Plos ONE: Ciljno Izbris Kcne2 Povzroča gastritis cystica Profunda in želodca Neoplasia

Povzetek

Rak želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu. Predisponirajoči dejavniki vključujejo aklorhidrija, Helicobacter pylori
okužba, oxyntic atrofije in TFF2 izražanje metaplazijo. V parietalnih celicah, apical kalijeve kanale, ki obsegajo KCNQ1 alfa podenoto in KCNE2 β podenote zagotoviti K <sup>+ izlivnimi tok za lažje izločanje želodčne kisline z apical H + K + -ATPaze. Zato je genetska izbris mišje Kcnq1
ali Kcne2
ovira izločanje želodčne kisline. Drugi dokaz je predlagal vlogo KCNE2 pri širjenju človeške želodčne rakave celice, neodvisno od svoje vloge v želodcu zakisljevanje. Tukaj smo dokazati, da je 1-letni Kcne2
- /- miši v okolju brez patogenov vse kažejo hudo v želodcu preneoplastično fenotip obsega gastritis cystica profunda, 6-krat povečal želodec masa, povečana Ki67 in jedrska izraz ciklin D1 in TFF2- in citokeratinskim 7-izražanje metaplazijo. Nekateri Kcne2
- /- miši razstavljena tudi pilorično polypoid adenome, ki segajo v dvanajsternik in virusne napad na tanke stenami plovil v sub-sluznice. Nazadnje, analiza človeške želodčne tkiva raka navedla zmanjšano parietalnih celic KCNE2 izraz. Skupaj s prejšnjimi ugotovitvami, rezultati kažejo, KCNE2 motnje kot možni dejavnik tveganja za želodčne novotvorb</sup>

Navedba. Roepke TK, Purtell K, King ES, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) Ciljno brisanja za Kcne2
Povzroča gastritis cystica Profunda in želodca neoplazije. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10,1371 /journal.pone.0011451

Urednik: Xin-yuan Guan, The University of Hong Kong, Kitajska

Prejeto: 3. maj 2010; Sprejeto: 13. junij 2010; Objavljeno: 6. julij 2010

Copyright: © 2010 Roepke et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. G.W.A. podpira National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health (R01 HL079275), združenja American Heart (Grant-In-Aid 0855756D) in Irma T. Scientist Award za Hirschl Kariera. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca ostaja eden izmed glavnih vzrokov za umrljivost, in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka, po vsem svetu. Želodca nastanek raka je proces, ki napreduje skozi več faz, vključno oxyntic atrofijo, nastanek razjede, foveolar hiperplazijo, hipo- in aklorhidrija in mukozne celice metaplazijo [1]. Kljub napredku v zdravljenju raka želodca, je relativno malo znanega o molekularnih mehanizmih, ki so želodca rakotvornosti razvoj normalne želodčne sluznice v preneoplastičnih želodca poškodb ali potencialna vloga ionskih kanalov v teh procesih.

parietalnih celice doseže želodca zakisljevanje in to na podlagi na apical H ^{+ K + -ATPaze (HKA), ki črpa protone v želodcu lumen v zameno za K + ionov. Da bi ohranili to dejavnost, K + ioni mora potovati iz parietalnih celic v želodcu lumen preko apical membrano, da bi zagotovili stalno podlago za HKA [2]. To K + ion iztok poteka preko ene ali več vrst apical, K + - selektivnih kanalov. Več navznoter usmernik (KIR) kanali so vpleteni v ta proces, ki temelji na mobilni izražanja parietalnih in farmakoloških dokazov [3], [4], vendar doslej obstaja genetski dokaz za samo en kanal, ki izpolnjuje to vlogo: KCNE2-KCNQ1 [5] - [7]. KCNQ1 je šest transmembranski domena α podenote od S4 naddružine, ki predstavlja funkcionalno, napetostno odvisnih, homotetrameric K + - selektivnih kanalov heterolognih študij izražanja [8], [9]. KCNQ1 lahko tvorijo tudi heteromernih kanala komplekse s pomožnimi podenote od KCNE družini genov, in vseh pet znanih KCNE genski produkti so pokazale, da uravnavajo delovanje KCNQ1 v heterolognih študij ekspresije [10]. Ena, KCNE2, pretvori KCNQ1 do napetosti neodvisen, konstitutivno aktivno kanal, katerega tok se poveča za nizek pH. KCNE2 in KCNQ1 sta izraženi pri ali blizu parietalnih celic apical membrane in ciljno gensko izbris bodisi rezultatov podenote v aklorhidrija zaradi okvarjeno izločanja želodčne kisline [5] - [7]. Tako so KCNE2-KCNQ1 kanalov bistvenega pomena za izločanje želodčne kisline in mislil, da zagotovi luminalnega K + ione kot substrat za želodčni HKA}

