PLOS ONE: Orientados supresión de KCNE2 causa gastritis quística profunda y gástrico Neoplasia

Extracto

El cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo. Los factores predisponentes son aclorhidria, Helicobacter pylori
, atrofia y metaplasia oxínticas TFF2 expresan. En las células parietales, los canales de potasio apical que comprenden la subunidad α KCNQ1 y las β KCNE2 subunidad proporcionar una corriente de K <sup>+ flujo de salida para facilitar la secreción de ácido gástrico por la apical H + K + ATPasa. En consecuencia, la eliminación genética de murino Kcnq1
o KCNE2
deteriora la secreción de ácido gástrico. Otra evidencia ha sugerido un papel para KCNE2 en la proliferación de células de cáncer gástrico humano, independiente de su papel en la acidificación gástrica. Aquí, nos demuestran que 1 años de edad, KCNE2
- /- ratones en un ambiente libre de patógenos todas exhiben una severa gástrica que comprende fenotipo preneoplásicas profunda gastritis quística, 6-fold aumento de la masa de estómago, aumento Ki67 y la expresión de ciclina D1 nuclear y TFF2- y citoqueratina 7-expresión de la metaplasia. Algunos KCNE2
- /- ratones también mostraron adenomas polipoides pilórico que se extienden hacia el duodeno, y la invasión neoplásica de vasos de paredes finas en la sub-mucosa. Por último, el análisis de tejido de cáncer gástrico humano indicó reducida célula parietal expresión KCNE2. Junto con los resultados anteriores, los resultados sugieren la interrupción KCNE2 como un posible factor de riesgo de neoplasia gástrica</sup>

Visto:. Roepke los conocimientos tradicionales, Purtell K, Rey CE, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) deleción dirigida de KCNE2 ¿Qué causa la gastritis quística profunda y la neoplasia gástrica. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10.1371 /journal.pone.0011451

Editor: Xin Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China

Recibido: 3 Mayo 2010; Aceptado el 13 de junio de 2010; Publicado: 6 Julio 2010

Derechos de Autor © 2010 Roepke et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. G.W.A. es apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre, Institutos Nacionales de Salud (R01 HL079275), la Asociación Americana del Corazón (Grant-in-Aid 0855756D), y un Premio Irma T. Hirschl Carrera Scientist. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico sigue siendo una de las principales causas de mortalidad, y la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo. carcinogénesis gástrica es un proceso que progresa a través de múltiples etapas incluyendo atrofia oxíntica, la formación de úlceras, hiperplasia foveolar, hipo e aclorhidria y metaplasia de células mucosas [1]. A pesar de los avances en el tratamiento del cáncer gástrico, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos moleculares implicados en la carcinogénesis gástrica, el desarrollo de la mucosa gástrica normal en las lesiones gástricas preneoplásicas o el papel potencial de los canales iónicos en estos procesos.

parietal células lograr la acidificación gástrica en virtud de un apical H ^{+ K + ATPasa (HKA) que bombea protones en el lumen del estómago a cambio de K + iones. Para mantener esta actividad, K iones + debe viajar desde la célula parietal en el lumen del estómago a través de la membrana apical, para asegurar substrato continuo para la HKA [2]. Este flujo de salida de K + iones se produce a través de uno o más tipos de apical, K + - canales selectivos. Varios rectificador interno (KIR) canales están implicados en este proceso basado en la expresión de células parietales y pruebas farmacológicas [3], [4], pero hasta el momento no hay evidencia genética para un solo canal de cumplimiento de esta función: KCNE2-KCNQ1 [5] - [7]. KCNQ1 es un dominio de seis transmembrana α subunidad de la superfamilia de S4, que forma funcional, dependiente de voltaje, homotetramérica K + - canales selectivos en los estudios de expresión heteróloga [8], [9]. KCNQ1 también pueden formar complejos de canales heteroméricos con subunidades auxiliares de la familia de genes KCNE, y los cinco productos génicos conocidos KCNE se ha demostrado que regular la función de KCNQ1 en los estudios de expresión heteróloga [10]. Uno, KCNE2, KCNQ1 convierte en un canal independiente del voltaje, constitutivamente activo cuya corriente se incrementa en un pH bajo. KCNE2 y KCNQ1 se expresaron tanto en, o cerca a la membrana apical de las células parietales, y dirigidos deleción del gen de cualquiera de los resultados de subunidades en aclorhidria debido al deterioro de la secreción de ácido gástrico [5] - [7]. Por lo tanto los canales KCNQ1-KCNE2 se consideran esenciales para la secreción de ácido gástrico y cree que permitirán luminal K + iones como sustrato para la HKA gástrica}

