Ploche ONE: Cielené Výmaz KCNE2 Príčiny Gastritída cystica Profundo a žalúdka Neoplasia

abstraktné

žalúdka Rakovina je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu po celom svete. Predisponujúce faktory patrí achlórhydriou, Helicobacter pylori
infekcie, oxyntických atrofia a TFF2 expresiou metaplázia. V parietálnych bunkách, apikálnej draslíkové kanály obsahujúce KCNQ1 podjednotky a β KCNE2 podjednotka poskytnúť k <sup>+ výtoku prúdu uľahčiť sekréciu žalúdočnej kyseliny apikálnej H + K + ATPázy. V súlade s tým, genetická delécie myšieho KCNQ1
alebo KCNE2
narúša sekréciu žalúdočnej kyseliny. Ďalší dôkaz navrhol úlohu pre KCNE2 v proliferáciu nádorových buniek v žalúdku človeka, nezávisle na jeho úlohu v žalúdku okyslenie. Tu sme ukazujú, že 1-ročný KCNE2
- /- myši v patogénov prostredí bez všetky vykazujú závažné žalúdočné preneoplastických fenotyp obsahujúce gastritída cystica profunda, 6-násobné zvýšenie žalúdka hmotnosť, zvýšená Ki67 a nukleárnej expresiu cyklin D1 a TFF2- a cytokeratin 7 exprimujúce metaplázia. Niektoré KCNE2
- /- myší tiež vystavoval pylorické polypovitými adenómov zasahujúce do dvanástnika a nádorové invázie tenkostenných ciev v sub-sliznici. Napokon, analýza ľudského karcinómu žalúdka tkaniva uvedené zníženú parietálnych buniek KCNE2 výraz. Spolu s predchádzajúcimi nálezmi, výsledky naznačujú KCNE2 narušenie ako možný rizikový faktor pre žalúdočné neoplázia</sup>

Citácia :. Roepke TK, Purtell K, kráľ EC, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) Cielená Vypustenie zo KCNE2
Spôsobuje zápal žalúdka cystica profunda a žalúdočných nádorové ochorenia. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10,1371 /journal.pone.0011451

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Čína

prijatá: 3. mája 2010; Prijaté: 13.června 2010; Uverejnené: 06.07.2010

Copyright: © 2010 Roepke et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. G.W.A. je podporovaný Národný srdce, pľúca a krv zavedú, National Institutes of Health (R01 HL079275), American Heart Association (Grant-In-Aid 0855756D), a Irma T. Hirschl kariéry Scientist Award. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka zostáva jednou z hlavných príčin úmrtnosti a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu, na celom svete. Žalúdočné karcinogenézy je proces, ktorý prejde niekoľkých fázach, vrátane oxyntických atrofiu, tvorenie vredov, foveolární hyperplázia, hypo- a achlórhydriou a slizničnej bunky metaplázia [1]. Aj napriek pokrokom v liečbe rakoviny žalúdka, relatívne málo je známe o molekulárnych mechanizmov zapojených do žalúdka karcinogenézy, vývoj normálne žalúdočnej sliznice do preneoplastických žalúdočných lézií alebo potenciálnej úlohy pre iónové kanály v týchto procesoch.

Parietálnej bunky dosiahnuť žalúdočné acidifikácii, ktorá vyplýva z apikálním H ^{+ k + ATPázy, (HKA), ktoré čerpá protóny do žalúdka lumen výmenou za k + iónov. Pre udržanie tejto činnosti, K + ióny, musí cestovať z parietálnej bunky do žalúdočnej dutiny cez apikálnej membráne, aby sa zabezpečilo trvalé substrát pre HKA [2]. To K + ion efluxného dochádza prostredníctvom jedného alebo viacerých typov apikálnej, K + - selektívne kanály. Niekoľko dovnútra usmerňovač (KIR) kanály sú zapojené do tohto procesu na základe vyjadrenia parietálnych buniek a farmakologický dôkaz [3], [4], ale ešte neexistuje genetický dôkaz pre iba jeden kanál, ktorý spĺňa túto úlohu: KCNE2-KCNQ1 [5], - [7]. KCNQ1 je šesť transmembránový doména α podjednotky z S4 superrodiny, ktorá tvorí funkčnú, napäťovo riadené, homotetrameric K + - selektívne kanály v heterológnych expresných štúdií [8], [9]. KCNQ1 môžu tiež tvoriť komplexy heteromerické kanálov s pomocnými podjednotkami od génovej rodiny KCNE, a všetkých päť známych KCNE génové produkty bolo preukázané, že reguluje funkciu KCNQ1 v heterológnych expresných štúdií [10]. Jeden, KCNE2, prevedie KCNQ1 na napäťové nezávislé, konštitutívne aktívny kanál, ktorého prúd sa zvyšuje o nízkom pH. KCNE2 a KCNQ1 sú oba vyjadrené v alebo v blízkosti parietálnych buniek apikálnej membráne, a cielené génovej delécie buď výsledkov podjednotky v achlórhydriou kvôli poruchou sekrécie žalúdočnej kyseliny [5] - [7]. Tak KCNE2-KCNQ1 kanály sú považované za nevyhnutné na sekréciu žalúdočnej kyseliny a že poskytujú priesvitu K + iónov ako podklad pre žalúdočné HKA}

