8%)
2,08 ± 1,42
0,53 ± 0,43
0,91 ± 0,79
Imusolmuke etäpesäke
Absent
13 (39,4%)
0,98 ± 1,09
0,0225 *
0,68 ± 0,36
0,0238 *
0,84 ± 0,44
0,6121
Esitä
20 (60,6%) B 2,10 ± 2,20
0,46 ± 0,38
0,94 ± 0,79
Stage
I-II
18 (54,5%) B 1,39 ± 1,23
0,0362 *
0,57 ± 0,38
0,0380 *
0,83 ± 0,55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2,41 ± 2,79
0,34 ± 0,45
0,96 ± 1,19
MYC IHC
Positiivinen
20 (60,6%)
2,18 ± 1,59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0,81 ± 0,57
0,1372
Negatiivinen
13 (39,4%) B 0,89 ± 0,85
0,58 ± 0,53
0,99 ± 0,90
p53 IHC
Positiivinen
7 (21,2%) B 4,25 ± 6,53
0,0891
0,64 ± 0,68
0,9203
1,06 ± 0,83
0,2937
Negatiivinen
26 (78,8%) B 2,00 ± 1,44
0,55 ± 0,35
0,87 ± 0,60
* p
< 0,05; IQR: kvartiiliväliä.
Nuclear MYC proteiinivärjäys liittyy suoliston-tyypin GC
Positiivinen värjäytyminen ydin- MYC ja p53 todettiin 64,5% (20/31) ja 19,4% (6/31) GC näytteiden , vastaavasti (kuvio 1). Ei positiivisuus ei löytynyt FBXW7. Taulukossa 1 esitetään yhteenveto kliinis ja MYC ja p53 immunovärjäyksen tuloksia. Expression of MYC oli yleisempää suoliston-tyypin kuin diffuusi-tyyppinen GC (p = 0,007). Lisäksi MYC immunovärjäys liittyi lisääntynyt MYC
mRNA tasolla (p = 0,0022). Ei havaittu yhteyttä välillä p53 immunovärjäyksen ja kliinis ominaisuudet, TP53
kopiomäärän tai TP53
mRNA ilmaisun. Kuva 1 immunohistokemiallinen analyysi MYC ja p53-proteiinin ilmentymistä GC. (A) Negatiivinen MYC immunovärjääminen diffuusi-tyypin GC; (B) MYC immuuni positiivisuus suolen-tyypin GC; (C) Positiivinen p53 immunovärjääminen diffuusi-tyypin GC; (D) p53 immuuni positiivisuus suolen-tyypin GC (suurennus x 40).
Vertailu ACP02 ja ACP03 solulinjoissa
Sekä ACP02 ja ACP03 solujen sisälsi kolme MYC
kappaleena ja vain yksi FBXW7
kopio . Määrä TP53
kopioita oli määrittelemätön molemmissa solulinjoissa. Verrattuna mRNA: n ekspression ACP03 soluissa, ACP02 solut ilmensivät korkeampi MYC
(1,34-kertainen) ja alhaisempi FBXW7
ja TP53
mRNA (0.62- ja 0,73-kertaiseksi).
Western blot-analyysit paljastivat, että MYC: n ilmentyminen oli merkittävästi korkeampi ACP02 soluja kuin ACP03 solujen (p = 0,048). Lisäksi FBXW7 ilme oli merkitsevästi pienempi ACP02 soluja kuin ACP03 solut (p = 0,049). Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa p53 ilmentymisen välillä solulinjojen (p = 0,077) (kuvio 2A-B).