Kcnq1
<sup>-. /- ratones y KCNE2
- /- ratones muestran fenotipos gástricas similares, caracterizados por aclorhidria, hipergastrinemia e hiperplasia glandular gástrica [5] - [7]. Las células parietales de cualquiera espectáculo nula ~ 10 veces menor capacidad de recuperarse de la carga de protones, lo que sugiere un defecto primario en la secreción de ácido gástrico. Kcnq1
- /- ratones también desarrollan metaplasia, displasia y la hiperplasia adenomatosa pre-malignas del estómago independiente de la infección [11]. Esto sugiere que la disfunción KCNQ1 podría conducir a la neoplasia gástrica independientes de H. pylori
debido a la severa aclorhidria, ni representa un factor de riesgo adicional que, en relación con H. pylori
podría predisponer al cáncer gástrico</sup>

La aclorhidria gástrica y la hiperplasia hemos observado previamente en KCNE2
<sup>-. /- ratones fue sorprendente dado que la subunidad formadora de poros de la compleja, KCNQ1, todavía estaba presente, y de hecho se expresa fuertemente en el doble del número de células por la glándula gástrica en KCNE2
- /- ratones en comparación con KCNE2
+ /+ ratones [7]. En un estudio reciente, se encontró que la expresión de KCNE2 que se expresa a niveles relativamente bajos en tumores gástricos humanos y en líneas celulares de cáncer gástrico; Además, forzada sobre-expresión de KCNE2 suprimieron el crecimiento de células de cáncer gástrico humano en cultivo de tejidos, y en ratones nude [12]. Estos hallazgos plantean la intrigante posibilidad de que KCNE2 pudieran estar implicados en la carcinogénesis gástrica, y potencialmente independiente de cualquiera de H. pylori
infección o aclorhidria. En este caso, para definir mejor el papel potencial de KCNE2 en la regulación del crecimiento normal de las células gástricas, se escrutó la patología gástrica de KCNE2
- /-. Ratones de hasta 15 meses de edad</sup>

resultados

KCNE2 ^{- /- ratones muestran
hiperplasia gástrica progresiva}

Hemos demostrado anteriormente que se requiere KCNE2 para la regulación normal del crecimiento de las células de la mucosa gástrica: 3- meses de edad KCNE2
<sup>- /- ratones tienen hiperplasia gástrica, aclorhidria y la morfología de las células parietales anormales [7]. Aquí comparamos la masa de estómago, de 3 semanas, 3-mes- y 12-15 meses de edad KCNE2
- /- ratones. La masa de los estómagos a las 3 semanas de edad fueron similares para KCNE2 + /+
y KCNE2
- /- ratones, mientras que a los 3 meses hubo hiperplasia gástrica significativa en KCNE2
- /- ratones. Esta diferencia se había incrementado en 12-15 meses en la medida en que KCNE2
- /- ratones tenían estómagos 6 veces mayores que los de KCNE2 + /+ ratones
de la misma edad (Figura 1 a)</sup>