KCNQ1
<sup>-. /- myši a KCNE2
- /- myši vykazovali podobné žalúdočné fenotypy, vyznačujúci sa tým, achlórhydriou hypergastrinémie a žalúdočné glandulární hyperplázia [5] - [7]. Parietálnej bunky z oboch null ukazujú ~ 10-násobne zníženú schopnosť zotaviť sa z protónu zaťaženia, čo naznačuje, primárny defekt v sekréciu žalúdočnej kyseliny. KCNQ1
- /- myší tiež vyvinúť metaplázia, dysplázia a pre-malígne adenomatóznej hyperplázie v žalúdku nezávislej infekcie [11]. To naznačuje, že KCNQ1 dysfunkcia môže viesť k žalúdočným neoplazmy nezávisle na H. pylori
v dôsledku závažnej achlórhydriou, alebo predstavovať ďalší rizikový faktor, ktorý v spojení s H. pylori
mohol náchylnosť k rakovine žalúdka</sup>

achlórhydrie a žalúdočné hyperplázia sme už predtým pozorovali u KCNE2
<sup>-. /- myší bolo zarážajúce vzhľadom na to, že vytvárajúce póry podjednotku komplex, KCNQ1, bol stále prítomný, a v skutočnosti to bolo silne vyjadrená v dvojnásobný počet buniek na žalúdočné žľazy v KCNE2
- /- myší v porovnaní s KCNE2
+ /+ myšou [7]. V nedávnej štúdii sa zistilo, že expresia KCNE2 ktorý má byť exprimovaný v relatívne nízkych hladinách v ľudských nádorov žalúdka a v žalúdočných nádorových bunkových línií; Okrem toho, nútené zvýšená expresia KCNE2 potlačil rast ľudských buniek karcinómu žalúdka vo tkanivovej kultúre, a u nahých myší [12]. Tieto nálezy zvýšila zaujímavú možnosť, že KCNE2 môžu byť zapojené do žalúdočnej karcinogenéze a potenciálne nezávisle buď H. pylori
infekciu alebo achlórhydriou. Tu ďalej definovať potenciálnu úlohu KCNE2 v regulácii normálneho rastu buniek žalúdka, sme skúmal žalúdočné patológiu KCNE2
- /- myší. Do 15 mesiacov veku</sup>

Výsledky

KCNE2 ^{- /-
myši vykazujú progresívne žalúdočné hyperplázia}

sme už skôr preukázané, že KCNE2 je nutná pre normálnu reguláciu rastu žalúdočnej sliznici bunky: 3- month-old KCNE2
<sup>- /- myši majú žalúdočné hyperplázia, achlórhydriou a abnormálne temennej morfológiu buniek [7]. Tu sme porovnávali žalúdok hmotnosť 3 týždňovej, 3-mesiac a 12 až 15-month-old KCNE2
- /- myší. Hmotnosť žalúdkov po 3 týždňoch veku boli podobné u KCNE2 + /+ stroje a KCNE2
- /- myší, zatiaľ čo o 3 mesiace tam bola významná žalúdočné hyperplázia vo KCNE2
- /- myší. Tento rozdiel sa zvýšil o 12-15 mesiacov do tej miery, že KCNE2
- /- myši mali žalúdky 6-násobne väčší ako KCNE2 + /+ myšou
rovnakého veku (obrázok 1 a)</sup>

