Финансирование:. G.W.A. поддерживается Национальным сердца, легких и крови институт, Национальные институты здоровья (R01 HL079275), Американской ассоциации сердца (дотация 0855756D), и Hirschl Карьера Scientist Award Ирма Т.. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Kcnq1 Результаты Kcne2 - /- Kcne2 -. /- Увеличение пролиферативных маркеров в желудка. слизистая Kcne2 - /- TFF2 экспрессирующих метаплазии в слизистой оболочки желудка Kcne2 -. /- Увеличение слизистой оболочки желудка циклин D1 экспрессия и желудка неоплазии в Kcne2 -. /- Снижение теменной клеток экспрессия KCNE2 в желудочном ткани человеческого рака Калийные каналы в пролиферативных расстройств GCP и TFF2 экспрессирующих метаплазия (SPEM) в Kcne2 -. /- Создание и использование мышей ген-направленных гистологии Иммуногистохимия
<р> рак желудка остается одной из основных причин смертности, а второй ведущей причиной смерти от рака во всем мире. Желудочный канцерогенез является процессом, который проходит через несколько этапов, в том числе oxyntic атрофии, образование язв, foveolar гиперплазии, гипо- и ахлоргидрией и слизистых клеток метаплазии [1]. Несмотря на успехи в лечении рака желудка, относительно мало известно о молекулярных механизмах, участвующих в желудочном канцерогенезе, развитие нормальной слизистой оболочки желудка в предопухолевых желудка поражений, или потенциальную роль ионных каналов в этих процессах.
<Р> Теменная клетки желудка достичь подкисления в силу верхушечного H + K + АТФазы (HKA), который прокачивает протоны в просвет желудка в обмен на K + ионов. Чтобы поддерживать эту активность, К + ионы должны проходить из париетальных клеток в просвет желудка через апикальную мембрану, для обеспечения непрерывного субстрата для HKA [2]. Это K + ион Отток происходит через один или несколько типов апикальном, K + - селективных каналов. Несколько внутрь выпрямителя (Кир) каналы участвуют в этом процессе на основе экспрессии клеток теменной и фармакологическая доказательств [3], [4], но до сих пор существует генетических доказательств для только одного канала выполняет эту роль: KCNE2-Kcnq1 [5] - [7]. Kcnq1 является областью шести трансмембранных α-субъединицы из надсемейства S4, который формирует функциональную, потенциалзависимыми, homotetrameric K + - селективных каналов в исследованиях экспрессии гетерологичных [8], [9]. Kcnq1 могут также образовывать гетеромерные канальные комплексы со вспомогательными субъединиц из семейств генов KCNE, и все пять известных продуктов генов KCNE было показано, регулирует функцию Kcnq1 в исследованиях гетерогенной экспрессии [10]. Один из них, KCNE2, преобразует Kcnq1 к напряжению независимый, конститутивно-активного канала, ток увеличивается на низком рН. KCNE2 и Kcnq1 экспрессируются на или вблизи к париетальных клеток апикальной мембраны, и гена-мишени удаление приводит либо к субъединица ахлоргидрией вследствие секреции желудочной кислоты нарушенной [5] - [7]. Таким образом, KCNE2-Kcnq1 каналы считаются необходимыми для секреции желудочной кислоты и думал обеспечить люминальную K + ионов в качестве субстрата для желудка HKA
-. /- Мыши и Kcne2
- /- мыши обнаруживают сходные фенотипы желудка, характеризующиеся ахлоргидрией, гипергастринемии и желудка железистой гиперплазии [5] - [7]. Париетальные клетки либо из нулевого шоу ~10 раз уменьшенную способность восстанавливаться после протонной нагрузки, что указывает на первичный дефект в секреции желудочной кислоты. Kcnq1
- /- мыши также разработать метаплазии, дисплазии и предраковых аденоматозный гиперплазия желудка независимой от инфекции [11]. Это говорит о том, что Kcnq1 дисфункция может привести к желудочным неоплазии вне зависимости от H. пилори
из-за тяжелой ахлоргидрией, или представляют собой дополнительный фактор риска, который в сочетании с H. пилори
может предрасполагают к развитию рака желудка
<р> ахлоргидрии желудка и гиперплазия мы ранее наблюдали в Kcne2