Kcnq1
<sup>-. /- miši in Kcne2
- /- miši kažejo podobne želodčne fenotipi, označen z aklorhidrija, hipergastrinemije in želodca žleznega hiperplazijo [5] - [7]. Parietalnih celic iz obeh null kažejo ~ 10-krat manjšo sposobnost, da si opomore od protonske nakladanja, kar kaže na osnovno napako na izločanje želodčne kisline. Kcnq1
- /- miši razvijejo tudi metaplazija, displazije in pre-maligne adenomnih hiperplazijo v želodcu, neodvisen od okužbe [11]. To pomeni, da bi lahko KCNQ1 disfunkcijo privede do želodca novotvorb, neodvisnih od H. pylori
zaradi hude aklorhidrija, ali pa predstavljajo dodaten dejavnik tveganja, ki v povezavi s H. pylori lahko
nagnjenost k raku želodca</sup>

aklorhidrija in želodca hiperplazija smo že opazili v Kcne2
<sup>-. /- miši je kovanje tem da tvori pore podenote kompleks, KCNQ1, je bila še vedno prisotna, in v resnici je bila močno izražena v dvojnem številu celic na želodcu žleze v Kcne2
- /- miši v primerjavi z Kcne2
+ /+ miši [7]. V nedavni raziskavi je bilo ugotovljeno, KCNE2 izraz, ki ga je izrazil na razmeroma nizkih ravneh človekovih želodčnih tumorjev in v želodcu raka celičnih linijah; poleg tega prisiljen prekomerno ekspresijo KCNE2 zatreti rast človeških želodčnih rakavih celic v tkivnih kulturah in v golih miših [12]. Te ugotovitve postavljeno zanimivo možnost, da bi se KCNE2 vključeni v želodcu rakotvornosti ter potencialno neodvisno bodisi H. pylori
okužbo ali aklorhidrija. Tukaj, nadalje opredeliti potencialno vlogo KCNE2 pri regulaciji normalno rast želodca celic, smo pregledali želodcu patologije Kcne2
- /-. Miši do 15 mesecev starosti</sup>

Rezultati

Kcne2 ^{- /-
miši kažejo postopno želodčne hiperplazijo}

smo že dokazano, da je Kcne2 potrebna za normalno regulacijo rasti želodčne sluznice celic: 3- mesecev starega Kcne2
<sup>- /- miši imajo želodčne hiperplazijo, aklorhidrija in nenormalno morfologijo parietalnih celic [7]. Tukaj smo primerjali želodčne maso 3-tedensko, 3-čez en mesec in 12-15-mesecev starega Kcne2
- /- miši. Masa želodcev po 3 tednih starosti so bile podobne pri Kcne2 + /+
in Kcne2
- /- miši, medtem ko se je po 3 mesecih znatno želodca hiperplazija v Kcne2
- /- miši. Ta razlika se je povečala za 12-15 mesecev, kolikor Kcne2
- /- miši so imeli želodci 6-krat večja od tiste, Kcne2 + /+
miših iste starosti (slika 1 A)</sup>

Kcne2 ^{-. /-
miši kažejo gastritis cistična profunda}

Tudi pri 3 tednih starosti, kljub podobnim želodcu masa tistemu Kcne2 <sup>+ /+
miši, želodčne sluznice z Kcne2
- /- miši že pokazala vacuolations tesne na basolateral strani (slika 1 B; veliča v D). Da bi raziskali napredovanje želodca hiperplazijo in njenih posledic, skupaj enajst 12-15 mesecev starega Kcne2
- /- miši in pet Kcne2 + /+
miši histološko pregledati. Sluznica želodca v vseh Kcne2
- /- miši pokazala žleznega hipertrofijo in difuzno hiperplazijo z večjim številom sluzničnih celic in parietalnih celicah, ki so bile občasno vakuoliziranega (slika 1 C). Presenetljivo, gastritis cystica profunda (GCP) so opazili pri 11/11 Kcne2
- /- miši, ampak 0/5 od Kcne2
+ /+ miši ( χ 2 p
= 0,002) (povečava cist na sliki 1 E). Razširjene žleze vsebuje ostankov celic in v nekatere, vendar ne vse Kcne2
- /- miši, nevtrofilci. Slišati je bilo tudi v želodcu epitelijskih hyalinosis z občasnimi intraluminalno kristali in Hodgkinova agregati v sluznice, submucosa in muscularis. V nekaterih 12-15-mesecev starega Kcne2
- /- miške želodcev, so zasledili izrazito lamina proprial fibroza, predvsem v površinskih slojih. GCP, tudi že iz benigne želodčne psevdotumor, navadno predstavlja kot spekter hiperplastičnih in metaplastic sprememb naslednjih poškodbe želodčne sluznice. Medtem ko GCP kaže histološke značilnosti, povezane s malignosti, je samo po sebi na splošno velja funkcionalno benigni - čeprav je bilo predlagano kot možni dejavnik tveganja za raka želodca [13], [14]</sup>