KCNE2 ^{-. /- ratones muestran
gastritis quística profunda}

Incluso a las 3 semanas de edad, a pesar de estómago similares masa a la de KCNE2 <sup>+ /+ ratones
, mucosa gástrica de KCNE2
- /- ratones mostraron ya vacuolations cerca del lado basolateral (Figura 1 B; engrandecido en D). Para investigar la progresión de la hiperplasia gástrica y sus consecuencias, un total de once meses de edad 12-15 KCNE2
- /- ratones y cinco KCNE2 + /+
los ratones se examinaron histológicamente. La mucosa gástrica en todo KCNE2
- /- ratones mostraron hipertrofia glandular y la hiperplasia difusa con aumento del número de células mucosas y las células parietales que se vacúolos de vez en cuando (Figura 1 C). Sorprendentemente, la gastritis quística profunda (GCP) se observó en 11/11 KCNE2
- /- ratones, pero 0/5 de la KCNE2
+ /+ ratones ( χ 2 p = 0,002
) (ampliación de quiste en la Figura 1 E). glándulas dilatadas contenían restos celulares y, en algunos pero no todos los KCNE2
- /- ratones, los neutrófilos. También había hialinosis epitelial gástrica intraluminal con cristales de vez en cuando, y los agregados linfoplasmacíticas en la mucosa, submucosa y muscular. En algunos 12-15 meses de edad KCNE2
- estómagos de ratón, prominente lámina fibrosis proprial se observó, sobre todo en las capas superficiales - /. GCP, también denominado previamente a pseudotumor gástrico como benignos, presenta generalmente como un espectro de cambios hiperplásicos y metaplasia siguientes daños en la mucosa gástrica. Mientras GCP demuestra características histológicas asociadas con la malignidad, es en sí mismo generalmente se consideran funcionalmente benigna - aunque se ha sugerido como un posible factor de riesgo para el cáncer gástrico [13], [14]</sup>

El aumento de los marcadores de proliferación en gástrico. mucosa de KCNE2 ^{- /- ratones}

Es importante destacar que la expresión de marcadores establecidos preneoplásicas se incrementó en KCNE2
<sup>- /- ratones en comparación con KCNE2
+ /+. antígeno Ki67 es una proteína nuclear relacionadas con el ciclo celular usado comúnmente como un marcador de proliferación en la proliferación y tejidos neoplásicos, incluyendo el estómago [15]. tinción Ki67 en las secciones de KCNE2
+ /+ estómagos de ratón (3 meses) indicaron un pequeño grupo de células positivas para Ki67 dentro de las regiones del istmo de las glándulas gástricas, mientras que este compartimento proliferativo se amplió de manera significativa en la edad emparejado KCNE2
- /- ratones (Figura 2 A-C). Epitelio de revestimiento de áreas quísticas del GCP en 12 meses de edad KCNE2
- /-. Ratones también demostró tinción prominente de los núcleos con Ki67, indicativo de una alta tasa de proliferación (Figura 2 B)</sup>

citoqueratina (CK) -7 es un polipéptido de 54 kDa expresada en una amplia variedad de tejidos epiteliales, incluyendo de pulmón, mama y estómago humano fetal; Sin embargo, no se expresa en el epitelio gastrointestinal adulto normal [16]. La regulación positiva de la CK-7, indicativo de desdiferenciación, fue evidente en KCNE2
<sup>- /- mucosa gástrica a los 12 meses; en emparejados por edad KCNE2
+ /+ ratones, la mucosa gástrica células epiteliales positivas eran mucho menos frecuentes (Figura 2 D). CK-7 también fue prominente alrededor de quistes (Figura 2 E) guía</sup>

metaplasia TFF2 expresan en la mucosa gástrica de KCNE2 ^{-. /- Ratones}

Trefoil- factor familiar (TFF) 2-expresión de la metaplasia se asocia con la progresión a cáncer gástrico en los seres humanos, y en jerbos mongoles infectados con H. pylori
[17]. mucosa gástrica de KCNE2
^{- /- ratones zonas de metaplasia con expresión TFF2 prominentes, incluyendo en las células epiteliales que revisten los quistes expuestas (Figura 3 A-C). TFF2-expresión de metaplasia se asocia típicamente con la atrofia oxíntica, caracterizado como una pérdida de células parietales [1]. A continuación, analizamos la mucosa gástrica de los ratones de 12 meses de edad, con metaplasia TFF2 expresan para la expresión de la subunidad β HKA (HKA β), un marcador de las células parietales. Sorprendentemente, no hubo evidencia de atrofia oxíntica en términos de número de células parietales (Figura 4 A). Además, β HKA se expresó en las células que revisten los quistes (Figura 4 B) guía}

