MYC, FBXW7 e TP53 copiare il numero di variazione e di espressione nel cancro gastrico

MYC, FBXW7
e TP53
copiare il numero di variazione e di espressione nel cancro gastrico
Abstract
sfondo
MYC deregolamentazione è un evento comune nella carcinogenesi gastrica, di solito come conseguenza di amplificazione genica, traslocazioni cromosomiche , o meccanismi post-traduzionali. FBXW7
è un tumore-soppressore p53-controllato, che svolge un ruolo nella regolazione del ciclo cellulare uscita e rientro via degrado MYC.
Metodi
abbiamo valutato MYC
, FBXW7
, e TP53
numero di copie, i livelli di mRNA e l'espressione della proteina nel cancro gastrico e accoppiati campioni non neoplastiche da 33 pazienti e anche in linee cellulari di adenocarcinoma gastrico. Abbiamo anche determinato la potenziale invasione delle linee di cellule di cancro gastrico
. Risultati
MYC amplificazione è stata osservata nel 51,5% dei campioni di tumore gastrico. La cancellazione di una copia di FBXW7
e TP53
è stata osservata nel 45,5% e il 21,2% dei tumori gastrici, rispettivamente. MYC
espressione di mRNA era significativamente più alta nei tumori che nei campioni non neoplastiche. FBXW7
e TP53
espressione di mRNA era nettamente inferiore nei tumori rispetto ai campioni non neoplastiche appaiati. Inoltre, deregolamentato MYC
e FBXW7
espressione di mRNA è stato associato con la presenza di metastasi linfonodali e del tumore in stadio III-IV. Inoltre, MYC immunostaining era più frequente negli intestinale-tipo di diffuso tipo di cancro gastrico ed è stata associata con MYC
espressione di mRNA. Studi in vitro hanno dimostrato che l'aumento MYC e ridotta espressione FBXW7 è associato ad un fenotipo più invasiva in linee cellulari di cancro gastrico. Questo risultato ci ha incoraggiato a studiare l'attività delle gelatinasi MMP-2 e MMP-9 in entrambe le linee cellulari. Entrambe le gelatinasi sono sintetizzati principalmente dalle cellule stromali, piuttosto che le cellule tumorali, ed è stato proposto che entrambi contribuiscono alla progressione del cancro. Abbiamo osservato un aumento significativo MMP-9 attività ACP02 rispetto ACP03 cellule. Questi risultati hanno confermato che le cellule ACP02 hanno una maggiore capacità di invasione delle cellule ACP03.
Conclusione
In conclusione, FBXW7 e MYC mRNA può giocare un ruolo nel comportamento biologico aggressivo delle cellule di cancro gastrico e può essere un utile indicatore di prognosi infausta. Inoltre, MYC è un bersaglio candidato per nuove terapie contro il cancro gastrico.
Parole
cancro gastrico MYC FBXW7 TP53 Sfondo
cancro gastrico (GC) è il quarto cancro più comune e la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo [1]. GC è considerata un importante problema di salute pubblica, soprattutto nei paesi in via di sviluppo, tra cui Brasile [2].
Un aspetto fondamentale della carcinogenesi è proliferazione cellulare incontrollata derivante dall'accumulo di cambiamenti che promuovono l'espressione o la repressione di geni ciclo-controllo cellulare [3].