-. /- мышей было поразительным, учитывая, что пороформирующий субъединицей комплекс, Kcnq1, все еще присутствует, и на самом деле она была сильно выражена в двойном количестве клеток на желудочной железы в Kcne2
- /- мышей по сравнению с Kcne2
+ /+ мышей [7]. В недавнем исследовании, экспрессия KCNE2 было установлено, что выражено на относительно низких уровнях в опухолях желудка человека и в желудочном линиях раковых клеток; Кроме того, принудительная избыточная экспрессия KCNE2 подавляет рост клеток рака желудка человека в культуре ткани, так и в голых мышей [12]. Эти находки подняли интригующую возможность, что KCNE2 могут быть вовлечены в желудочном канцерогенезе, и, возможно, независимо от либо H. пилори
инфекции или ахлоргидрией. Здесь, для дальнейшего определения потенциальной роли KCNE2 в регуляции нормального роста клеток желудка, мы тщательно желудочный патологии Kcne2
- /- мышей. До 15-месячного возраста
мыши обнаруживают прогрессирующее гиперплазия желудка
<р> ранее мы показали, что Kcne2 необходим для нормального регулирования желудочного роста клеток слизистых оболочек: 3- месяц назад Kcne2
- /- мыши имеют гиперплазию желудка, ахлоргидрией и аномальную морфологию париетальных клеток [7]. Здесь мы сравнили желудок массу 3 недели, 3-месяц- и 12-15-месячного Kcne2
- /- мышей. Масса желудков в 3-недельного возраста были похожи на Kcne2 + /+
и Kcne2
- /- мышей, в то время как на 3 месяца был отмечен существенный гиперплазия желудка в Kcne2
- /- мышей. Эта разница увеличилась на 12-15 месяцев до такой степени, что Kcne2
- /- мыши имели желудки в 6 раз больше, чем у Kcne2 + /+ мышей
одного и того же возраста (Рисунок 1)
мыши обнаруживают гастрит кистозной profunda
<р> Даже в 3-х недельного возраста, несмотря на подобные желудка масса, что и Kcne2 + /+ мышей
, слизистая оболочка желудка из Kcne2
- /- мышей уже показали vacuolations близкие к базолатеральной стороне (рис 1 B; увеличенный в D). Для исследования прогрессирования гиперплазии желудка и его последствий, в общей сложности одиннадцать 12-15 месячного Kcne2
- /- мышей и пять Kcne2 + /+
мышей гистологическое исследование. Слизистой оболочки желудка во всех Kcne2
- /- мышей показали, железистой гипертрофии и гиперплазии диффузной с увеличением числа клеток слизистой и париетальных клеток, которые были иногда вакуолизированных (рисунок 1 C). Поразительно, гастрит cystica profunda (GCP) наблюдался в 11/11 Kcne2
- /- мышей, но 0/5 из Kcne2
+ /+ мышей ( χ 2 р
= 0,002) (увеличение кист на рисунке 1 Е). Dilated желез содержали остатков клеток и, в некоторых, но не все Kcne2
- /- мышей, нейтрофилы. Был также желудка эпителиального гиалиноз со случайными внутрипросветных кристаллов, и lymphoplasmacytic агрегаты в слизистой оболочке, подслизистой и мышечной. В некоторых 12-15-месячным Kcne2
- /- мыши желудки, видный пластинкой proprial фиброзом было отмечено, особенно в поверхностных слоях. ГКП, также ранее называют доброкачественные псевдоопухоли желудка, как правило, представляет как спектр гиперпластических и метапластических изменений после повреждения слизистой оболочки желудка. В то время как GCP демонстрирует гистологические особенности, связанные со злокачественной опухолью, она сама по себе обычно считается функционально доброкачественные - хотя это было предложено в качестве возможного фактора риска развития рака желудка [13], [14]
мышей
<р> Важно отметить, что экспрессия установленных предопухолевых маркеров было увеличено в Kcne2
- /- мышей по сравнению с Kcne2
+ /+ мышей. Ki67 антиген представляет собой клеточный цикл, связанных с ядерным белком, обычно используемый в качестве маркера пролиферации в пролиферирующих и неопластических тканях, в том числе желудка [15]. Ki67 окрашивание в разделах от Kcne2
+ /+ желудки мышей (3 месяца) показали небольшую группу Ki67 положительных клеток в истмико областях желудочных желез, в то время как этот пролиферативная отсек был значительно расширен в с учетом возрастного соответствует Kcne2
- /- мышей (Рисунок 2 А-С). Эпителий подкладка кистозные области опорных точек в 12-месячным Kcne2