Povečane proliferativni markerji v želodcu. sluznica v Kcne2 ^{- /-
miši}

Pomembno je, da izraz uveljavljenih preneoplastičnih označevalcev je v povečani Kcne2
<sup>- /- miši v primerjavi z Kcne2
+ /+ miši. Ki67 antigen celičnega ciklusa povezana jedrski proteina običajno uporablja kot označevalec proliferacije v proliferirajoče in neoplastična tkiva, vključno z želodcem [15]. Ki67 obarvanje v točkah od Kcne2
+ /+ želodci miško (3 mesece) je pokazala majhno pas Ki67 pozitivnih celic znotraj isthmic regijah želodčnih žlez, ker je bila ta proliferacije predel močno razširil v starostno ujema Kcne2
- /- miši (slika 2 A-C). Epitel obloge Cistična področja dobre klinične prakse pri 12-mesecev starega Kcne2
- /-. Miših je pokazala tudi vidno barvanje jeder z Ki67, kaže na visoki stopnji proliferacije (slika 2 B)</sup>

Cytokeratin (CK) -7 je 54 kDa polipeptid izražen v različnih epitelijskih tkivih pljuč, dojke, in fetalni človeškem želodcu; Vendar pa ni izražen v prebavnem epitelij normalen odraslih [16]. Uravnavanjem CK-7, ki kaže dedifferentiation, je bila očitno v Kcne2
<sup>- /- želodčne sluznice pri 12 mesecih; v starosti ujemanjem Kcne2
+ /+ miši, želodca sluznice pozitivne epitelne celice so precej redkejše (slika 2 D). CK-7 je bil tudi pomemben okoli cist (slika 2 E)</sup>

-TFF2 izražanje metaplazijo v želodčni sluznici Kcne2 ^{-. /-
Miši}

Trefoil- faktor družina (TFF) 2-izražanje metaplazijo je povezano z napredovanjem na raka želodca pri ljudeh in mongolskih peščene okuženih s H. pylori
[17]. Želodčne sluznice z Kcne2
^{- /- miši razstavljena območja metaplazijo z vidno TFF2 izražanja, tudi v epitelijskih celic obloge ciste (Slika 3 A-C). TFF2-izražanje metaplazija je običajno povezana z oxyntic atrofijo, označen kot izguba parietalnih celicah [1]. Tukaj smo analizirali želodčne sluznice z 12-mesečnega miši s-TFF2 izražanje metaplazijo za izražanje HKA β podenote (HKA ß), ki je parietalnih celic marker. Presenetljivo, ni bilo dokazov o oxyntic atrofije v smislu števila parietalnih celic (slika 4 A). Poleg tega je bil HKA β izražen v celicah sluznice ciste (Slika 4 B)}

Povečan želodčni sluznice ciklin D1 izražanja in želodca neoplasia v Kcne2 ^{-. /-
Miši}

Zmanjšana KCNE2 izraz je že predlagala za izboljšanje širjenja v želodčni rak celične linije SGC7901 prek povečanega izražanja ciklin D1 [12]. Tu zahodni blots predlagal, da Kcne2
gen izbris povečal skupno ciklin D1 izraz v želodčni sluznici 12-mesečnega miših (slika 5 A). Ciklin D1 pokazala šibek in pretežno citoplazemsko ekspresijo ob vznožju Kcne2
<sup>+ /+ oxyntic žleze (slika 5 B, C, pustili plošče), kot je prej opisano za normalne, proliferirajoče celice v miške želodca [ ,,,0],18]. V nasprotju s tem v Kcne2
- /- miši, ciklin D1 pokazala bolj široko in jedrske madež na vratu isthmus regiji želodčnih žlez in žleznega jamo (slika 5 B, C, desno plošče). V dveh od enajstih 1-year-old Kcne2
- /- Opazili so analizirane miši, pilorusa polypoid adenomi, ki sega v dvanajstniku (slika 5 D). Enako sta Kcne2
- /- miši tudi razstavljeni neoplastićni rast v obliki trombusov sestavljen iz fibrina in žleznega epitela, v tankostenskih plovil (ugotovljeno z uporabo endotelija označevalca CD34) v želodčni submucosa ( Slika 5 E-H).</sup>