KCNE2 ^{-. /-
myši vykazujú gastritídu cystická profunda}

Aj po 3 týždňoch veku, a to napriek podobným žalúdka hmota k tomu KCNE2 <sup>+ /+ myšou
, žalúdočnej sliznice KCNE2
- /- myší už prejavilo vacuolations blízkosti bazolaterálnou strane (obrázok 1 B; zväčšený D). Vyšetrovať priebeh žalúdočné hyperplázie a jeho následkov, celkom jedenásť 12-15 mesiace starý KCNE2
- /- myší a päť KCNE2 + /+
myši boli histologicky skúmané. Žalúdočnej sliznice vo všetkých KCNE2
- /- myši vykazovali žliaz hypertrofiu a difúzna hyperplázia so zvýšeným počtom slizníc buniek a parietálnych buniek, ktoré boli občas vakuoalizovanou (obrázok 1 C). Pozoruhodné je, že gastritída cystica profunda (GCP) bola pozorovaná u 11/11 KCNE2
- /- myší, ale 0/5 z KCNE2
+ /+ myšou ( χ 2 p
= 0,002) (zväčšenie cysty na obrázku 1 E). Rozšírené žľazy obsahovali zvyšky buniek, a niektoré, ale nie všetky KCNE2
- /- myši, neutrofily. Tam bol tiež žalúdočné epitelu hyalinóza s občasnými intraluminálními kryštály, a lymfoplasmacytická agregáty na sliznicu, submukóze a muscularis. V niektorých 12-15-month-old KCNE2
- /- myší žalúdky, prominentnej lamina proprial fibrózy bol zistený, najmä v povrchových vrstvách. GCP, tiež predtým označovaný ako benígna žalúdočný pseudotumor, všeobecne uvádza ako spektrum hyperplastických a metaplastická zmeny po poškodení žalúdočnej sliznice. Kým GCP ukazuje histologické vlastnosti spojené s malígnym stavom, je to samo o sebe všeobecne považovaný za funkčne benígne - aj keď to bolo navrhnuté ako možný rizikový faktor pre rakovinu žalúdka [13], [14]</sup>

Zvýšené proliferačnej markery v žalúdočnej. sliznice KCNE2 ^{- /- myší}

Dôležité je, že expresia zavedených preneoplastických markerov bola zvýšená na KCNE2
<sup>- /- myší v porovnaní s KCNE2
+ /+ myšou. Ki67 antigén je bunkový cyklus súvisiaci jadrový proteín bežne používaný ako proliferácia marker v proliferujúcich a neoplastických tkanivách, vrátane žalúdka [15]. Ki67 farbenia v oddieloch od KCNE2
+ /+ žalúdky myš (3 mesiace) ukázala malú skupinu Ki67 pozitívnych buniek v rámci istmických regiónoch žalúdočných žliaz, že tento proliferačnej oddelenie bolo významne rozšírený v vekom uzavreté KCNE2
- /- myši (Obrázok 2 A-C). Epitel obloženie cystickej oblasti GCP v 12-month-old KCNE2
- /-. Myši ďalej preukázala výrazné farbenie jadier s Ki67, svedčí o vysokej rýchlosti proliferácie (obrázok 2 B)</sup>

Cytokeratin (CK) -7 je polypeptid 54 kDa exprimovaný v širokej palete epiteliálnych tkanív, vrátane pľúc, prsníka, žalúdka a fetálny ľudskej; Avšak, nie je exprimovaný v gastrointestinálnom epiteli normálnej dospelej [16]. Zvýšená expresia CK-7, svedčiace o dediferenciací, bolo zrejmé u KCNE2
<sup>- /- žalúdočnej sliznice na 12 mesiacov; vek-uzavreté KCNE2
+ /+ myšou, žalúdočnej sliznice pozitívny epitelové bunky boli omnoho vzácnejšie (Obrázok 2 D). CK-7 bol tiež prominentnú okolo cýst (obrázok 2 E)</sup>

TFF2 expresiou metaplázia v žalúdočnej sliznici KCNE2 ^{-. /-
Myši}

Trefoil- faktor rodiny (TFF) 2-exprimujúce metaplázia je spojená s progresiou do rakoviny žalúdka u ľudí, a v mongolských Gerbil infikovaných H. pylori
[17]. Žalúdočnej sliznice KCNE2
^{- /- myši vystavené oblasti metaplázia s prominentnej TFF2 prejavu, vrátane epitelové bunky obloženia cysty (Obrázok 3 A-C). TFF2 exprimujúce metaplázia je typicky spojená s oxyntických atrofiou, vyznačujúci sa ako strata parietálnych buniek [1]. Tu sme analyzovali žalúdočnú sliznicu od 12 mesiacov staré myši s TFF2 exprimujúcich metaplázia pre expresiu HKA β podjednotky (HKA P), parietálnej bunky markeru. Pozoruhodné je, že neexistuje žiadny dôkaz oxyntických atrofia z hľadiska počtu parietálnych buniek (obrázok 4). Ďalej HKA β bol vyjadrený v bunkách výstelky cýst (obr.4 B)}

Zvýšená žalúdočnej sliznice cyklín D1 expresie a žalúdočné neoplazmy v KCNE2 ^{-. /-
Myší}