- /-. Мышей также продемонстрировали заметное окрашивание ядер с Ki67, что свидетельствует о высокой скорости пролиферации (рис 2 B)
<р> Цитокератин (СК) -7 представляет собой 54 кДа полипептид, выраженный в самых разнообразных эпителиальных тканей, включая легкого, молочной железы и плода желудка человека; Однако, это не выражается в нормальной взрослой желудочно-кишечного тракта эпителии [16]. Положительная регуляция CK-7, что свидетельствует о дифференцировке, было очевидно в Kcne2
- /- слизистой оболочки желудка в 12 месяцев; в возрасте подобранная Kcne2
+ /+ мышей, слизистой желудка положительные эпителиальные клетки встречаются гораздо реже (рис 2 D). CK-7 был также видным вокруг цист (рисунок 2) E
Мышей
<р> Trefoil- фактор семьи (ФАТ) 2-экспрессирующие метаплазия связано с прогрессированием рака желудка у людей, и у монгольских песчанок, инфицированных H. пилори
[17]. Желудочный слизистая Kcne2
- /- мышей выставлены участки метаплазии с видными выражением TFF2, в том числе в эпителиальных клеток, выстилающих кист (Рисунок 3 А-С). TFF2 экспрессирующих метаплазии, как правило, ассоциируется с oxyntic атрофии, характеризуется как потерю париетальных клеток [1]. Здесь мы проанализировали слизистую оболочку желудка от 12-месячного мышей с TFF2 экспрессирующих метаплазии для экспрессии HKA β-субъединицы (HKA β), теменной клеточный маркер. Поразительно, что не было никаких доказательств oxyntic атрофии с точки зрения количества париетальных клеток (рисунок 4 А). Кроме того, была выражена HKA β в клетках, выстилающих цист (рисунок 4 B)
Мышей
<р> снижение экспрессии KCNE2 было ранее предложено для усиления пролиферации в клетку рака желудка линии SGC7901 через повышение экспрессии циклина D1 [12]. Здесь, западные помарки предположил, что Kcne2
удаление гена увеличено общее выражение циклин D1 в слизистой оболочке желудка 12-месячного мышей (рис 5 А). Циклин D1 показали слабую и преимущественно цитоплазматической экспрессии у основания Kcne2
+ /+ oxyntic железы (рисунок 5 B, C, слева панели), как описано выше для нормальных, размножающихся клеток в желудке мыши [ ,,,0],18]. В противоположность этому, в Kcne2
- /- мышей, циклин D1 показали более широкое и ядерное окрашивание в шею перешейка области желудочных желез и железистой яму (рисунок 5 B, C, правая панели). В двух из одиннадцати 1-летний Kcne2
- /- мышей наблюдались проанализированные, пилорические полипоидные аденомы, проникнув в двенадцатиперстную кишку (рис 5 D). То же самое два Kcne2
- /- мышей также показали рост опухолевой в виде тромбов, состоящего из фибрина и железистого эпителия, в тонкостенных сосудов (идентифицированный с помощью эндотелиальной маркера CD34) в подслизистой желудка ( Рисунок 5 E-H).
<р> Учитывая, что в предыдущем исследовании было обнаружено снижение экспрессии KCNE2 для усиления желудочной пролиферации раковых клеток линии, и KCNE2 выражение было установлено, что снижается при раке желудка человека [12], мы исследовали экспрессию KCNE2 в нормальной человеческой слизистой оболочки желудка, и желудочный раковой ткани. Иммунофлюоресценции исследования выявили существенные различия в отношении KCNE2 и Kcnq1 совместной локализации, между нормальной и злокачественной человеческой слизистой оболочке желудка. Как и следовало ожидать, Kcnq1 и KCNE2 сильно колокализуются в париетальных клетках в нормальной человеческой слизистой оболочки желудка (рис 6 А), как это сделал Kcnq1 и HKA β (Рисунок 6 В). В противоположность этому, в желудочных карцином человека, Kcnq1 и выражение KCNE2 редко перекрываются (рис 6, С, D), даже при том, Kcnq1 сохранил свою сильную совместную локализацию с HKA р (рисунок 6 Е). Таким образом, экспрессия KCNE2 в париетальных клетках редко наблюдается при раке желудка. Отсутствие KCNE2-Kcnq1 совместной локализации было еще более глубоким в аденокарциномы желудка человека (рис 6 F), что опять-таки нераспределенной совместной локализации Kcnq1 и HKA р (рис 6 G).