Immunofluoresenssianalyysi sekä proteiinien osoitti pistemäinen kuvio merkintöjä, tukevat Western blot tulokset osoittavat kasvua MYC ja vähentäminen FBXW7 ilmentymisen ACP02 soluissa verrattuna ACP03 (kuva 2). Matrigel invaasiomääritys tulokset osoittivat, että ACP02 solut olivat enemmän invasiivisia kuin ACP03 solujen (p = 0,001). Migration määrityksen tulokset osoittivat, että vähemmän ACP02 vaeltaneet solut verrattuna ACP03 solujen (p = 0,0028) (kuvio 2C-D). Kuvio 2 MYC, FBXW7 ja p53 ilmaisun, muuttoliike ja invaasio kyky ACP02 ja ACP03. (A) Kaavio näyttää keskiarvo ± SD MYC, FBXW7 ja p53-proteiinin ilmentymistä ACP02 ja ACP03. Nämä proteiinit normalisoitiin tasoon beta aktiini; (B) edustaja data MYC, FBXW7 ja p53-proteiinin ilmentymisen; (C-D) Kuvaajat osoittavat keskiarvo ± SD maahanmuutto- ja invasiivisia soluja kolmen rinnakkaisen määrityksen; (E) edustaja tulokset MYC, FBXW7 ja p53 immunofluoresenssilla.
Sekä ACP02 ja ACP03 solujen esitti neljä gelatinaasiaktiivisuutta bändejä: MMP-9 piilevä (92 kDa), MMP-9 aktiivinen (88 kDa), MMP-2 piilevä ( 72 kDa), ja MMP-2 aktiivinen (66 kDa) (kuvio 3). Emme ei havaittu huomattavia eroja MMP-9 piilevä (p = 0,9788), MMP-2 aktiivinen (p = 0,7848), ja MMP-2 piilevä (p = 0,1678) välillä ACP02 ja ACP03 soluja. Kuitenkin havaittu merkitseviä eroja välillä ACP02 ja ACP03 solujen suhteen MMP-9 aktiivinen (p = 0,0182). Kuva 3 Edustavia gelatiinitsymografialla analyysi MMP-2 ja MMP-9: n aktiivisuutta ACP02 ja ACP03. (A) nauhat, jotka vastaavat sekä piilevän ja aktiivisten muotojen MMP-2 ja MMP-9 havaittiin ACP02 ja ACP03. Densitomet- analyysit ovat vastaavat vyöhykkeet piilevänä, ja aktiiviset muodot MMP-2 (B) ja MMP-9 (C).
Keskustelu
Nykyisessä tutkimuksessa havaitsimme, että MYC
mRNA ekspressio lisääntyi GC näytteissä verrattuna vastaaviin ei-neoplastisia näytteitä. Lisäksi tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus raportoi yhdistyksen välillä lisääntynyt MYC
mRNA ilmaisu ja läsnäolo imusolmuke etäpesäke ja CG III-IV, vahvistavat ajatusta, että MYC
vapauttaminen on vahva tekijä syöpään GC.
Adams et al
. [20] ja Leder et al.
[21] osoitti, että MYC
mRNA ilmaisun vapauttaminen voi edistää syövän siirtogeenisen hiiren mallia. Kasvu MYC
mRNA tasolla ihmisen syövissä voi johtua sekä suoria että epäsuoria mekanismeja, joilla voisi olla useita selityksiä. Ensinnäkin, MYC
vahvistus on yleisin mekanismi MYC
sääntelyn purkamisen GC [5]. Tämä mekanismi johtaa lisääntyneeseen tuotantoon onkogeenisten tuotteiden määriä, jotka ylittävät transkription kapasiteetin normaali kaksinkertainen kopio geenistä. Täällä, havaitsimme kolme tai useampia MYC
geenin kopioita 51,5% mahalaukun kasvaimet yksilöitä. Aiemmat tutkimukset ryhmämme osoitti myös, että MYC
vahvistus tai trisomia kromosomin 8, johon MYC
sijaitsee, oli läsnä kaikissa GC tutkituista yksilöistä Pohjois Brasiliassa, sekä GC solulinjoissa perustetun ryhmämme kasvaimista Brasilian potilaiden [18, 22-27]. Läsnäolo MYC
vahvistus on myös raportoitu plasmanäytteistä yksilöiden GC [28]. Ei kuitenkaan ole suoraa yhteyttä MYC
kopioluvun vaihtelua ja mRNA: n ilmentymistä havaittiin tässä tutkimuksessa.