El aumento de la mucosa gástrica expresión de ciclina D1 y la neoplasia gástrica en KCNE2 ^{-. /- Ratones}

expresión KCNE2 reducido se sugirió anteriormente para aumentar la proliferación en el SGC7901 línea celular de cáncer gástrico a través de aumento de la expresión de la ciclina D1 [12]. Aquí, transferencias western sugirieron que KCNE2
deleción del gen incremento en la expresión total de ciclina D1 en la mucosa gástrica de los ratones de 12 meses de edad (Figura 5 A). Ciclina D1 mostró débil expresión y predominantemente citoplasmática en la base de KCNE2
<sup>+ /+ oxínticas glándulas (Figura 5 B, C, paneles de la izquierda), como se ha descrito anteriormente para las células normales, que proliferan en el estómago de ratón [ ,,,0],18]. Por el contrario, en KCNE2
- /- ratones, ciclina D1 mostraron tinción más generalizada y nuclear en la región del Istmo de cuello de las glándulas gástricas, y el hoyo glandular (Figura 5 B, C, paneles de la derecha). En dos de las once 1-años de edad KCNE2
- /- se observaron ratones analizados, adenomas polipoides pilórica, que se extiende en el duodeno (Figura 5 D). Los mismos dos KCNE2
- /- ratones también mostraron crecimiento neoplásico en forma de trombos compuesta de fibrina y el epitelio glandular, en los vasos de paredes delgadas (identificado usando marcador endotelial CD34) dentro de la submucosa gástrica ( Figura 5 e-H).</sup>

célula parietal reducción de la expresión de KCNE2 en el tejido de cáncer gástrico humano

Teniendo en cuenta que en un estudio previo se encontró una expresión reducida de KCNE2 para mejorar proliferación de la línea celular de cáncer gástrico, y KCNE2 se encontró expresión a reducirse en el cáncer gástrico humano [12], se examinó la expresión de KCNE2 en la mucosa gástrica humana normal y el tejido de cáncer gástrico. Los estudios de inmunofluorescencia revelaron diferencias llamativas con respecto a KCNE2 y KCNQ1 co-localización, entre mucosa gástrica humana normal y maligno. Como era de esperar, KCNQ1 y KCNE2 co-localizan con fuerza en las células parietales en la mucosa gástrica humana normal (Figura 6 A), al igual que KCNQ1 y β HKA (Figura 6 B). En contraste, en los carcinomas gástricos humanos, KCNQ1 y expresión KCNE2 rara vez se superponen (Figura 6 C, D), a pesar de KCNQ1 conservó su fuerte co-localización con β HKA (Figura 6 E). Por lo tanto, la expresión de KCNE2 en las células parietales se observa raramente en el carcinoma gástrico. La falta de KCNE2-KCNQ1 co-localización fue aún más profundo en adenocarcinoma gástrico humano (Figura 6 F), que a su vez retenido co-localización de KCNQ1 y HKA β (Figura 6 G).

Discusión

Los canales de potasio en los trastornos proliferativos

Los canales de potasio se han convertido en un objetivo potencial para terapias contra el cáncer [19], incluyendo KCNQ1, hERG y Kv2.1, todos los cuales son socios de la subunidad alfa de KCNE2. impresión interrumpido causada por mutaciones en el gen KCNQ1 síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS), que predispone al cáncer [20] - [22], y el golpe de gracia KCNQ1 predispone a la metaplasia gástrica [11]. El canal de potasio hERG α subunidad, que forma complejos con la subunidad accesoria KCNE2 en corazón humano [23], se sobreexpresa en algunos tumores, y se ha identificado como un factor de supervivencia del tumor [24] - [27] como tiene KV2. 1 [28].

KCNE2 se encontró previamente que se expresa 2 veces menor en el tejido de cáncer gástrico humano que en las células gástricas normales vecinos, y la regulación positiva de KCNE2 obligado habían efectos antiproliferativos sobre células de cáncer gástrico in vitro
y se inyecta en ratones desnudos [12]. El mecanismo postulado para este efecto anti-proliferativo es baja regulación de la ciclina D1, retrasar la progresión a través del ciclo celular [12] similar a lo que se observó con el bloqueador de cisaprida hERG [29]. elevada expresión de ciclina D1 en los tumores gástricos humanos se correlaciona con un pronóstico especialmente pobre [30], por lo tanto, los factores que aumentan la expresión de ciclina D1 puede conducir a vías terapéuticas para esta y otras formas de cáncer comprensión. La sobreexpresión de la ciclina D1 se ha sugerido para contribuir a la oncogénesis por perturbar el ciclo celular, y se ha informado que es un factor oncogénico importante en el carcinoma de esófago [31], y se asocia con la acumulación nuclear de β-catenina en adenocarcinomas endometrioides de ovario [32]; nuclear Sobreexpresión de ciclina D1 en los carcinomas de vesícula biliar es un evento crítico [33]
.