Znížené expresie KCNE2 bol predtým navrhnuté pre zvýšenie proliferácie v žalúdočnej rakovina bunkové línie SGC7901 cez nadmernou expresiou cyklin D1 [12]. Tu, western blot naznačil, že delécie génu KCNE2
zvýšenie celkového expresie cyklín D1 v žalúdočnej sliznici 12-month-old myší (obr 5 A). Cyklin D1 ukázali slabé a prevažne cytoplazmatickú expresiu pri päte KCNE2
<sup>+ /+ oxyntických žľazy (Obrázok 5 B, C, ľavý panel), ako bolo predtým popísané pre normálne proliferujúce bunky, myší žalúdka [ ,,,0],18]. Naproti tomu v KCNE2
- /- myší, cyklin D1 ukázal rozšírenejšie a nukleárnej farbenie v isthmus oblasti krku žalúdočných žliaz a žliaz jamu (Obrázok 5 B, C, pravé panely). V dvoch z jedenástich 1-ročná KCNE2
- /- myši boli pozorované analyzované pyloric polypoidní adenómy, zasahujúce do dvanástnika (Obrázok 5 D). Rovnaký dva KCNE2
- /- myši vykazovali tiež neoplastického rastu vo forme trombov zložené z fibrínu a glandulární epitel, v tenkostenných nádob (identifikovaný pomocou endoteliálny markeru CD34) v žalúdočnej submukóze ( obrázok 5 E-H).</sup>

znížená parietálnych buniek KCNE2 expresie v ľudskej žalúdočnej tkanive karcinómu

Vzhľadom na to, že v predchádzajúcej štúdii bolo zistené, znížená expresia KCNE2 k zvýšeniu žalúdočnej proliferácie nádorových buniek línie, a KCNE2 bolo zistené, výraz, ktorý má byť znížená u ľudskej rakoviny žalúdka [12], sme sa zaoberali KCNE2 expresie v normálnej ľudskej žalúdočnej sliznice, žalúdočné a rakoviny tkaniva. Imunofluorescenčné štúdie odhalili nápadné rozdiely, pokiaľ ide o KCNE2 a KCNQ1 ko-lokalizácia, medzi normálnou a malígne ľudskej žalúdočnej sliznice. Ako sa dalo očakávať, KCNQ1 a KCNE2 silne ko-lokalizované v parietálnych buniek v normálnej ľudskej žalúdočnej sliznice (obrázok 6), rovnako ako KCNQ1 a HKA β (Obrázok 6 B). Naproti tomu, v žalúdku človeka karcinómov, KCNQ1 a expresie KCNE2 zriedka prekrývali (Obrázok 6 C, D), aj keď KCNQ1 udržala silnú spoločnú lokalizáciu s HKA P (obrázok 6 E). Tak, KCNE2 expresie v parietálnych bunkách sa zriedkavo pozorovali u karcinómu žalúdka. Nedostatok KCNE2-KCNQ1 ko-lokalizácia bola ešte hlbšia do ľudského adenokarcinóme žalúdka (obrázok 6 F), čo opäť udržal čo-lokalizácia KCNQ1 a HKA p (Obrázok 6 G).

Diskusia

draslíka kanály porúch proliferácie

draslíka kanály sa objavili ako potenciálny cieľ pre anti-liečby rakoviny [19], vrátane KCNQ1, hERG a Kv2.1, z ktorých všetky sú podjednotky partnermi KCNE2. Narušená imprinting spôsobená mutáciami v géne KCNQ1 príčina Beckwith-Wiedemann syndrómom (BWS), čo predurčuje k rakovine [20] - [22], a KCNQ1 knockout predurčuje k žalúdočnej metaplázia [11]. Kanál draselného hERG α podjednotky, ktoré tvoria komplexy s KCNE2 pomocné podjednotky v ľudskom srdci [23], je nadmerne exprimovaný v niektorých nádoroch, a bol identifikovaný ako faktor prežitia tumoru [24] - [27], ako je KV2. 1 [28].

KCNE2 bolo skôr zistené, že je vyjadrená 2-krát do ľudského žalúdka rakoviny tkaniva nižšie ako v susedných normálnych žalúdočných bunkách, a nútenej upregulaci KCNE2 mal anti-proliferačnej účinky na rakovinových bunkách žalúdka in vitro stroje a vstrekne do holých myší [12]. Predpokladaný mechanizmus tejto anti-proliferatívneho účinku je down-regulácia cyklin D1, oddialenie progresie prostredníctvom bunkového cyklu [12], podobné tomu, čo bolo pozorované s blokátorom cisapridu hERG [29]. Zvýšená expresia cyklin D1 v ľudských nádorov žalúdka koreluje s mimoriadne zlou prognózou [30], teda pochopiť faktory, ktoré zvyšujú expresiu cyklin D1 môže viesť k terapeutických tried pre tento a iné formy rakoviny. Nadmerná expresia cyklin D1 bolo navrhnuté, aby prispeli k onkogenézy tým, že ruší bunkový cyklus, a bola označená ako dôležitý onkogénne faktorom pažeráka karcinómu [31], a spojené s jadrovou akumuláciu beta-kateninu vo vaječníkoch endometrioid adenokarcinómu [32]; nukleárna cyklín D1 nadmerná expresia v žlčníku karcinómov je kritická udalosť [33].