MYC è un fattore di trascrizione coinvolto nella regolazione del ciclo cellulare e l'arresto della crescita cellulare che viene comunemente liberalizzato nei tumori ed è stato descritto come un elemento chiave della carcinogenesi gastrica [4, 5]. Diversi tipi di modificazioni post-traduzionali di MYC sono stati descritti, tra fosforilazione, acetilazione, e ubiquitinazione [6]. Il sistema ubiquitina-proteasoma è la principale via di degradazione proteina regolatrice coinvolta nella differenziazione cellulare e la crescita di controllo [7]. FBXW7
codifica per una proteina subunità F-box della /complesso /F-box Skp1 Cul1 complesso ligasi (SCF) ubiquitina. SCF FBXW7 induce la degradazione dei prodotti dei geni regolatori del ciclo cellulare positivi, come la ciclina E
, MYC
, NOTCH
, e Jun
, attraverso ubiquitinazione fosforilazione-dipendente [8]. Tra SCF substrati FBXW7, MYC è di particolare importanza in uscita ciclo cellulare perché si pensa di svolgere un ruolo nel determinare se le cellule di mammifero si dividono o no [9]
. Deregolamentato FBXW7
espressione è una delle cause principali di cancerogenesi [10-12]. Perdita di FBXW7
espressione può portare a MYC sovraespressione ed è stata associata con prognosi sfavorevole nei pazienti CG [13]. Tuttavia, MYC attivazione da parte FBXW7
perdita innesca l'attivazione di p53, che svolge un ruolo chiave nella regolazione della risposta cellulare ai danni al DNA e l'espressione anormale di oncogeni. Induzione di arresto del ciclo cellulare da p53 consente la riparazione del DNA o induzione di apoptosi [14]. Così, la perdita concomitante di FBXW7
e TP53
è necessario per indurre instabilità genetica e tumorigenesi [11].
In questo studio, abbiamo studiato MYC
, FBXW7
, e TP53
numero di copie del gene variazione e mRNA e l'espressione della proteina in campioni GC e linee cellulari di adenocarcinoma gastrico. Sono stati inoltre valutati i possibili associazioni tra i nostri risultati e le caratteristiche clinico-patologiche e /o invasione e capacità di migrazione delle linee cellulari.
Metodi
campioni clinici
I campioni sono stati ottenuti da 33 pazienti GC sottoposti a trattamento chirurgico al João de Barros Barreto University Hospital di Stato di Parà, Brasile. tumorali Dissected e accoppiati campioni di tessuto non neoplastiche sono state immediatamente tagliati dallo stomaco e congelati in azoto liquido fino a quando l'estrazione di RNA.
Le caratteristiche clinico-patologici dei campioni dei pazienti sono riportati nella tabella 1. I campioni di GC sono stati classificati in base al Lauren [15] . Tutti i campioni GC hanno evidenziato la presenza di Helicobacter pylori
, e il fattore di virulenza cagA è stata determinata mediante analisi PCR di urea Comprare e cagA
come descritto da Clayton et al
. [16] e Covacci et al.
[17], rispettivamente. Tutti i pazienti avevano storie negativi dell'esposizione a uno chemioterapia o radioterapia prima dell'intervento chirurgico, e non ci sono stati altri co-occorrenze di tumori diagnosticati. Il consenso informato con l'approvazione del comitato etico dell'Università Federale del Pará era obtained.Table 1 MYC, FBXW7 e TP53 gene variazione del numero di copie, MYC e proteine ​​p53 espressione e caratteristiche clinico-patologici di 33 pazienti GC
CNV MYC
CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 copie (n = 16)
≥ 3 copie (n = 17)
p- valore
2 copie (n = 18)
1 copia (n = 15)
p- valore
2 copie (n = 25)
1 copia (n = 7)
p - valore
P (n = 19)
n (n = 14)
p- valore
P (n = 6)
n (n = 25)
p- valore
Age (y) (media ± DS)
> 50 (65.3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42.1 ± 8.2)
9
5 Pagina 6 Pagina 8 10
4 10
9 2
17
Genere
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8 10
12 Pagina 6 Pagina 8 10
5
13
istopatologia
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9
1 3 8

1 10
profondità di invasione tumorale
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
metastasi linfonodali
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10 10
15 4
13 7
5
15
fase
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11 4
8
7 4
11
MYC IHC
Negativo 5
8
0.481 Pagina 7 Pagina 6
1.000
11 2
0,671
positivo
11
9
11
9
14
5
p53 IHC
negativo 14
12
0,398
14
12
1.000
21 4
0.157

positivo 2
5 Pagina 4 3
4 3
* p
< 0.05; P: positivo; N:. negativa
Cells linee
gastrici linee cellulari di adenocarcinoma ACP02 e ACP03 [18] sono state coltivate in terreno completo RPMI (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS), 1% di penicillina /streptomicina, e l'1% kanamicina.