zmanjšana parietalnih celic KCNE2 izraz v človeške želodčne tkivu

Glede na to, da je bila v prejšnji raziskavi ugotovila, zmanjšana KCNE2 izraz za povečanje širjenja želodčni rak celične linije, in KCNE2 raka izraz je bilo ugotovljeno, da je treba zmanjšati človeškega raka želodca [12], smo pregledali KCNE2 izraza v normalne človeške želodčne sluznice in želodčnega raka tkiva. Študije imunofluorescenčnega pokazale velike razlike v zvezi z KCNE2 in KCNQ1 sodelovanja lokalizacija, med normalnih in malignih človeške želodčne sluznice. Kot je bilo pričakovati, KCNQ1 in KCNE2 močno co-lokalizirana v parietalnih celicah v normalne človeške želodčne sluznice (Slika 6 A), kot je to storilo KCNQ1 in HKA β (slika 6 B). V nasprotju s tem v človeške želodčne karcinomov, KCNQ1 in KCNE2 izraz redko prekrivajo (Slika 6 C, D), čeprav KCNQ1 ohranila močno sodelovanje lokalizacije z HKA ß (slika 6 E). Tako je bila KCNE2 izraz v parietalnih celicah redko opazimo pri karcinomu želodca. Pomanjkanje KCNE2-KCNQ1 sodelovanja lokalizacija je bila še bolj globoko v človeški adenokarcinomom želodca (Slika 6 F), kar je spet zadržani co-lokalizacija KCNQ1 in HKA ß (Slika 6 G).

Pogovor

kalijem kanali proliferacije motenj

kalijevih kanalov so se pojavile kot potencialni cilj za terapij proti raku [19], vključno z KCNQ1, hERG in Kv2.1, ki so vsa a podenot partnerji KCNE2. Moten odtis mutacije v KCNQ1 gen vzrok Beckwith-Wiedemann sindrom (BWS), ki predisposes raka [20] je povzročil - [22], in KCNQ1 knockout predisposes želodca metaplazijo [11]. HERG kalijev kanal α podenote, ki tvori komplekse z KCNE2 pomožno podenoto v človeškem srcu [23], je preveč izražena v nekaterih tumorjev, in je bila opredeljena kot dejavnik preživetja tumor [24] - [27], kakor je Kv2. 1 [28].

KCNE2 je že ugotovljeno, da je izražena 2-krat v človeške želodčne tkivu raka nižja kot v sosednjih normalnih želodčnih celic, in prisilno uravnavanjem KCNE2 je antiproliferativne učinke na želodcu rakavih celic vitro
in vbrizga v golih miših [12]. Domnevni mehanizem tega antiproliferativnega učinka je navzdol ureditev ciklin D1, upočasnitev napredovanja preko celičnega cikla [12], podoben temu, kar so opazili z zaviralcem cisaprid hERG [29]. Zvišane izraz ciklin D1 v človeških želodčnih tumorjev korelira z zelo slabo prognozo [30], zato razumevanje dejavnikov, ki povečujejo ciklin D1 izraz lahko privede do terapevtske poti za to in druge oblike raka. Čezmerno ciklin D1 je bilo predlagano, da prispevajo k onkogenezo jih moti celični ciklus, in so poročali, da je pomemben onkogeni dejavnik v požiralniku raka [31], in so povezane z jedrsko akumulacijo beta catenin v jajčnikih endometrioid adenokarcinome [32]; jedrska ciklin D1 prekomerno v žolčnika karcinomov je kritični dogodek [33].