Toiseksi kasvu MYC
mRNA: n ekspressio voi johtua yhdenmukainen välisen rekombinaation immunoglobuliinin (Ig) lokuksen ja MYC
onkogeeni. Tämä ilmiö on kuvattu usein Burkittin lymfooma ja liittyy pitempi puoliintumisaika MYC
mRNA: n vaikuttaa soluihin [29]. Aiemmin meidän tutkimusryhmä havaittu MYC
insertioita diffuusi-tyyppinen GC lähinnä kromosomeihin että kartoitetaan geenejä immunoglobuliineja (kromosomien 2, 14, ja 22) [26]. Siten kromosomitranslokaation johon MYC
lokus (8q24) heikossa-tyyppinen CG henkilöillä Pohjois Brasilia voisi myös vastaamaan lisäystä MYC
mRNA-tasolla.
Immunohistokemia (IHC) analyysi paljasti, että MYC ilmaisu on useammin löytyy suoliston-tyyppinen GC kuin diffuusi-tyyppinen GC yksilöitä. Nämä muutokset voivat johtaa epänormaaliin MYC-proteiinia, joka ei tunnista kumpaakaan vasta käytetään esillä olevassa tutkimuksessa. Lisäksi havaitsimme yhdistyksen välillä MYC
mRNA ilmaisun taso ja MYC värjäystä. Lisäksi posttranskriptionaalisella mekanismit valvomiseksi MYC vakautta [6, 30]. MYC
vapauttaminen on liittynyt menetys FBXW7
, joka on haploinsufficient tuumorisuppressorigeeniä. Yleensä FBXW7
menetys voi johtua heterotsygoottisuuden menetys (LOH) ja mutaatio [30]. Menetys on 4q, The FBXW7
lokuksen, on toistuva kromosomaalisia muutoksia GC [31, 32], ja FBXW7
mutaatioita on havaittu 3,7-6% mahalaukun kasvaimet [12].
In Tässä tutkimuksessa havaitsimme vain yksi kopio FBXW7
geenin 45,16% mahalaukun kasvaimet tutkittu. Mielenkiintoista, FBXW7
mRNA: n ekspression GC näytteiden merkittävästi vähentynyt verrattuna vastaaviin ei-kasvainkudoksessa. Lisäksi FBXW7
mRNA ilmaisun vapauttaminen liittyi läsnäolo imusolmuke etäpesäke ja GC III-IV, kuten havaittiin myös MYC
mRNA. Nämä havainnot vahvistavat työn Yokobori el al.
[13], joka osoitti myös, välisestä assosiaatiosta vähentää FBXW7
mRNA: n ilmentymisen ja imusolmukkeen etäpesäke, joka edistää pahanlaatuista potentiaalia GC soluja ja johtaa huonoon ennusteeseen. Lisäksi havaitsimme, että ilmaus MYC
ja FBXW7
mRNA yleensä korreloivan käänteisesti tässä tutkimuksessa.
Useat tutkimukset osoittivat, että MYC
inaktivointi estää kasvaimia eläimissä, mikä viittaa siihen, että MYC
voi olla molekyylikohteessa syövän hoidossa [33-35]. Vaihtoehtoisesti Soucek ym
. [36] ehdotetaan, että FBXW7 saattaisi helpottaa "kasvain lepotilamuotoja terapia". Näin ollen, MYC hajoamiselle FBXW7 voi paitsi aiheuttaa tilan kasvaimen lepotilaan, mutta voisi myös olla anti-kasvain vaikutus. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Helikobakteeri-infektio ja kiertävän greliinin tasoilla - systemaattinen katsaus
• "Fast track" kuntoutus jälkeen mahasyövän resektion: kokemusta 80 peräkkäisen tapauksissa