A continuación, describimos amplios cambios de metaplasia en el muscosa gástrica debido a la interrupción genética de KCNE2
. Esto se asocia con un aumento de la expresión nuclear de ciclina D1 en la mucosa gástrica, que recuerda a los resultados de anteriores in vitro
estudios de KCNE2 [12]. Ni el informe actual ni el anterior estudio, sin embargo, delinear el mecanismo para la regulación positiva de ciclina D1 en KCNE2
^{- /- mucosa - que es una consecuencia de los cambios de metaplasia secundaria a aclorhidria en estos ratones, o es existe una asociación directa entre más KCNE2 Opiniones y ciclina D1? El estudio de Yanglin y colegas argumenta a favor de este último, al menos en parte, porque en su estudio de los cambios de ciclina D1 se produjo en células aisladas sin la influencia de aclorhidria [12]. Consideramos que los cambios secundarios a aclorhidria son el factor más probable es dominante, pero un enlace directo no se puede excluir. Curiosamente, hERG, otro socio de KCNE2, se expresa en células de cáncer gástrico, pero no es normal epitelios gástrico, y la cisaprida bloqueador de los canales hERG se encontró previamente para suprimir el crecimiento de células de cáncer gástrico mediante la inhibición de la entrada en fase S de G (1) de fase en el ciclo celular, el aumento de la apoptosis [29]. Debido a KCNE2 suprime parcialmente las corrientes de hERG mediante la reducción de la conductancia unitaria y acelerando la desactivación [23], es una intrigante posibilidad de que los observados efectos antiproliferativos de KCNE2 sobreexpresión in vitro
[12] se deben a la supresión de corriente de hERG la promoción apoptosis, y por el contrario que KCNE2 baja regulación o la interrupción genética puede favorecer la proliferación celular gástrica mediante el aumento de la densidad de corriente de hERG}

GCP y metaplasia TFF2 que expresan (SPEM) en KCNE2 ^{-. /-
ratones
p> GCP}

En animales de laboratorio, GCP secundaria a Helicobacter sp
. la infección se ha descrito como un predecesor de la displasia y neoplasia intramucoso [39], y se asocia con el desarrollo de carcinoma gástrico. GCP se encuentra con frecuencia en H. pylori
jerbos de Mongolia infectados que también desarrollaron adenocarcinoma gástrico y la hiperplasia linfoide [40]. En un modelo murino genética previa de la BPC, TGF-beta 1 <sup>+/- ratones desarrollaron lesiones hiperplásicas glandulares que comparten características morfológicas de las BPC humana, con infiltración inflamatoria mixta de la mucosa circundante y vasculitis crónica en los tejidos adyacentes a estas lesiones [ ,,,0],41]. Aquí, en KCNE2
- /- ratones, GCP se produce en ausencia de una lesión inflamatoria primaria, e independiente de la obliteración vascular. En lugar de ello, proponemos que el defecto primario es la pérdida de la subunidad β de KCNE2 de los complejos de canal con KCNQ1, perjudicando de este modo un importante K + vía de reciclaje apical en las células parietales y la prevención de la acidificación gástrica por la célula parietal HKA. Si bien esto representa una "atrofia funcional" en la población celular parietal, en estudios previos de metaplasia intestinal una pérdida real de las células parietales, denominado 'atrofia oxíntica', se consideró un proceso importante en la etiología de la metaplasia intestinal, asociada con la enfermedad de reflujo ácido o H. pylori
infección, y es el proceso de metaplasia más común observado en el tracto gastrointestinal superior [42]
.</sup>