Обсуждение
<р> Калийные каналы появились в качестве потенциальной мишенью для противораковых терапии [19], в том числе Kcnq1, HERG и Kv2.1, все из которых являются партнерами альфа-субъединицы KCNE2. Нарушается импринтинг, вызванное мутацией в гене Kcnq1 вызывают синдром Беквит-Видемана (BWS), которая предрасполагает к раку [20] - [22], и Kcnq1 Нокаут предрасполагает к желудочной метаплазии [11]. Калиевого канала HERG α-субъединицы, который образует комплексы с вспомогательном субъединицей KCNE2 в сердце человека [23], сверхэкспрессируется в некоторых опухолей, и был идентифицирован как фактор выживания опухоли [24] - [27], как есть KV2. 1 [28].
<р> KCNE2 ранее было установлено, выражается в 2 раза в желудочном ткани рака у человека ниже, чем в соседних нормальных клетках желудка и заставили повышающую регуляцию KCNE2 был антипролиферативное действие на желудочную раковых клеток в пробирке
и вводят в голых мышей [12]. Постулируемая механизм этого антипролиферативного эффекта понижающая регуляция циклин D1, задерживая прогрессии через клеточного цикла [12] аналогично тому, что наблюдалось с блокаторами цизаприд HERG [29]. Повышенная экспрессия циклин D1 в опухолях желудка человека коррелирует с особенно плохим прогнозом [30], поэтому понимание факторов, которые увеличивают экспрессию циклина D1 может привести к терапевтическим путей для этого и других форм рака. Сверхэкспрессия циклин D1 было предложено внести свой вклад в канцерогенеза, нарушая клеточный цикл, и, как сообщается, является важным онкогенными фактором при раке пищевода [31], а также связанная с ядерной накоплением бета-катенина в яичниках эндометриоидных аденокарциномы [32]; ядерная циклин D1 избыточная экспрессия в желчном пузыре карцином является одним из важнейших событий [33].
<р> Здесь мы описываем обширные метапластического изменения в muscosa желудка из-за генетического нарушения Kcne2
. Это связано с выражением циклин D1 увеличилось ядерной в слизистой оболочке желудка, напоминающие результаты предыдущих в пробирке
исследования KCNE2 [12]. Ни в настоящем докладе, ни в предыдущем исследовании, однако, очертить механизм циклин D1 повышающую регуляцию в Kcne2
- /- слизистая оболочка - это следствие метапластических изменений вторичной по отношению к ахлоргидрией у этих мышей, или существует более прямая связь между Kcne2
и циклин D1? Исследование, проведенное Yanglin и коллегами утверждает, за последние, по крайней мере отчасти потому, что в их исследовании изменения циклин D1 произошли в изолированных клетках без влияния ахлоргидрией [12]. Мы считаем, что изменения вторичной по отношению к ахлоргидрии являются наиболее вероятными доминирующим фактором, но прямая связь не может быть исключена. Интересно отметить, что HERG, другой партнер KCNE2, выражается в желудочном раковых клеток, но не нормальные желудочном эпителии, а HERG канала блокатор цизаприд Ранее было установлено, подавляет желудочную рост раковых клеток путем ингибирования вступление в фазу S из G (1) фаза в клеточного цикла, увеличивая апоптоз [29]. Поскольку KCNE2 частично подавляет HERG токи за счет уменьшения унитарную проводимости и ускорения дезактивацию [23], это интригующая возможность, что наблюдаемые антипролиферативные эффекты KCNE2 оверэкспрессии в пробирке
[12] обусловлены HERG текущего подавления содействия апоптоз, и наоборот, что KCNE2 понижающей регуляции или генетического нарушения могут способствовать желудочный клеточную пролиферацию путем увеличения HERG плотности тока
Mice
<р> GCP может присутствовать в человека с перемежающейся боли в эпигастрии, метеоризм, непроходимость желудка или верхних отделов желудочно-кровотечение, и чаще всего встречается у пациентов с историей либо гастрэктомии или гастростомией [34]. Тем не менее, несколько случаев было зарегистрировано без каких-либо ассоциаций с ранее желудочной хирургии [35], [36]. Патогенез человеческого GCP, как полагают, возникают из-за травмы мышечный слизистыми оболочками, что может привести к внематочной улавливанием желудочных желез в подслизистой, мышечной слизистыми оболочками или серозной, или от хронического воспаления. GCP обычно считается доброкачественным клиническое юридическое лицо, хотя ассоциация с раком желудка сообщалось [14], [37], [38].