Tu opisujeme rozsiahle metaplastická zmeny v žalúdku muscosa v dôsledku genetickej narušenia KCNE2
. S tým je spojené so zvýšeným jadrovým cyklin D1 prejavu v žalúdočnej sliznici, pripomínajúce výsledkov z predchádzajúcej in vitro
štúdie KCNE2 [12]. Ani súčasný správa ani predchádzajúce štúdie však vymedziť mechanizmus pre cyklin D1 up reguláciu v KCNE2
^{- /- sliznice - je to dôsledok zmien metaplastická sekundárna achlórhydriou u týchto myší, alebo je existuje viac priama súvislosť medzi KCNE2 stroje a cyklín D1? Štúdia Yanglin a kolegovia zastáva tento aspoň z časti, pretože vo svojej štúdii došlo k zmenám cyklín D1 bez vplyvu achlórhydriou [12] v izolovaných bunkách. Domnievame sa, že sa mení sekundárne achlórhydrie sú s najväčšou pravdepodobnosťou dominantným faktorom, ale priama súvislosť nemožno vylúčiť. Je zaujímavé, že hERG, ďalší partner KCNE2, je exprimovaný v rakovinových bunkách žalúdka, ale nie normálne žalúdočnej epitelu a hERG kanál blokátor cisaprid bol predtým zistené, že potláča žalúdočnú rast nádorových buniek tým, že inhibuje vstup do S fázy z G (1) fázy v bunkového cyklu, zvýšenie apoptózy [29]. Vzhľadom k tomu, KCNE2 čiastočne potláča hERG prúdov znížením jednotná vodivosti a urýchlenie deaktiváciu [23], je to zaujímavá možnosť, že pozorovaný antiproliferačný účinky KCNE2 nadexpresiou in vitro
[12] sú kvôli hERG súčasného potlačenia podpore apoptóza, a naopak, že KCNE2 down-regulácia alebo genetické narušenie môže vytvoriť priaznivé podmienky žalúdočné bunkovú proliferáciu zvýšením hERG prúdovej hustoty}

GCP a TFF2 expresiou metapláziu (SPEM) v KCNE2 ^{-. /-
Myši}

GCP sa môže prejaviť u ľudí s prerušovaným bolesť v nadbrušku, nadúvanie, žalúdočné obštrukcie alebo hornej gastrointestinálne krvácanie, a je najčastejšie vidieť u pacientov s anamnézou buď gastrektómii alebo gastrostomickou [34]. Avšak, niekoľko prípadov boli hlásené nemajú žiadnu súvislosť s predchádzajúcim žalúdočnej operácii [35], [36]. Patogenéza ľudského GCP sa predpokladá, že vyplývajú z poranenia svalovej mukózy, čo môže viesť k zachyteniu ektopickú žalúdočných žliaz v submukóze, svalové mukózy alebo seróza, alebo z chronického zápalu. GCP je všeobecne považovaný za benígne klinická entita, hoci súvislosť s rakovinou žalúdka bolo hlásených [14], [37], [38].

U laboratórnych zvierat, GCP sekundárne Helicobacter sp
, Infekcia bola opísaná ako predchodca intramucosal dysplázia a neoplázia [39], a spojený s rozvojom karcinómu žalúdka. GCP bol často nájdený v H. pylori
-infected mongolskej pieskomily, ktorý tiež vyvinul adenokarcinómom žalúdka a lymfatický hyperplázia [40]. V predchádzajúcom myšieho genetického modelu GCP, TGF beta 1 <sup>+/- myší vyvinula žliaz hyperplastické lézie, ktoré zdieľané morfologické znaky s ľudskou GCP, so zmiešanou zápalovou infiltráciu okolitých sliznice a chronické zápalom v tkanivách priliehajúcich k týmto lézií [ ,,,0],41]. Tu, v KCNE2
- /- myší, GCP sa vyskytuje v neprítomnosti primárnej zápalové lézie, a nezávisle na cievne obliteráciu. Namiesto toho navrhujeme, že primárny defekt je strata KCNE2 beta podjednotky z komplexov kanálov s KCNQ1, čím narúšajú dôležitú vrcholový K + dráhu recyklácie v parietálnych bunkách a prevenciu žalúdočného prekyslenia podľa parietálnych buniek HKA. Aj keď to znamená "funkčná atrofia" v bunkovej populácie parietálnej, v predchádzajúcich štúdiách črevnej metaplázia skutočná strata parietálnych bunkách, nazývané "oxyntických atrofia", bol považovaný za dôležitý proces v etiológii črevnej metaplázia, spojená s kyselinou refluxnej choroby alebo H. pylori
infekcie, a je najčastejšou metaplastická proces pozorovať v hornej časti gastrointestinálneho traktu [42].</sup>