Tukaj bomo opisali obsežne metaplastic spremembe v želodcu muscosa zaradi genetske motnje Kcne2
. To je povezano s povečano jedrsko ciklin D1 izražanja v želodčni sluznici, ki spominja na rezultate iz prejšnje in vitro
študije KCNE2 [12]. Niti sedanja poročilo ne predhodna študija pa izrisati mehanizem za ciklin D1 uravnavanjem v Kcne2
^{- /- sluznica - je to posledica metaplastic sprememb drugotnega pomena aklorhidrija v teh miših, ali je obstaja več neposredna povezava med Kcne2
in ciklin D1? Študija, ki jo Yanglin in kolegov trdi, da slednji vsaj delno, saj je v svoji študiji je prišlo do ciklin D1 spremembe v posameznih celicah brez vpliva aklorhidrija [12]. Menimo, da spremeni drugotnega pomena, so aklorhidrija najverjetneje prevladujoč dejavnik, vendar neposredna povezava ni mogoče izključiti. Zanimivo je, da hERG, drug partner KCNE2, je izražena v želodčnih rakave celice, vendar ne normalno želodca epitelij in hERG kanalčkov cisaprid je že ugotovljeno, da zavre rast želodčni rak celic z zaviranjem vstop S fazi od G (1) faza v celični cikel, povečanje apoptoza [29]. Ker KCNE2 delno zavira hERG tokov z zmanjšanjem enotni prevodnost in pospešitvi deaktivacijo [23], da je zanimiva možnost, da so opazili proti proliferativni učinki KCNE2 prekomerno in vitro
[12] zaradi hERG trenutni zatiranje spodbujanje apoptoza, in obratno, da KCNE2 down uredbe ali genetske motnje lahko izreče želodca celično proliferacijo s povečanjem hERG gostoto toka}

GCP in TFF2 izražanje metaplazijo (SPEM) v Kcne2 ^{-. /-
Miši}

GCP mogoče predstaviti z ljudmi s prekinitvami nadželodčnem bolečine, napenjanje, obstrukcije želodca ali zgornjega krvavitev iz prebavil in se najpogosteje opazili pri bolnikih z anamnezo ene ali želodca ali gastrostomo [34]. Vendar pa je bilo nekaj primerov poročali brez zveze s predhodno operacijo želodca [35], [36]. Patogeneza človeškega GCP je verjel, da se bodo pojavili zaradi poškodb na muscularis sluznice, kar lahko privede do zunajmaternične zavežejo želodčnih žlez submucosa, muscularis sluznice ali seroza, ali zaradi kroničnega vnetja. GCP se običajno šteje za benigni klinična entiteta, čeprav so poročali povezava z rakom želodca [14] [37] [38].

V laboratorijskih živalih, GCP sekundarno Helicobacter sp
. Okužba je bil opisan kot predhodnika intramucosal displazije in novotvorb [39], in so povezane z razvojem raka želodca. GCP je pogosto najdemo v H. pylori
okuženimi mongolska puščavska podgana, ki je razvil tudi želodčni adenokarcinom in limfnih hiperplazija [40]. V prejšnjem mišje genetskega modela GCP, TGF beta 1 <sup>+/- miši razvilo žlezne hiperplastični poškodbe, da je v skupni rabi morfološke značilnosti človeka GCP, z mešanimi vnetno infiltracijo okoliških sluznice in kroničnim vaskulitisa v tkivih, ki mejijo na teh poškodb [ ,,,0],41]. Tukaj, v Kcne2
- /- miši, GCP pojavlja v odsotnosti primarnega vnetne lezije, in neodvisno od žilnega uničenju. Namesto tega predlagamo, da je glavna napaka izguba KCNE2 beta podenote iz kanala kompleksov z KCNQ1, s čimer se krši pomembno apikalno K + pot recikliranja v parietalnih celicah in preprečuje želodčne zakisljevanje jih parietalnih celic HKA. Medtem ko ta predstavlja "funkcionalno atrofija 'v populaciji parietalnih celic, v predhodnih študijah intestinalno metaplazijo bila dejanska izguba parietalnih celicah, imenovano" oxyntic atrofija' šteje pomemben proces v etiologiji intestinalno metaplazijo, povezano z boleznijo refluks kisline ali H. pylori
okužba, in je najpogostejši metaplastic proces opaziti v zgornjem delu gastrointestinalnega trakta [42].</sup>