atrofia oxínticas en ausencia de inflamación significativa puede ser inducida por DMP-777, un inhibidor de la elastasa de neutrófilos, que también actúa sobre las células parietales debido a su acción como un protonóforo [43]. atrofia oxínticas en ratones deficientes en gástricos, después del tratamiento con DMP-777, conduce rápidamente a metaplasia TFF2 expresan, también referido como espasmolítico péptido expresar metaplasia (SPEM) [44]. SPEM es notable debido a su fuerte asociación con adenocarcinoma gástrico humano, y se observa en la mayoría de las biopsias de la glándula fúndica de H humana. pylori
pacientes con gastritis infectados [45]. La aparición de SPEM en KCNE2
<sup>- /- ratones en ausencia de cualquiera de H. pylori
o atrofia oxínticas clásico sugiere que el 'atrofia funcional "causado por KCNE2
eliminación puede ser suficiente para desencadenar SPEM. Una diferencia importante entre los KCNE2
- /- ratones y los del estudio es que Nozaki KCNE2
- /- ratones son hipergastrinémicos, no deficientes en gastrina. Otra diferencia es que DMP-777 interrumpe un gradiente de protones gástrica tubulovesicle sin perjudicar H + K + - ATPasa función, mientras apuntado KCNE2
interrupción impide H + /K + -ATPasa función mediante la eliminación de su sustrato luminal, K + iones [7], [44]. Tal vez este último mecanismo puede en el futuro revelar pistas con respecto a los eventos críticos en la atrofia oxínticas que resultan en SPEM: se sugiere actualmente que los resultados de inducción SPEM de una deficiencia en los reguladores secretada por células parietales de renovación normal de la mucosa gástrica, que incluyen sonic, TGF-α [46], [47] debido a la pérdida de las células parietales. Otros estudios de KCNE2
- /- las células parietales - que todavía están presentes, pero funciona mal - puede revelar reguladores que todavía pueden secretar, y los que no pueden</sup>

La mucosa gástrica. de KCNE2
<sup>- /- ratones también muestran una mayor expresión del marcador de proliferación Ki67 establecido, que se manifiesta como un aumento en el ancho de la banda de proliferación de la mucosa, y como las células Ki67 positivas que recubre los quistes en las regiones de GCP. Del mismo modo, la CK7 marcador de desdiferenciación, no se expresa en 1 años de edad, KCNE2
+ /+ mucosa gástrica, se expresa ampliamente en el de KCNE2
- /- ratones. Tomando estos y los marcadores se ha descrito anteriormente en conjunto, la KCNE2
- /- gástrico exposiciones mucosa metaplasia con múltiples características de preneoplasia, y en algunos casos la neoplasia, en particular en un entorno específico libre de patógenos sin evidencia de gástrico Helicobacter
infección o atrofia oxíntica, y en ausencia de inhibidores químicos de la acidificación gástrica. Junto con el hallazgo aquí que la expresión de KCNE2 célula parietal parece reducirse en el tejido de cáncer gástrico humano (Figura 4) y el informe anterior de que KCNE2 inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico [12], los datos sugieren interrupción KCNE2 se asocia con la progresión del cáncer gástrico. Los estudios futuros implicarán examinar si KCNE2
interrupción aumenta la predisposición al cáncer gástrico dentro de los protocolos de patógenos y por motivos de carcinógenos, los mecanismos que subyacen a estas posibles diferencias, y los posibles vínculos entre mecanicistas KCNE2
, Ciclina D1 y la perturbación del ciclo celular fuera del ámbito de la etiología de la enfermedad asociada a aclorhidria. Además, como KCNQ1 y KCNE2 son también co-expresan en las células epiteliales de la tiroides, en los que son importantes para la biosíntesis de la hormona tiroidea [48], que será de interés para examinar un posible papel de KCNE2 en la proliferación anormal tirocito.</sup>

Materiales y Métodos

Generación y uso de ratones con genes dirigidos

Todos los ratones descritos en este estudio fueron alojados, utilizados y sacrificados según las directrices de NIH y la Universidad de Cornell Institucional de Cuidado de Animales y el empleo. Todos los ratones descritos en este estudio fueron alojados, utilizados y sacrificados según las directrices de NIH y Weill Medical College Institucional de Cuidado de Animales y el empleo. La aprobación ética para reproducirse y el tejido de la cosecha de tipo salvaje y KCNE2
<sup>- /- ratones para la investigación biomédica fue aprobado por el Weill Medical College Institucional Cuidado de Animales y el empleo (protocolo 0704-610A). KCNE2
- /- ratones fueron generados como se ha descrito anteriormente de ratones C57BL /6 KCNE2 + /
- x KCNE2 +/-
cruces [7]. Los datos numéricos fueron analizados con el programa Excel (Microsoft) utilizando un análisis de varianza (ANOVA) con significación estadística fijado en P
. < 0,05</sup>