variazione del numero di copie (CNV)
DNA è stato estratto utilizzando un kit DNAQiamp mini (Qiagen, Hilden, Germania) secondo le istruzioni del produttore. Duplex quantitativa real-time PCR (real-time qPCR) è stata effettuata utilizzando le FAM /MGB marcata sonde TaqMan per MYC
(Hs01764918_cn), FBXW7
(Hs01362464_cn), o TP53
(Hs06423639_cn), e VIC /TAMRA marcato
TaqMan CNV RNasi P (.403.326) è stato utilizzato per il controllo interno. Tutte le reazioni qPCR in tempo reale sono stati eseguiti in quadruplicato con gDNA secondo il protocollo del produttore utilizzando un veloce sistema PCR Real-Time 7500 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Il numero di copie di ogni campione è stato stimato attraverso l'analisi CNV utilizzando Copia Caller software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Conosciuto umana DNA genomico (Promega, Madison, Stati Uniti d'America) è stato utilizzato per la calibrazione.
Quantitativa in tempo reale trascrittasi inversa PCR
RNA totale è stato estratto con TRI Reagent ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, Stati Uniti d'America ) seguendo le istruzioni del produttore. concentrazione di RNA e la qualità sono stati determinati utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) e 1% gel di agarosio. DNA complementare (cDNA) è stato sintetizzato con una ad alta capacità Kit cDNA Archive secondo le raccomandazioni del fabbricante (Life Technologies, Foster City, CA, USA). In tempo reale primer qPCR e sonde TaqMan di targeting MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7
(Hs00217794_m1), e TP53
(Hs01034249_m1) sono stati acquistati come prodotti Assays-on-demand per Gene Expression ((Life Technologies, . Foster City, CA, USA) in tempo reale qPCR è stata effettuata utilizzando un sistema di 7500 ABI Prism (life Technologies, Foster City, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore GAPDH
(NM_002046.3;. tecnologia di vita, Stati Uniti d'America) è stato selezionato come controllo interno per il monitoraggio di ingresso RNA e invertire l'efficienza della trascrizione. All tempo reale reazioni qPCR per geni bersaglio e controlli interni sono stati eseguiti in triplicato sulla stessa piastra. la quantificazione relativa (RQ) di espressione genica è stata calcolata usando l'ΔΔCt metodo [19], in cui il campione non neoplastica è stato designato come calibratore per ciascun campione di tumore associato.
immunoistochimica
immunoistochimica analisi per MYC e p53 sono stati eseguiti su sezioni, chirurgici fissati in formalina e inclusi in paraffina. Serial sezioni a 3 micron sono stati utilizzati. Indotta dal calore di recupero dell'antigene è stato impiegato (pressione controllato da un microprocessore Pascal ® Dako, Carpinteria, CA, USA). Un kit anticorpo secondario coniugato con perossidasi universale (LSAB sistema, Dako, Carpinteria, CA, USA) è stato utilizzato per il rilevamento con diaminobenzidina (DAB) come cromogeno. I seguenti anticorpi primari sono stati utilizzati: anticorpi monoclonali murini diretti contro MYC (diluizione 1: 150; SC-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA e clonare 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (diluizione 1:50 Abnova Corp., Taipei City, Taiwan), e p53 (diluizione 1:50 Dako, Carpinteria, CA, USA). espressione della proteina positiva è stata definita come la colorazione nucleare chiaramente in più del 10% delle cellule.
dosaggio migrazione e l'invasione
saggi migrazione e l'invasione sono state effettuate in una camera di Boyden modificata con cartucce filtranti (8 micron pori) per piastre da 12 pozzetti (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Per valutare l'invasione, i filtri sono stati rivestiti con 10 ml di Matrigel (10-13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), mentre sul ghiaccio. Cellule (2 × 10 5) sono state piastrate nella camera superiore in 1 ml di RPMI senza FBS. La camera inferiore è stato riempito con 1,5 ml di RPMI con FBS. Dopo 48 h in coltura, le cellule sono state fissate con 4% paraformaldeide e post-fissate con cristalvioletto 0,2% nel 20% metanolo. Le cellule sulla parte superiore del filtro, compresi quelli del Matrigel, sono stati rimossi con un batuffolo di cotone. cellule che invadono (sul lato inferiore del filtro) sono state fotografate e contate. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.