Oxyntic atrofija v odsotnosti pomembne vnetja lahko inducira DMP-777, zaviralca nevtrofilne elastaze ki usmerjena tudi parietalnih celic zaradi njegovega delovanja kot protonophore [43]. Oxyntic atrofija pri miših želodca pomanjkljiva, po zdravljenju z DMP-777, hitro pripelje do TFF2 izražanje metaplazijo, imenovana tudi spazmolitično peptid izražanje metaplazijo (SPEM) [44]. SPEM je znan zaradi svoje močne zveze s človeško adenokarcinomom želodca, in to je opaziti v večini fundic biopsije žlez iz človeške H. pylori
bolniki, okuženimi gastritis [45]. Pojav SPEM v Kcne2
<sup>- /- miši v odsotnosti obeh H. pylori
ali klasična oxyntic atrofija kaže, da je "funkcionalna atrofija", ki ga je povzročil Kcne2
izbris lahko dovolj za začetek SPEM. Ena od razlik med Kcne2
- /- miši in tiste, v študiji Nozaki je, da je Kcne2
- /- miši so hipergastrinemijo, ne gastrin primanjkuje. Druga razlika je, da DMP-777 moti želodčni tubulovesicle protonske gradient brez ogrožanja H + K + - funkcijo ATPaze, medtem ko je ciljni Kcne2
motnje preprečuje H + /K + -ATPaznega funkcija z odpravo svoje luminalnega substrat, K + ionov [7], [44]. Morda lahko slednji mehanizem v prihodnosti razkrila namige o kritičnih dogodkih v oxyntic atrofije, ki izhajajo iz SPEM: to je trenutno predlagano, da SPEM indukcijske posledica pomanjkljivosti v parietalnih regulatorjev celice izločajo običajne obnove želodca sluznice, ki vključujejo Sonic ježa TGF-α [46], [47] zaradi izgube parietalnih celicah. Nadaljnje študije Kcne2
- /- parietalnih celic -, ki so še vedno prisotni, vendar motnje v delovanju - lahko razkrijejo regulatorji, ki jih lahko še vedno izločajo, in tistimi, ki jih ne morejo</sup>

želodčne sluznice. o Kcne2
<sup>- /- miši kažejo tudi povečano ekspresijo sedežem marker proliferacije Ki67, manifestira kot povečanje širine sluznice proliferativne pasu in kot Ki67-pozitivne celice oblaganje cist v regijah GCP. Podobno se je de-razlikovanje dvojno podajo CK7, ni izražena v 1-letni Kcne2
+ /+ želodčne sluznice, so bila izražena s tem, da za Kcne2
- /- miši. Ob teh in zgoraj opisani markerji skupaj, Kcne2
- /- želodčne sluznice eksponati metaplazijo z več značilnosti preneoplasia, in v nekaterih primerih neoplazije, zlasti v specifičnih povzročiteljev bolezni brez okolju brez dokazov iz želodca Helicobacter
okužbe ali oxyntic atrofija, in v odsotnosti kemijskih inhibitorjev želodca zakisljevanja. Skupaj z ugotovitvijo, tu se zdi, da parietalnih celic KCNE2 izraz, ki se zmanjša človeške želodčne rakastega tkiva (slika 4) in prejšnjem poročilu, ki KCNE2 zavira raka proliferacije celic želodca [12], podatki kažejo KCNE2 motnja je povezana z želodčno napredovanju raka. Nadaljnje študije bo vključevalo preučitev, ali Kcne2
motnje poveča nagnjenost k raku želodca v patogenov in temeljijo na kancerogene protokoli, mehanizmi za te morebitne razlike, in možno mehanizmu povezave med Kcne2
, ciklin D1 in celični cikel perturbacija zunaj področja etiologiji bolezni-aklorhidrija povezana. Poleg tega, kot KCNQ1 in KCNE2 tudi sočasno izražen v ščitničnih epitelijskih celic, kjer so pomembni za ščitničnega hormona biosintezo [48], bo v interesu, da preuči morebitno vlogo KCNE2 v nenormalno širjenje thyrocyte.</sup>

materiali in metode

Proizvodnja in uporaba miši, ki ciljajo gena

Vse miši so opisane v tej študiji so bili nastanjeni, izkoriščena in žrtvovati, v skladu s smernicami NIH in Cornell University institucionalno varstvo živali in uporaba odbora. Vse miši, opisane v tej študiji so bili nastanjeni, izkoriščena in žrtvovati, v skladu s smernicami NIH in Weill Medical College institucionalno varstvo živali in uporaba odbora. Etična odobritev za rejo in tkiva trgatev iz divjega tipa in Kcne2
<sup>- /- miši za biomedicinske raziskave je bil odobren s Weill Medical College institucionalno varstvo živali in uporaba odbora (protokol 0704-610A). Kcne2
- /- miši so bili ustvarjeni kot je opisano prej od C57BL /6 Kcne2 + /
- x Kcne2 +/-
križi [7]. Številčni podatki so bili analizirani z EXCEL programske opreme (Microsoft) z uporabo enosmerne analize variance (ANOVA) s statistično značilno nastavljen na P
. ≪ 0,05</sup>