Histología

Para histología y la masa de estómago cuantificación, KCNE2 <sup>+ /+
y KCNE2
- /- ratones a las 3 semanas, 3 meses y 12-15 meses se sacrificaron usando CO _{2 asfixia (5-10 por genotipo). Los estómagos se retiraron post mortem, el estómago se determina la masa, a continuación, el tejido del estómago se fijó en formalina al 10% tamponada neutra, procesada por métodos de rutina y embebidos en parafina. secciones de la mucosa gástrica se cortaron a 5 micras intervalos, colocados sobre portaobjetos Superfrost cargados positivamente, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E)., y se evaluaron con un microscopio Olympus BX45}</sup>

Inmunohistoquímica

detección inmunohistoquímica de Ki67, CK-7 y TFF2 (también conocido como péptido espasmolítico) se realizó usando un procesador de Descubrimiento XT (Ventana Medical Systems). Las concentraciones de anticuerpos primarios utilizados fueron: 0,05 g /ml (policlonal de conejo anti-Ki67, Vector Labs); 1 g /ml (anticuerpo monoclonal de ratón anti-CK-7; Abcam); 1 g /ml (anticuerpo monoclonal de ratón anti-TFF2; Abcam). Precediendo incubación del anticuerpo primario, las secciones de tejido se bloquearon durante 30 min en 10% de suero normal de cabra, 2% de BSA en PBS (anti-Ki67); 30 min en suero de cabra normal 10%, 2% de BSA en PBS y avidina /biotina para 8 min (anti-CK-7); 30 min en 10% de suero normal de cabra, 2% de BSA en PBS y avidina /biotina para 4 min (anti-TFF2). tiempos de incubación de anticuerpos primarios fueron: 3 horas (Ki67 y CK-7); 5 horas (anti-TFF2). incubaciones de anticuerpos secundarios fueron: 32 min en 1:200 biotina de cabra anti-IgG de conejo (Vector Labs) para Ki67; 60 min en 1:200 caballo biotinilado anti-ratón IgG (Vector Labs) para CK-7 y TFF2. Para Ki67 de incubación de anticuerpo secundario, Bloqueador D, estreptavidina-HRP y kit de detección de DAB (Ventana Medical Systems) se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para CK-7 y TFF2, IgG1 de ratón (5 mg /ml) se utilizó como un control negativo de isotipo, y se utilizaron Bloqueador D, estreptavidina-HRP y kit de detección de DAB (Ventana Medical Systems).

Para Ciclina detección D1, diapositivas estómago se calentaron a 58-60 ° C durante 30 min y después se desparafinaron. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada por secciones incubando en peróxido de hidrógeno al 1% en PBS durante 15 min (8,3 ml de 30% de H _{2O 2 /241,7 ml de PBS), seguido de desenmascaramiento del epítopo antigénico en el microondas en citrato 10 mM tampón a alta potencia durante 15 minutos. Los portaobjetos se enfrió durante 20 min, se lavaron en agua destilada durante 5 min, se transfirió a PBS y se incubaron en suero de caballo normal al 10% (en 2% BSA-PBS diluyente) durante 30 minutos en una cámara húmeda. Se añadió ratón monoclonal anti-ciclina D1-anticuerpo (Señalización Celular) en 1:1000 con 2% de BSA en PBS y se incubó durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. Los portaobjetos se enjuagaron en PBS y se aplicó el anticuerpo anti-ratón IgG de caballo biotinilado secundario (Vector Labs) en 1:500 en PBS durante 30 min a TA. Las láminas fueron lavadas y un complejo (Vectastain ABC Kit Elite, Vector Labs) avidina-biotina diluido a las 1:25 en PBS se aplicó durante 30 minutos. La señal se detectó por incubación en 3,3-diaminobencidina (Sigma, Nº de lote 026K3767) hasta que se alcanzó la intensidad de color deseada. Después de lavados finales en agua, diapositivas fueron ligeramente counterstained en hematoxilina. KCNQ1 y HKA β sola etiquetado y detección se realizaron como [7] se describe anteriormente. detección de CD34 era con 1:50 de anticuerpo anti-CD34 (AbCam). Las láminas fueron vistos con un microscopio Nikon Eclipse E600 y se fotografiaron usando una cámara RT color y el software SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.).}