<Р> У лабораторных животных, GCP вторичной по отношению к HELICOBACTER зр
, Инфекция была описана как предшественник intramucosal дисплазии и неоплазии [39], и связанный с развитием рака желудка. GCP часто находится в H. пилори
-infected монгольских песчанок, которые также разработаны аденокарциномы желудка и лимфоидной гиперплазии [40]. В предыдущей мышиного генетической модели GCP, TGF бета-1 +/- мыши развивали железистые гиперпластические поражения, которые совместно с Морфологические особенности человека GCP, смешанной с воспалительной инфильтрацией окружающих слизистой оболочки и хронического васкулита в тканях, прилегающих к этим поражений [ ,,,0],41]. Здесь, в Kcne2
- /- мышей, ГКП происходит в отсутствие первичного воспалительного поражения, и не зависит от сосудистой облитерации. Вместо этого, мы полагаем, что основным дефектом является потеря -субъединицы KCNE2 из канальных комплексов с KCNQ1, тем самым ухудшая важное верхушечный K + путь рециркуляции в париетальных клетках желудка и предотвращения подкисление париетальных клеток HKA. В то время как это представляет собой «функциональную атрофию 'в популяции париетальных клеток, в предыдущих исследованиях кишечной метаплазией фактическую потерю париетальных клеток, называемых" oxyntic атрофия ", считали важным процессом в этиологии кишечной метаплазией, связанный с кислотой рефлюксной болезни или H. Pylori
инфекции, и является наиболее распространенным метапластический процесс наблюдается в верхних отделах желудочно-кишечного тракта [42].
<р> Oxyntic атрофии при отсутствии значительного воспаления может быть вызвана DMP-777, ингибитор эластазы нейтрофилов, которые также направлена против париетальных клеток из-за его действия в качестве протонофор [43]. Oxyntic атрофии в желудочном-дефицитных мышей, после обработки DMP-777, быстро приводит к TFF2 экспрессирующих метаплазии, называемый также спазмолитическим пептид экспрессирующих метаплазии (SPEM) [44]. SPEM отличается из-за его сильной ассоциации с аденокарциномы желудка человека, и наблюдается в большинстве фундального железы биопсий из человеческого H. Pylori
-infected больных гастрит [45]. Появление SPEM в Kcne2
- /- мышей в отсутствие либо H. пилори
или классический oxyntic атрофия предполагает, что "функциональная атрофия" вызваны Kcne2
удаление может быть достаточно, чтобы вызвать Spem. Одним из основных отличий между Kcne2
- /- мышей, и те в исследовании Нозаки является то, что Kcne2
- /- мышей гипергастринемией, не гастрин-дефицитные. Другим отличием является то, что DMP-777 разрушает желудочный tubulovesicle протонный градиент, не ухудшая H + K + - функция АТФазы, в то время как целевой Kcne2
нарушение препятствует H + /K + -АТФазы функция путем удаления ее подложки люминальную, K + ионов [7], [44]. Возможно, этот последний механизм может в будущем выявить подсказки относительно критических событий в oxyntic атрофии, которые приводят к SPEM: в настоящее время он предположил, что Spem результаты индукции от дефицита в клеточных секретируется регуляторов теменных нормального возобновления слизистой желудка, которые включают в себя Еж Соник и TGF-α [46], [47] из-за потери париетальных клеток. Дальнейшие исследования Kcne2
- /- париетальные клетки - которые все еще присутствуют, но со сбоями - может выявить регуляторы, которые они еще могут секретируют, и те, которые они не могут
<р> слизистую оболочку желудка. из Kcne2
- /- мышей также показывают повышенную экспрессию установленного маркера пролиферации Ki67, проявляющиеся как увеличение ширины полосы через слизистую оболочку пролиферативной, а также Ki67-положительных клеток, выстилающих цист в регионах из опорных точек. Аналогичным образом, де-маркера дифференцировки CK7, не выражается в 1-летний Kcne2
+ /+ слизистую оболочку желудка, широко выражается в том, что из Kcne2
- /- мышей. Принимая эти и маркеры описаны выше вместе, Kcne2
- /- слизистую оболочку желудка проявляет метаплазия с несколькими особенностями preneoplasia, а в некоторых случаях неоплазии, в частности, в определенной патогена среде без каких-либо доказательств желудочной <ЕМ> Helicobacter