Histologija

histologijo in želodec masa količinsko, Kcne2 <sup>+ /+
in Kcne2
- /- miši na 3 tednov, 3 mesece in 12-15 mesecev so žrtvovali uporabo CO _{2 zadušitev (5-10 na genotip). Želodci so bili odstranjeni obdukciji, želodec masa določi, nato pa je bil želodec tkivo določen v 10% nevtralnem zastalega formalinu, obdelani z rutinskimi metodami in vgrajeni v parafinskega voska. Želodčne sluznice odseki so bile znižane na 5 mikrometrov intervalih, ki se nahaja na pozitivno nabite SuperFrost diapozitive, obarvali s hematoksilinom in eozinom (H &E). In ocenjevati z Olympus BX45 mikroskopom}</sup>

Imunohistokemija

Imunohistokemično odkrivanje Ki67, CK-7 in TFF2 (znan tudi kot spazmolitično peptid) je bila izvedena s pomočjo procesorja Discovery XT (Ventana Medical Systems). Koncentracije primarni protiteles, ki se uporabljajo, so bili: 0,05 ug /ml (zajec poliklonski anti-Ki67, Vector Labs); 1 ug /ml (miš monoklonsko anti-CK-7; Abcam); 1 ug /ml (miš monoklonsko anti-TFF2; Abcam). Pred osnovno inkubacijo protiteles, so odseki tkiva blokiran za 30 min v 10% normalne kozjega seruma, 2% BSA v PBS (anti-Ki67); 30 min pri 10% normalne koze seruma, 2% BSA v PBS in avidin /biotin za 8 minut (anti-CK-7); 30 min v 10% normalne kozjega seruma, 2% BSA v PBS in Avidin /biotin za 4 min (anti-TFF2). Primarni čas inkubacije protitelesa: 3 ure (Ki67 in CK-7); 5 ur (anti-TFF2). Sekundarni inkubacije protiteles: 32 min v 1:200 biotinilirano kozjega anti-kunčjega IgG (Vector Labs) za Ki67; 60 min v 1:200 biotiniliranega konj proti mišjim IgG (Vector Labs) za CK-7 in TFF2. Za Ki67 inkubacije sekundarna protitelesa, so oken D, Streptavidin-HRP in komplet za odkrivanje DAB (Ventana Medical Systems) se uporablja v skladu z navodili proizvajalca. CK-7 in TFF2, IgG1 miške (5 pg /ml) je bila uporabljena kot izotipna negativno kontrolo, in so bili uporabljeni oken D, Streptavidin-HRP in komplet za odkrivanje DAB (Ventana Medical Systems).

Za ciklin zaznavanje D1 so želodčne drsi segrevali pri 58-60 ° C 30 minut in nato deparaffinized. Endogene peroksidaze aktivnost smo blokirali z inkubacijo odsekov v 1% vodikovega peroksida v PBS 15 min (8,3 ml, 30%, H _{2O 2 /241,7 ml PBS), ki ji sledi razkrinkanje na antigenski epitop s microwaving v 10 mM citrat buffer na visoki moči za 15 minut. Ploščice smo ohladili na 20 minut, izperemo z destilirano vodo za 5 minut, prenese na PBS in inkubiramo v 10% normalne konjskega seruma (v 2% BSA-PBS razredčilo) 30 minut v vlažni komori. Dodamo miško monoklonsko anti-ciklin D1-protitelo (Cell signalnega) pri 1:1000 z 2% BSA v PBS in inkubiramo preko noči pri 4 ° C v vlažni komori. Ploščice smo splaknili v PBS in je bila uporabljena sekundarni biotinilirana konj anti-mišji IgG protitelesa (Vector Labs) v 1:500 v PBS 30 minut pri sobni temperaturi. Ploščice smo sprali in avidin-biotin kompleks (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Labs) je bila uporabljena razredčene na 1:25 v PBS 30 minut. Signal je bila odkrita z inkubacijo v 3,3-Diaminobenzidine (Sigma, Serija Ne 026K3767), dokler ni dosežen želeni barvni intenzivnosti. Po končnih opere v vodi, so diapozitivi rahlo jih nasprotno v hematoksilinom. KCNQ1 in HKA β enotno označevanje in detekcijo so bile izvedene kot je bilo predhodno opisano [7]. Zaznavanje CD34 je bil z 1:50 anti-CD34 protitelesa (AbCam). Ploščice smo gledati z Nikon Eclipse E600 mikroskopom in fotografirali s pomočjo RT barvna kamera in SPOT programsko opremo (Diagnostic Instruments, Inc.).}