oxyntických atrofia v neprítomnosti významného zápalu môžu byť vyvolané DMP-777, ktorý je inhibítorom neutrofilné elastázy, ktoré zameriava aj na parietálnej bunky, kvôli jeho pôsobenia ako protonophore [43]. Oxyntických atrofia u myší žalúdočných s deficitom, po liečbe DMP-777, rýchlo vedie k TFF2 expresiou metaplázia, označovaný aj ako upokojujúci peptid vyjadrenie metaplázia (Spem) [44]. SPEM je pozoruhodný, pretože jeho silné spojenie s ľudskou adenokarcinómu žalúdka, a sleduje sa vo väčšine biopsiou fundusu žliaz z ľudských H. Pylori
-infected pacienti gastritída [45]. Vzhľad Spem v KCNE2
<sup>- /- myší v neprítomnosti jednej zo H. pylori
alebo klasické oxyntických atrofia naznačuje, že "funkčná atrofia" spôsobené KCNE2
vypustenia môže byť dosť pre spustenie Spem. Jeden podstatný rozdiel medzi KCNE2
- /- myší a tí v štúdii Nozaki je, že KCNE2
- /- myši sú hypergastrinemic, nie gastrínu s deficitom. Ďalším rozdielom je, že DMP-777 narušuje žalúdočné tubulovesicle sklon protónu bez narušenia H + K + - ATPázy funkciu, zatiaľ čo cielené KCNE2
narušenie bráni H + /K + -ATPázu funkcie tým, že odstráni jeho luminální substrát, K + ióny [7], [44]. Možno, že tento druhý mechanizmus môže v budúcnosti odhalí vodítka týkajúce sa kritických udalostí v oxyntických atrofiou, ktoré vedú k Spem: je v súčasnej dobe navrhuje, aby SPEM indukčné vyplýva z nedostatku v parietálnych bunkách vylučovaný regulátory normálneho obnovenie žalúdočnej sliznice, ktoré zahŕňajú sonic Ježek TGF-α [46], [47], z dôvodu straty parietálnych buniek. Ďalšie štúdie KCNE2
- /- parietálnych buniek - ktoré sú stále prítomné, ale nefunguje správne - môže odhaliť regulátory, ktoré môžu stále vylučujú, a tie, ktoré nemôžu</sup>

žalúdočnej sliznice. z KCNE2
<sup>- /- myší tiež vykazujú zvýšenú expresiu zavedenej proliferačnej marker Ki67, prejavujúce sa ako zvýšenie šírky pásma slizničnej proliferatívne a ako Ki67-pozitívnych buniek obloženia cysty v regiónoch GCP. Podobne de-diferenciácie značka CK7, nie je vyjadrené v 1-ročná KCNE2
+ /+ žalúdočnej sliznice, bol široko vyjadril v tom, ze KCNE2
- /- myší. S ohľadom na tieto a vyššie opísané markery spoločne, je KCNE2
- /- žalúdočnej sliznice vykazuje metaplázia s viacerými funkciami preneoplasia, a v niektorých prípadoch neoplazmy, najmä v špecifickom prostredí bez patogénov bez známok žalúdočné Helicobacter
infekcie alebo oxyntických atrofie a pri absencii chemických inhibítorov žalúdočnej acidity. Spolu s konštatovaním tu zdá, že parietálnych buniek KCNE2 výraz, ktorý má byť znížený do ľudského žalúdka rakoviny tkaniva (obrázok 4) a predchádzajúcej správe, ktorá KCNE2 inhibuje žalúdočné proliferáciu rakovinových buniek [12], tieto údaje naznačujú narušenie KCNE2 je spojená s progresiou rakoviny žalúdka. Budúce štúdie budú zahŕňať skúmanie, či KCNE2
narušenie zvyšuje náchylnosť k rakovine žalúdka vnútri patogénu a karcinogény založené na protokoloch, mechanizmy za týmito možnými rozdiely a potenciálny Mechanistické väzby medzi KCNE2
cyklin D1 a bunkového cyklu odchýlka mimo oblasť achlórhydriou asociovaných etiológie ochorenia. Okrem toho, ako KCNQ1 a KCNE2 sú tiež čo-vyjadrený v epitelových bunkách štítnej žľazy, kde sú dôležité pre biosyntézu hormónu štítnej žľazy [48], to bude zaujímavé skúmať potenciálne úlohu KCNE2 pri abnormálne proliferáciu thyrocyte.</sup>

materiály a metódy

Výroba a použitie génových cielené myši

Všetky myši popísané v tejto štúdii boli umiestnení, využité a usmrtená v súlade s pokynmi NIH a Cornell University Institutional Animal Care and Use výboru. Všetky myši popísané v tejto štúdii boli umiestnení, využité a usmrtená v súlade s pokynmi NIH a Weill Medical College Institutional Animal Care and Use výboru. Etický súhlas na chov a zber tkanivo z divokého typu a KCNE2
<sup>- /- myší pre biomedicínsky výskum bol schválený Weill Medical College ústavnej zvierat starostlivosť a používanie výboru (protokol 0704-610A). KCNE2
- /- myši boli generované ako je opísané vyššie z C57BL /6 KCNE2 + /
- x KCNE2 +/-
kríža [7]. Číselné údaje boli analyzované pomocou softvéru Excel (Microsoft) jednocestnú analýzy variance (ANOVA) s štatistickej významnosti stanovený na P Hotel <0,05.</sup>