Immunofluorescenza
Cellule coltivate su vetrini sono stati fissati con 1% paraformaldeide in PBS (PBS) per 10 minuti, quindi permeabilizzate con 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in PBS per 15 min e bloccato con l'albumina 1% di siero bovino (BSA) in PBS. Le cellule sono state colorate con anticorpi di topo contro MYC (diluiti 1:50 Zymed ®, Stati Uniti d'America), p53 (diluito 1:50 Dako, Carpinteria, CA, USA), e FBXW7 (diluito 1:50; Abnova Corp ., Taipei City, Taiwan). Gli anticorpi primari sono stati rivelati utilizzando un anticorpo secondario anti-topo Alexa-568-coniugato (Invitrogen). Tutte le incubazioni sono state effettuate per 60 min a temperatura ambiente. I nuclei sono stati colorati con DAPI in Prolong anti-sbiadimento mezzo di montaggio (Invitrogen). campioni di controllo negativi sono stati trattati come descritto sopra, salvo che gli anticorpi primari sono stati omessi e sostituiti con solo PBS.
Western blotting
Estrazione di proteine ​​da cellule è stato eseguito secondo le procedure standard. Brevemente, proteina totale è stato estratto dalle cellule ACP02 e ACP03 utilizzando tampone 50 mM Tris-HCl contenente 100 mmol /L di NaCl, 50 mM NaF, 1 mM Navo 4, 0,5% NP-40, e completa cocktail di inibitori delle proteasi (Roche , Germania). La concentrazione di proteine ​​è stato stimato utilizzando un saggio Bradford (Sigma-Aldrich). Circa 30 mg di estratto proteico totale è stato caricato su un gel di dodecil 12% solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE) e elettroforesi. proteine ​​risolto sono state poi trasferite dal gel su una membrana di nitrocellulosa. La membrana è stata bloccata con il 5% di latte scremato in soluzione salina Tris tamponata contenente 5% di Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) e poi incubato con il mouse monoclonale anti-MYC (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei City, Taiwan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), e anti-β-actina (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) anticorpi diluito 1: 200, 1: 100, 1: 100 e 1: 2.000, rispettivamente. Successivamente, le membrane sono state incubate con una diluizione 1: 5.000 di perossidasi di rafano (HRP) coniugata pecore anticorpi anti-topo (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) per 1 ora a temperatura ambiente. Le proteine ​​sono stati visualizzati da chemiluminescenza.