Imunofluorescenčni

Vse človeško tkivo je bilo pridobljeno iz ProSci, Poway, CA, in je bilo potrjeno, da je bilo pridobljeno iz usposobljenih in licenciranih patologije storitev z uporabo ustrezno skladna soglasje za uporabo v biomedicinskih raziskavah ter z zaščito anonimnosti darovalca; Zato dodatna Weill Medical College Institutional Review Board etika odobritev ni bila potrebna. odkrivanje imunofluorescentni od HKA ß, KCNQ1 in KCNE2 v človeške želodčne tkiva (ProSci) je bila izvedena s pomočjo procesorja na Discovery XT (Ventana Medical Systems). Uporabljene so bile naslednje človeška tkiva: normalno želodčno tkivo iz 50-letno žensko (PSC-10-809-XB1); želodčni rak tkivo, informacije bolnik ni na voljo (PSC-10-814-CA1); Adenokarcinom želodca tkiva iz 51-letni ženski (PSC-10-809-XA1). Koncentracije primarni protiteles, ki se uporabljajo, so bili: 0,5 mg /ml anti HKA β (miška monoklonska, afinitete Bioreagents), 1 mg /ml anti-KCNQ1 (zajec ali koza poliklonski Chemicon) in interni anti-KCNE2 seruma je bila uporabljena pri 1:500 redčenje po stolpcih bogati IgG. Pred primarno inkubacijo protiteles, so odseki tkiva blokirali 30 minut pri 10% normalne koze seruma, 2% BSA v PBS, ki mu sledi 8 min avidin /Biotin bloka. Inkubacijska primarno protitelo (3 ure) je sledila 32 minutah inkubacije z biotiniranimi anti-mišji IgG (ABC kit od Vector laboratorijih), 60 min inkubaciji z biotiniranimi anti-kozjega IgG (ABC kit od Vector laboratorijih) ali biotiniliranega anti-rabbit protitelesa na 1:200 redčenju (Vectastain ABC komplet za). Sekundarni detekcije je bila izvedena z Streptavidin-HRP D (Ventana Medical Systems), ki mu sledi inkubaciji z Tyramide-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ali Tyramide Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Obarvajo diapozitivi so gledano z Zeiss Axiovert 200 widefield mikroskopom in slike so bili pridobljeni s pomočjo Metamorfa programske opreme 7.1 (Molecular Devices).

Western blot

Za zahodno s sušenjem, membranske frakcije želodca so bili pripravljeni kot je opisano prej [7]. Tri želodci iz 12-mesecev starega Kcne2 <sup>+ /+
in Kcne2
- /- miši so bili odstranjeni obdukciji, Rasporiti vzdolž curvatura ventriculi velik, očiščeno ingesta in takoj snap-zamrznili v tekočem dušiku. Želodcev smo nato homogenizirali v pufru, ki vsebuje 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 ug /ml PMSF, 1 ug /ml Nonidet P40, 0,5% SDS in 0,5% natrijevega ortovanadata, nato inkubirali na ledu 30 minut in centrifugiramo pri 12000 x g
20 minut pri 4 ° C. Koncentracija proteinov v supernatantu je bila izmerjena po metodi Bradfordu. Skupno proteina (40 g /pas) je bil naložen v prefabricirane tris-glicin 4-20% gelu (Jule Inc., Milford, CT) in ločimo z elektroforezo. Proteine ​​smo nato prenesli na PVDF membrano (Bio-Rad, Hercules, CA), ter blokirali s 5% mleka, 0,05% Tween-20 v PBS 12 ur pri 4 ° C na nihalke. inkubacije primarna protiteles (4 h, RT v 1% mleka, 0,05% Tween-20, PBS, pufer A) so bili: 1:2000 anti-ciklin-D1 (Abcam); 1:5000 anti-GAPDH (Abcam). Membrane smo sprali 4-krat, vsak s protitelesi inkubacijskem pufru nato inkubirali z ustreznimi sekundarnih protiteles (BioRad) razredčenih 1:10000 v pufru A 2 uri pri sobni temperaturi, nato speremo 4 x 20 min vsaka s pufrom A in enkrat za 5 min 20 min s PBS.</sup>

• Plos Patogeni: Caveolin-1 Varuje B6129 miši proti Helicobacter pylori, gastritis
• Plos ONE: Epstein Barr Virus in Helicobacter pylori Sočasna okužba Ali pozitivno povezana s hudimi gastritis pri pediatričnih bolnikih