инфекция или oxyntic атрофии, а при отсутствии химических ингибиторов желудочной подкисления. Вместе с выводом здесь, что экспрессия теменной клеток KCNE2 как представляется, снижается в желудочном раковой ткани человека (рисунок 4) и в предыдущем докладе, что KCNE2 ингибирует пролиферацию клеток желудка [12], данные свидетельствуют о KCNE2 нарушение связано с развитием рака желудка. Будущие исследования будут включать изучение Kcne2
нарушение увеличивает ли предрасположенность к раку желудка в патогена и канцерогенных на основе протоколов, механизмы, лежащие в этих возможных различий, а также потенциальные механистические связи между Kcne2
, циклин D1 и клеточного цикла возмущение за пределами области ахлоргидрией-ассоциированной этиологии заболевания. Кроме того, как Kcnq1 и KCNE2 также совместно выражены в эпителиальных клетках щитовидной железы, где они имеют важное значение для биосинтеза гормонов щитовидной железы [48], она будет представлять интерес для изучения потенциальной роли KCNE2 в аномальной пролиферации тиреоцитов.
материалы и методы
<р> Все мыши, описанные в данном исследовании, были размещены, использовались и эвтаназии в соответствии с руководящими принципами NIH и Корнельский университет Институциональный уход за животными и использование комитета. Все мыши, описанные в данном исследовании, были размещены, использовались и эвтаназии в соответствии с руководящими принципами NIH и Вейл медицинского колледжа Институциональный уход за животными и использование комитета. Этическое одобрение разводить и собирать урожай ткани от дикого типа и Kcne2
- /- мышей для биомедицинских исследований был одобрен Вейл медицинского колледжа Институциональные уходу и использованию животных комитета (протокол 0704-610A). Kcne2
- /- мышей были получены, как описано ранее из C57BL /6 Kcne2 + /
- х Kcne2 +/-
кресты [7]. Численные данные были проанализированы с помощью программного обеспечения EXCEL (Microsoft) с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с статистической значимости установлен на уровне P
&л;. 0.05
<р> Для гистологии и масса желудка количественное, Kcne2 + /+
и Kcne2
- /- мышей через 3 недели, 3 месяца и 12-15 месяцев были умерщвлены с помощью CO <к югу от> 2 удушья (5-10 генотипа). Желудки были удалены посмертного, желудка массы определяли, затем ткани желудка фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обработана обычными методами и заливали в парафин. Желудочную среду получали срезы с интервалом 5 мкм, помещали на положительно заряженные SuperFrost слайды, окрашивали гематоксилином и эозином (H &Amp; E)., И оценивали с помощью микроскопа Olympus BX45
<р> Иммуногистохимическое обнаружение Ki67, CK-7 и TFF2 (также известный как спазмолитическое пептида) проводили с использованием процессора Discovery XT (Ventana Medical Systems). Концентрации первичных антител использовались: 0,05 мкг /мл (кроличьи поликлональные анти-Ki67, Vector Labs); 1 мкг /мл (мышиное моноклональное анти-CK-7; Abcam); 1 мкг /мл (мышиное моноклональное анти-TFF2; Abcam). Предшествующая первичной инкубации антитела, тканевые срезы блокировали в течение 30 мин в 10% нормальной козьей сыворотки, 2% BSA в PBS (анти-Ki67); 30 мин в 10% нормальной козьей сыворотки, 2% БСА в PBS и авидин /биотин в течение 8 мин (анти-СК-7); 30 мин в 10% нормальной козьей сыворотки, 2% BSA в PBS и авидин /биотин в течение 4 мин (анти-TFF2). Первичные периоды инкубации антител: 3 ч (Ki67 и СК-7); 5 часов (анти-TFF2). Вторичные инкубирование антитела были: 32 мин в 1:200 биотинилированным козьим анти-кроличьим IgG (Vector Labs) для Ki67; 60 мин в 1:200 биотинилированный лошади против мышиного IgG (Vector Labs) для CK-7 и TFF2. Для Ki67 инкубации вторичного антитела, блокатор D, стрептавидин-HRP и набор обнаружения DAB (Ventana Medical Systems) были использованы в соответствии с инструкциями изготовителя. Для CK-7 и TFF2, IgG1 мыши (5 мкг /мл) использовали в качестве отрицательного контроля изотипа, и использовались блокатор D, стрептавидин-HRP и комплект обнаружения ДАБ (Ventana Medical Systems).