Zimografia
ACP02 e ACP03 cellule (5 × 10 4 di ciascuna) sono stati placcati e ha permesso di aderire e diffondere per almeno 8 ore. cellule aderenti sono state lavate tre volte con PBS, e il mezzo di coltura è stato sostituito con terreno privo di siero per 24 h. L'attività di MMP2 e MMP9 nel mezzo condizionato è stata valutata mediante zimografia. mezzo condizionato è stato raccolto, concentrato (microcontrollore 30 K, Merck Millipore, Darmstadt, Germania) e risospese in tampone campione SDS-PAGE (senza β-mercaptoetanolo). Le cellule rimanenti sono state lisate e la concentrazione di proteine ​​è stato stimato utilizzando un saggio BCA (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Un totale di 1 mg di proteina da ciascun mezzo condizionato è stato separato il 10% gel di poliacrilammide contenente 0,2% di gelatina. Dopo l'elettroforesi, i gel sono stati lavati in 2,5% Triton X-100 per 30 minuti, quindi equilibrata in 10 mM Tris (pH 8,0) e incubate a 37 ° C per 16-24 h in un buffer di sviluppo contenente 50 mM Tris (pH 8,0 ), 5 mM CaCl 2, e 0,02% NaN 3. I gel sono stati colorati con lo 0,2% Coomassie blu R250 (GE Amersham, Piscataway, NJ, USA) e decolorato con 1: 1 acetico soluzione di acido /metanolo. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. bande Zymographic, che sono indicativi di attività MMP, sono stati quantificati dalla scansione densitometria analisi
. statistica
La normalità delle distribuzioni di variabili è stata determinata utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Le associazioni tra MYC
, FBXW7
, e TP53
copiano variazione numerica, i livelli di mRNA, espressione della proteina, le caratteristiche clinico-patologici, e la capacità di invasione delle cellule e la migrazione sono stati analizzati utilizzando il chi-quadrato (χ 2) e Mann-Whitney test. Correlazione tra espressione dei diversi mRNA bersaglio è stata determinata utilizzando il test di Spearman, in cui un valore inferiore a 0,3 indica una correlazione debole, 0,3-0,7 indicato una correlazione media, e valori superiori 0,7 indicata una forte correlazione. I dati sono mostrati come la gamma mediana e interquartile; valori inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi p.
Risultati
campioni tumorali gastriche hanno mostrato l'amplificazione di MYC
e la cancellazione di FBXW7
e TP53
Tre o più copie di MYC
sono stati trovati nel 51,5% (17/33) delle cellule tumorali gastriche. Al contrario, il 45,5% (15/33) e il 21,2% (7/33) delle cellule tumorali gastriche contenuta una sola copia di FBXW7
e TP53
, rispettivamente.
L'associazione tra le caratteristiche clinico-patologiche e MYC
, FBXW7
, e TP53
numero di copie è sintetizzata nella tabella 1. Un tumore gastrico che conteneva tre copie di TP53
è stato escluso dall'analisi chi-quadrato. Nessuna associazione è stata trovata tra variazione del numero di copie dei geni studiati e le caratteristiche clinico-patologici.
MYC
l'espressione di mRNA era più alta nei tumori che nei campioni non neoplastiche, mentre FBXW7
e TP53
l'espressione di mRNA era più bassa nel tumore campioni
il livello di espressione di MYC
mRNA (2.01 ± 1.72 fold change) in campioni di tessuto del tumore è stata significativamente superiore nel tessuto non-neoplastico (p = 0,0002), mentre il livello di espressione di FBXW7
mRNA (0,53 ± 0,40 volte il cambiamento) e TP53
mRNA (0.84 ± 0.55 fold change) in campioni di tessuto del tumore è stata significativamente inferiore a quello del tessuto non neoplastico (p < 0,0001 ep = 0,0011 rispettivamente). Non abbiamo trovato una correlazione significativa tra MYC
, FBXW7
, e TP53
espressione di mRNA (MYC
/FBXW7
mRNA r = -0,3464, p = 0,0562; MYC
/TP53
mRNA r = 0,0950, p = 0,6113; FBXW7
/TP53
mRNA r = -0,0745, p = 0,4747). Così, è stato rilevato solo una tendenza verso correlazione tra l'aumento MYC
espressione di mRNA e una diminuzione FBXW7
espressione di mRNA.