histológia

histológie a žalúdok hmotnosť kvantifikácia, KCNE2 <sup>+ /+ stroje a KCNE2
- /- myší po 3 týždňoch, 3 mesiace a 12-15 mesiacov boli zabité za použitia CO _{2 zadusenia (5-10 na genotypu). Žalúdky boli odstránené pitvu, žalúdok hmotnosť určená, potom žalúdok tkanivo bola stanovená v 10% neutrálne pufrovaného formalínu, spracovávajú bežnými metódami a vložené do parafínu. Žalúdočnej sliznice rezy boli narezané na 5 um intervaloch, ktoré na kladne nabité SUPERFROST šmykľavky, zafarbené hematoxylínom a eosínu (H &E)., A hodnotí sa Olympus BX45 mikroskopu}</sup>

Imunohistochémia

imunohistochemická detekcia Ki67, CK-7 a TFF2 (tiež známy ako spazmolytický peptid) bola vykonaná za použitia procesora Discovery XT (Ventana Medical Systems). koncentrácia primárnej protilátky boli použité: 0,05 ug /ml (králičie polyklonálne anti-Ki67, Vector Labs); 1 ug /ml (myšia monoklonálna anti-CK-7; abca); 1 ug /ml (myšia monoklonálna anti-TFF2; abca). Predchádzajúce inkubácii primárne protilátku, tkanivové rezy boli blokované po dobu 30 minút v 10% normálnom kozím sérom, 2% BSA v PBS (anti-Ki67); 30 min v 10% normálnom kozím sérom, 2% BSA v PBS a avidín /biotín po dobu 8 min (anti-CK-7); 30 min v 10% normálnom kozím sérom, 2% BSA v PBS a avidín /biotín po dobu 4 minút (anti-TFF2). Primárne protilátky boli inkubačná doba: 3 hodiny (Ki67 a CK-7); 5 hodín (anti-TFF2). Sekundárne inkubácie protilátok boli nasledovné: 32 min v 1: 200 biotinylizované kozie anti-králičie IgG (Vector Labs) pre Ki67; 60 min v 1: 200 biotinylizované konské anti-myší IgG (Vector Labs) pre CK-7 a TFF2. Pre Ki67 inkubácii sekundárnou protilátkou, blokovanie D, streptavidín-HRP a detekcia DAB kit (Ventana Medical Systems) boli použité podľa inštrukcií výrobcu. Pre CK-7 a TFF2, myší IgG1 (5 ug /ml) bola použitá ako negatívna kontrola izotypov a blokovanie D, streptavidín-HRP a detekcia DAB kit (Ventana Medical Systems) boli použité.

pre cyklín detekcia D1, žalúdočné sklíčka bola zahrievaná pri teplote 58-60 ° C počas 30 minút a potom zbavené parafínu. Endogénnej peroxidázy aktivita bola blokovaná inkubáciou rezov v 1% peroxidu vodíka v PBS po dobu 15 minút (8,3 ml 30% H _{2O 2 /241,7 ml PBS) a následne odmaskovaniu antigénne epitop od mikrovlnnej rúre v 10 mM citrátu pufri pri vysokom výkone po dobu 15 minút. Sklíčka sa chladí po dobu 20 minút, premyté v destilovanej vode po dobu 5 minút, prevedený do PBS a inkubované v 10% normálnom konským sérom (2% BSA-PBS riedidla) po dobu 30 minút vo vlhkej komore. Pridá sa myšou monoklonálnou anti-cyklin D1-protilátky (Cell Signaling) pri 1: 1000 s 2% BSA v PBS a inkubované cez noc pri 4 ° C vo vlhkej komore. Sklíčka sa premyjú v PBS a sekundárnej biotinylizované konské anti-myšou IgG protilátky (Vector Labs) sa aplikuje v 1: 500 v PBS po dobu 30 minút pri teplote miestnosti. Sklíčka bola umytá a avidín-biotín komplex (Vectastain ABC Elitná Kit, Vector Labs), zriedené v 1:25 v PBS bol aplikovaný po dobu 30 minút. Signál bol detekovaný inkubáciou v 3,3-Diaminobenzidine (Sigma, šarža č 026K3767), pokiaľ sa požadovaná intenzita farby bolo dosiahnuté. Po konečnom premytí vo vode, bola sklíčka ľahko kontrastné v hematoxylínom. KCNQ1 a HKA β jedného označovanie a detekcia boli vykonané ako bolo predtým popísané [7]. Detekcia CD34 bol s 1:50 anti-CD34 protilátky (abca). Sklíčka boli videní s Nikon Eclipse E600 mikroskopom a fotografoval pomocou RT farebnou kamerou a SPOT softvér (Diagnostic Instruments, Inc.).}