<Р> Для циклин обнаружение D1, слайды желудка нагревали при 58-60 ° С в течение 30 мин, а затем депарафинировали. Активность эндогенной пероксидазы блокировали инкубацией секций в 1% -ной перекиси водорода в PBS в течение 15 мин (8,3 мл 30% Н <суб> 2O <суб> 2 /241,7 мл PBS), а затем разоблачении антигенный эпитоп микроволновке в 10 мМ цитрата буфер при высокой мощности в течение 15 мин. Слайды охлаждают в течение 20 мин, промывали в дистиллированной воде в течение 5 минут, переносили в PBS и инкубировали в 10% нормальной лошадиной сыворотки (в 2% БСА-PBS, разбавитель) в течение 30 мин во влажной камере. Мышиные моноклональные анти-циклин D1-антителом (Cell Signaling) добавляли при 1:1000 с 2% BSA в PBS и инкубировали в течение ночи при 4 ° С во влажной камере. Предметные стекла промывали в PBS и вторичного биотинилированного лошади против мышиного антитела IgG (Vector Labs) наносили на 1:500 в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Слайды были промыты и авидинбиотиновом комплекс (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Labs), разведенными 1:25 в PBS наносили в течение 30 мин. Сигнал был обнаружен путем инкубации в 3,3-диаминобензидино (Sigma, Batch No. 026K3767) до достижения желаемой интенсивности цвета. После окончательной промывки в воде, предметные стекла слегка контрастно в гематоксилином. Kcnq1 и HKA β одной маркировки и обнаружения осуществляли, как описано ранее [7]. обнаружение CD34 был с 1:50 анти-CD34 антитела (Abcam). Слайды были просмотрены с помощью микроскопа Nikon Eclipse E600 и фотографировали с помощью камеры RT Color и программного обеспечения SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.).
Иммунофлуоресценции
<р> Все ткани человека была получена из ProSci, Пауэй, CA, и был сертифицирован как будто они были получены из квалифицированных и лицензированных услуг патологии, с использованием соответствующей сообразуйтесь согласия для использования в биомедицинских исследованиях и с защитой от донора анонимности; Поэтому, дополнительный медицинский колледж совета Обзор Institutional Weill утверждение этики не требовалось. обнаружение иммунофлюоресценции HKA р, KCNQ1 и KCNE2 в желудочном ткани человека (ProSci) была выполнена с использованием процессора Discovery XT (Ventana Medical Systems). Были использованы следующие ткани человека: нормальные ткани желудка от 50-летней женщины (PSC-10-809-XB1); карциномы желудка ткани, информация о пациенте недоступна (PSC-10-814-CA1); аденокарциномы желудка ткани от 51-летней женщины (PSC-10-809-xa1). Концентрации первичных антител были использованы: 0,5 мг /мл анти-HKA β (мышиные моноклональные, Affinity биореагентов), 1 мг /мл анти-Kcnq1 (кролик или козьи поликлональные, Хемикон), и в доме анти-KCNE2 сыворотку использовали в 1:500 разведение после того, как на рулевой колонке, обогащая IgG. Предшествующая инкубацию первичное антитело, срезы ткани блокировали в течение 30 мин в 10% нормальной козьей сыворотки, 2% BSA в PBS, а затем 8 мин авидин /биотин блока. Инкубационный первичное антитело (3 ч) последовало 32 мин инкубации с биотинилированным анти-мышиного IgG (ABC комплект из Vector Labs), 60 мин инкубации с биотинилированным анти-козел IgG (ABC комплект из Vector Labs), или биотинилированным анти-кроличий антитела при разведении 1:200 (Vectastain ABC комплект). Вторичный детектирование проводили с стрептавидин-HRP D (Ventana Medical Systems), с последующей инкубацией с Tyramide-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) или Tyramide Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Витражи слайды были просмотрены с Цейсс Axiovert 200 микроскопе с широким полем и фотографии были получены с помощью программного обеспечения Метаморф 7.1 (Molecular Devices).