Tabella 2 riassume le associazioni tra varie caratteristiche clinico-patologiche e l'RQ di MYC
, FBXW7
, e TP53
espressione di mRNA nel tumore e campioni non neoplastiche appaiati. Un aumento MYC
livello di mRNA è stato associato con la presenza di metastasi linfonodali (p = 0,016) e GC stadio tumorale III-IV (p = 0,036). Una riduzione significativa FBXW7
livello di mRNA era anche associato con la metastasi del nodo presenza linfa (p = 0,015) e del tumore in stadio III-IV (p = 0,008) .table 2 MYC, i livelli di espressione FBXW7 e TP53 mRNA e fattori clinico-patologici di 33 cancro gastrico pazienti
n (%)
MYC
p- valore
FBXW7

valore p-
TP53
p- valore
mediana ± IQR
mediana ± IQR
mediana ± IQR
Age (y) (media ± DS)
> 50 (65.3 ± 9.1)
19 (57,6%)
2.04 ± 1.35
0,8873
0.55 ± 0.37
0,9247
0.86 ± 0.62
0,7409
≤50 (42.1 ± 8.2)
14 (42,4%)
1,44 ± 4,88
0.53 ± 0.50
0.94 ± 1.65
Sesso
Maschio
15 (45,5%)
2.01 ± 1.01
0,4065
0.53 ± 0.22
0,6353
0.89 ± 0.58
0,8125
femminile
18 (54,5%)
1.67 ± 2.03
0.56 ± 0.56
0.87 ± 0.69
istopatologia
intestinale
22 (66,7%)
2.06 ± 0.99
0,3525
0.53 ± 0.16
0,1391
0,81 ± 0,78
0,3311
Diffondere le
11 (33,3%)
1.40 ± 2.32
0,77 ± 0,74
0.94 ± 0.38
profondità di tumore invasione
T1
6 (18,2%)
0.89 ± 0.47
0,0857
0.88 ± 0.58
0,0678
0.85 ± 0.15
0,7069
T2-T4
27 (81,8%)
2.08 ± 1.42
0.53 ± 0.43
0.91 ± 0.79
metastasi linfonodali
Assente
13 (39,4%)
0.98 ± 1.09
0,0225 *
0.68 ± 0.36
0,0238 *
0.84 ± 0.44
0,6121
Presentare
20 (60,6%)
2.10 ± 2.20
0.46 ± 0.38
0,94 ± 0,79
fase
I-II
18 (54,5%)
1.39 ± 1.23
0,0362 *
0.57 ± 0.38
0,0380 *
0.83 ± 0.55
0,0892 †
III-IV
15 (45,5%)
2.41 ± 2.79
0,34 ± 0,45
0.96 ± 1.19
MYC IHC
positivo
20 (60,6%)
2.18 ± 1.59
0,0022 *
0,53 ± 0,32
0,4090
0.81 ± 0.57
0,1372
negative
13 (39,4%)
0.89 ± 0.85
0.58 ± 0.53
0.99 ± 0.90
p53 IHC
positivo
7 (21,2%)
4,25 ± 6,53
0,0891
0.64 ± 0.68
0,9203
1.06 ± 0.83
0,2937
negativa
26 (78,8%)
2.00 ± 1.44
0.55 ± 0.35
0.87 ± 0.60
* p
< 0,05; IQR:. Interquartile gamma
colorazione proteina MYC nucleare è associata con intestinale di tipo GC
colorazione positiva per MYC nucleare e p53 è stata trovata nel 64,5% (20/31) e il 19,4% (6/31) dei campioni GC rispettivamente (Figura 1). Nessun positività è stato trovato per FBXW7. La tabella 1 riassume le caratteristiche clinico-patologici e MYC e risultati p53 immunocolorazione. L'espressione di MYC era più frequente nei intestinale-tipo di diffuso tipo GC (p = 0,007). Inoltre, MYC immunostaining è stata associata ad un aumento MYC
livello di mRNA (p = 0.0022). Nessuna associazione è stata trovata tra p53 immunostaining e le caratteristiche clinico-patologici, TP53
numero di copie, o TP53
mRNA espressione. Figura 1 L'analisi immunoistochimica di MYC e l'espressione della proteina p53 in GC. (A) Negativo MYC immunocolorazione in diffusa di tipo GC; (B) MYC positività immunitario intestinale di tipo GC; (C) positivo p53 immunocolorazione in diffusa di tipo GC; (D) p53 positività immunitario intestinale di tipo GC (ingrandimento × 40).