Imunofluorescenčný

Všetky ľudské tkanivo bola získaná z ProSci, Poway, CA, a bol certifikovaný ako že boli získané z kvalifikovaných a licencované patológie služieb s využitím vhodných zodpovedalo súhlas na použitie v biomedicínskom výskume a s ochranou anonymity darcu; Preto nebolo potrebné dodatočný Weill Medical College Institutional Review Board schválenie etika. Detekcia imonufluoreskujúca HKA p, KCNQ1 a KCNE2 v ľudskej žalúdočnej tkanive (ProSci) bola vykonaná za použitia Discovery XT procesor (Ventana Medical Systems). Boli použité nasledujúce ľudské tkanivá: normálna žalúdočné tkanivo z 50-ročnej ženy (PSC-10-809-XB1); karcinóm žalúdka tkanivo, informácie o pacientovi nedostupná (PSC-10-814-CA1); adenokarcinóme žalúdka tkanivo z 51-ročnej ženy (PSC-10-809-XA1). koncentrácia primárnej protilátky boli použité: 0,5 mg /ml anti-β HKA (myšou monoklonálna, Affinity bioreagentu), 1 mg /ml anti-KCNQ1 (králičie alebo kozie polyklonálne, Chemicon), a vlastné anti-KCNE2 séra bol použitý 1: 500 riedenie po stĺpcové-obohacujúce IgG. Predchádzajúce inkubácii primárne protilátka sa tkanivové rezy boli blokované po dobu 30 minút v 10% normálnom kozím sérom, 2% BSA v PBS, nasleduje 8 min avidín /biotín bloku. Inkubácia primárnej protilátky (3 hodiny), po ktorom nasleduje 32 min inkubácie s biotinylizované anti-myší IgG (ABC kit od Vector Labs), 60 min inkubácie s biotinylizované anti-kozie IgG (ABC kit od Vector Labs), alebo biotinylizované anti-králičie protilátka v 1: 200 riedenie (Vectastain ABC kit). Sekundárne detekcia bola vykonaná pomocou Streptavidin-HRP D (Ventana Medical Systems), s následnou inkubáciou s tyramidovým-Alexa Fluór 488 (Invitrogen) alebo tyramidovým Alexa Fluór 568 (Invitrogen). Nafarbená boli videní s Zeiss Axiovert 200 širokom zornom poli mikroskopu a obrázky boli získané pomocou Metamorph softvéru 7.1 (Molecular Devices).

Western blotting

westernovým prenosom, membránové frakcie žalúdočných boli pripravené ako bolo opísané skôr [7]. Tri žalúdky 12-month-old KCNE2 <sup>+ /+ stroje a KCNE2
- /- myši boli odstránené pitvu, rozrezať pozdĺž curvature ventriculi major, zbavený ingest a okamžite snap-zmrazí v kvapalnom dusíku. Žalúdky boli potom homogenizované v pufri obsahujúcom 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 ug /ml PMSF, 1 ug /ml Nonidet P40, 0,5% SDS a 0,5% orthovanadátu sodného, ​​potom inkubované na ľade po dobu 30 minút a odstredí sa pri 12000 x g
počas 20 minút pri 4 ° C. Koncentrácia proteínu v supernatante bola meraná v súlade s metódou Bradford. Celkového proteínu (40 ug /dráha) bol vložený do prefabrikované tris-glycínovom 4-20% gélu (Jule Inc., Milford, CT) a separované elektroforézou. Proteíny boli potom prenesené na membránu PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA), a blokovali sa 5% mlieko, 0,05% Tween-20 v PBS po dobu 12 hodín pri teplote 4 ° C na vahadla. Inkubácia primárnej protilátky (4 hod, teplota miestnosti v 1% mlieka, 0,05% Tween-20, PBS, "pufor A"), boli: 1: 2000 anti-cyklin-D1 (abca); 1: 5000 anti-GAPDH (abca). Membrány boli premyté 4 krát, 20 min každý s protilátkou inkubačného pufra a potom inkubované s príslušnými sekundárnymi protilátkami (BIORADE), zriedených 1: 10000 v pufri A po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti a potom sa premyje 4 x 20 minút každý s pufrom A a raz po dobu 5 minút PBS.</sup>

• Ploche patogény: Caveolin-1 Chráni B6129 myší proti Helicobacter pylori gastritídou
• Ploche ONE: Vírus Epstein-Barrovej a Helicobacter pylori Súčasná infekcie sú pozitívne spojená s ťažkou gastritídou u detských pacientov