вестерн-блоттинга
<р> Для вестерн-блоттинга, желудочные мембранные фракции получали, как описано ранее [7]. Три желудки от 12-месячного Kcne2 + /+
и Kcne2
- /- мышей были удалены посмертного, разрезать вдоль curvatura желудочек майор, очищена от рубца и немедленно мгновенно замораживали в жидком азоте. Желудки затем гомогенизируют в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 100 мкг /мл ФМСФ, 1 мкг /мл Нонидет Р40, 0,5% SDS и 0,5% ортованадата натрия, а затем инкубировали на льду в течение 30 мин и центрифугировали при 12000 × г
в течение 20 мин при 4 ° С. концентрация белка в супернатанте измеряли в соответствии с методом Брэдфорда. Общее содержание белка (40 мкг /полоса) загружают в предварительно литые трис-глицин 4-20% гель (Жюль Inc, Милфорд, Коннектикут) и разделяли с помощью электрофореза. Белки переносили на ПВДФ-мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA), и блокировали 5% молока, 0,05% твин-20 в PBS в течение 12 часов при 4 ° С на качалке. инкубирование первичных антител (4 ч, RT в 1% молоко, 0,05% твин-20, ПБС, "буфер А") были: 1:2000 анти-циклин-D1 (Abcam); 1:5000 анти-GAPDH (Abcam). Мембраны промывали 4 раза, через 20 мин каждый с антителом инкубационного буфера, а затем инкубировали с соответствующими вторичными антителами (BioRad), разведенных 1:10000 в буфере А в течение 2 ч при комнатной температуре затем промывают 4 раза по 20 мин каждый раз буфером А, и один раз в течение 5 минут с PBS. Мембраны инкубировали в течение 1 мин с реагентом SuperSignal ЭХЛ ( Пирс
) затем подвергали воздействию на Биомакс тонкую пленку (Kodak), и разработали с использованием RP X-ОМАТ процессор (Kodak).
Подтверждения <
Модель новорожденных мышей дает ключ к разгадке причин разрушительного заболевания кишечника у недоношенных детей с анемией
Бытовые дезинфицирующие средства могут повысить риск ожирения у детей
То, что вы едите, может изменить то, как антибиотики влияют на кишечник
Микробиом кишечника может сыграть роль в тяжелой форме COVID-19
Смесь на основе козьего молока полезна для здоровья кишечника младенцев
Половина используемых лекарств повреждает кишечные бактерии,
Алкоголь повреждает микробиом во рту
Новое исследование показало, что алкоголь изменяет и повреждает естественную бактериальную среду во рту. Исследование под названием, «Употребление алкоголя связано с вариациями в микробиоме ротовой по
Исследование с участием близнецов показывает, что симптомы COVID-19 имеют генетический вклад
Новое исследование опубликовано на сервере препринтов medRxiv из Королевского колледжа, Лондон, предполагает, что генетический состав человека может повлиять на то, насколько человек может пострадат
Ученые разрабатывают пептиды, которые восстанавливают баланс кишечных бактерий и предотвращают атеросклероз.
Исследователи продолжают изучать роль кишечных бактерий на здоровье. включая его связь с депрессией, аутоиммунные заболевания, душевное здоровье, и ожирение. Теперь, Команда ученых Scripps Research