Confronto di linee cellulari ACP02 e ACP03
Sia le cellule ACP02 e ACP03 conteneva tre MYC
copie e una sola FBXW7
copia . Il numero di TP53
copie era indeterminato in entrambe le linee cellulari. Rispetto con l'espressione di mRNA in cellule ACP03, le cellule ACP02 hanno espresso un livello superiore di MYC
(1,34 volte) e livelli più bassi di FBXW7
e TP53
mRNA (0.62- 0.73 e volte, rispettivamente).
Western blot analisi hanno rivelato che l'espressione MYC era significativamente più alta nelle cellule ACP02 ACP03 di cellule (p = 0,048). Inoltre, l'espressione FBXW7 era significativamente più bassa nelle cellule ACP02 ACP03 di cellule (p = 0,049). Tuttavia, non vi era alcuna differenza significativa nell'espressione p53 tra le linee cellulari (p = 0,077) (Figura 2A-B). Analisi
immunofluorescenza di entrambe le proteine ​​mostrava un pattern puntiforme di etichettatura, sostenendo i risultati Western Blot mostrano un aumento MYC e riduzione dell'espressione FBXW7 in cellule ACP02 rispetto ACP03 (Figura 2). Matrigel invasione risultati del test hanno mostrato che le cellule ACP02 erano più invasivo rispetto ACP03 cellule (p = 0.001). risultati del test hanno mostrato che la migrazione minor numero di cellule migrate ACP02 ACP03 rispetto alle cellule (p = 0,0028) (Figura 2C-D). Figura 2 MYC, espressione FBXW7 e p53, la migrazione e la capacità di invasione in ACP02 e ACP03. (A) Visualizza Grafico media ± SD di MYC, FBXW7 e l'espressione della proteina p53 in ACP02 e ACP03. Queste proteine ​​sono stati normalizzati al livello di beta-actina; (B) i dati rappresentativi di MYC, FBXW7 e l'espressione della proteina p53; (C-D) I grafici mostrano media ± SD di migrazione e cellule invasive triplica saggio; (E) I risultati rappresentativi di MYC, FBXW7 e p53 immunofluorescenza
Sia ACP02 e ACP03 cellule presentati quattro fasce di attività gelatinasi:. MMP-9 latente (92 kDa), MMP-9 attiva (88 kDa), MMP-2 latente ( 72 kDa), e MMP-2 attivo (66 kDa) (Figura 3). Abbiamo trovato differenze significative nella MMP-9 latente (p = 0,9788), MMP-2 attivo (p = 0,7848), e MMP-2 latente (p = 0,1678) tra le cellule ACP02 e ACP03. Tuttavia, state riscontrate differenze significative tra le cellule ACP02 e ACP03 rispetto alla MMP-9 attiva (p = 0,0182). Figura 3 Rappresentante analisi gelatina zimografia di MMP-2 e l'attività di MMP-9 in ACP02 e ACP03. sono stati osservati (A) Bande corrispondenti ad entrambe le forme latenti e attivi di MMP-2 e MMP-9 in ACP02 e ACP03. analisi densitometriche sono delle bande corrispondenti a latenti e forme attive di MMP-2 (B) e MMP-9 (C)
. Discussione
In questo studio, abbiamo osservato che MYC
espressione di mRNA è stata aumentata in campioni GC rispetto a corrispondenti campioni non neoplastiche. In aggiunta, a nostra conoscenza, questo è il primo studio a riferire un'associazione tra maggiore MYC
espressione di mRNA e la presenza di metastasi linfonodali e CG stadio III-IV, rafforzando l'idea che MYC
la deregolamentazione è un forte fattore di malignità in GC.
Adams et al
. [20] e Leder et al.
[21] hanno dimostrato che MYC
espressione dell'mRNA deregolamentazione può promuovere lo sviluppo del cancro in modelli di topi transgenici. L'aumento del MYC
livello di mRNA nei tumori umani può derivare da entrambi i meccanismi diretti e indiretti, che potrebbero avere diverse spiegazioni. In primo luogo, MYC
amplificazione è il meccanismo più comune di MYC
deregolamentazione in [5] GC. Questo meccanismo porta ad un aumento della produzione di prodotti oncogeni in quantità che superano la capacità trascrizionale di un gene normale duplice copia. Qui, abbiamo osservato tre o più copie MYC
gene nel 51,5% dei tumori gastrici esemplari. Studi precedenti del nostro gruppo anche mostrato che MYC
amplificazione o trisomia del cromosoma 8, in cui si trova MYC
, era presente in tutti i campioni esaminati GC da individui nel nord del Brasile, nonché in linee cellulari GC stabiliti dalla il nostro gruppo da tumori di pazienti brasiliani [18, 22-27]. La presenza di MYC
di amplificazione è stata riportata anche in campioni di plasma da individui con GC [28]. Tuttavia, nessuna associazione diretta tra MYC
copiare variazione numero e l'espressione di mRNA è stato rilevato in questo studio.
In secondo luogo, l'aumento del MYC
espressione di mRNA può derivare da ricombinazione coerente tra il immunoglobuline (Ig) locus e il MYC
oncogene. Questo fenomeno è spesso descritto nel linfoma di Burkitt ed è associata con una più lunga emivita di MYC
mRNA in cellule colpite [29]. In precedenza, il nostro gruppo di ricerca ha osservato MYC
inserimenti in diffusa di tipo GC principalmente in cromosomi che sono mappati ai geni delle immunoglobuline (cromosomi 2, 14 e 22) [26]. Così, traslocazioni cromosomiche che coinvolgono il MYC
locus (8q24) in diffusa di tipo CG in individui provenienti dal nord del Brasile potrebbe anche riflettere un aumento del MYC
livello di mRNA.
Immunoistochimica (IHC) analisi ha rivelato che l'espressione è MYC più frequentemente si trovano in intestinale di tipo GC di diffondere tipo campioni GC. Queste alterazioni potrebbero portare a una proteina MYC anomala che non viene riconosciuto da una delle anticorpi utilizzati nel presente studio. Inoltre, abbiamo osservato un'associazione tra MYC
livello di espressione di mRNA e MYC colorazione. Inoltre, i meccanismi di controllo di stabilità post-trascrizionale MYC [6, 30]. MYC
deregolamentazione è stato associato a perdita di FBXW7
, un gene soppressore del tumore haploinsufficient. In generale, FBXW7
perdita può essere causato da perdita di eterozigosi (LOH) e la mutazione [30]. La perdita al 4Q, il FBXW7
locus, è ricorrente alterazioni cromosomiche in GC [31, 32], e FBXW7
mutazioni sono state trovate in 3,7-6% dei tumori gastrici [12]. In
il presente studio, abbiamo osservato una sola copia del gene FBXW7
a 45.16% dei tumori gastrici studiati. È interessante notare che, FBXW7
espressione di mRNA nei campioni GC è notevolmente diminuita in confronto con le corrispondenti tessuto non-neoplastico. Inoltre, FBXW7
deregolazione dell'espressione di mRNA è stato associato con la presenza di metastasi linfonodali e la fase GC III-IV, come è stato osservato anche con MYC
mRNA. Questi risultati confermano il lavoro di Yokobori El Al.
[13], che ha anche mostrato un'associazione tra ridotto FBXW7
espressione di mRNA e di metastasi linfonodali che contribuisce al potenziale maligno delle cellule GC e si traduce in prognosi infausta. Inoltre, abbiamo osservato che l'espressione di MYC
e FBXW7
mRNA tendeva ad essere inversamente correlata nel presente studio.
Diversi studi hanno dimostrato che l'inattivazione MYC
sopprime i tumori negli animali, suggerendo che MYC
può essere un bersaglio molecolare nel trattamento del cancro [33-35]. In alternativa, Soucek et al
. [36] ha proposto che FBXW7 potrebbe facilitare la "terapia del tumore dormienza". Così, MYC degradazione mediante FBXW7 può non solo indurre uno stato di dormienza tumore, ma potrebbe anche avere un effetto anti-tumorale. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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