inmunofluorescencia

Todo el tejido humano se obtuvo de ProSci, Poway, CA, y fue certificado como obtenidos a partir de los servicios de patología cualificados y con licencia, utilizando apropiada conformada consentimiento para su uso en la investigación biomédica y la protección del anonimato de los donantes; Por lo tanto, no se requiere la aprobación adicional de la ética Weill Medical College Junta de Revisión Institucional. la detección de inmunofluorescencia de β HKA, KCNQ1 y KCNE2 en el tejido gástrico humano (ProSci) se realizó usando un procesador de Descubrimiento XT (Ventana Medical Systems). Se utilizaron los siguientes tejidos humanos: el tejido normal del estómago de una mujer de 50 años de edad (PSC-10-809-XB1); tejido de carcinoma gástrico, la información del paciente no está disponible (PSC-10-814-CA1); tejidos adenocarcinoma gástrico de una mujer de 51 años de edad (PSC-10-809-XA1). Las concentraciones de anticuerpos primarios utilizados fueron: 0,5 mg /ml anti-β HKA (monoclonales de ratón, Affinity Bioreagents), 1 mg /ml anti-KCNQ1 (conejo o de cabra policlonal, Chemicon), y suero anti-KCNE2 en-casa fue utilizada en una dilución 1:500 después de IgG columna enriquecedoras. Antes de la incubación del anticuerpo primario, las secciones de tejido se bloquearon durante 30 min en el suero de cabra normal al 10%, 2% de BSA en PBS, seguido de 8 min bloque de avidina /biotina. La incubación del anticuerpo primario (3 hr) fue seguido por 32 min de incubación con biotina anti-IgG de ratón (ABC kit de Vector Labs), 60 min de incubación con IgG biotinilada anti-cabra (kit ABC de Vector Labs), o con biotina anti-conejo anticuerpo a 1:200 dilución (kit Vectastain ABC). La detección secundaria se realizó con estreptavidina-HRP D (Ventana Medical Systems), seguido de incubación con tiramida-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) o tiramida Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Los cortes teñidos fueron vistos con un microscopio Zeiss Axiovert 200 de campo amplio e imágenes fueron adquiridas mediante el software MetaMorph 7.1 (Molecular Devices).

Western Blot

Para el Western Blot, fracciones de la membrana gástrica se prepararon como se ha descrito previamente [7]. Tres estómagos de 12 meses de edad KCNE2 <sup>+ /+
y KCNE2
- /- ratones fueron retirados post mortem, abiertos cortado a lo largo de la curvatura mayor ventriculi, limpiado de la ingesta e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido. Los estómagos se homogeneizaron en un tampón que contiene 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 100 ug /ml de PMSF, 1 ug /ml de Nonidet P40, 0,5% SDS y ortovanadato de sodio 0,5%, después se incubó en hielo durante 30 min y se centrifugó a 12000 × g
durante 20 min a 4 ° C. La concentración de proteína del sobrenadante se midió de acuerdo con el método de Bradford. La proteína total (40 g /carril) se cargó en un pre-cast tris-glicina al 4-20% de gel (Jule Inc, Milford, CT) y se separó por electroforesis. Las proteínas se transfirieron entonces a una membrana de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA), y se bloquearon con 5% de leche, 0,05% de Tween-20 en PBS durante 12 horas a 4 ° C en un agitador. incubaciones anticuerpo primario (4 hr, RT en 1% de leche, 0,05% de Tween-20, PBS, 'Buffer A') fueron: 1:2000 anti-ciclina D1 (Abcam); 1:5000 anti-GAPDH (Abcam). Las membranas se lavaron 4 veces, 20 minutos cada uno con tampón de incubación de anticuerpo después se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados (BioRad) diluido 1:10000 en tampón A durante 2 horas a RT luego se lavó 4 x 20 minutos cada uno con tampón A y una vez durante 5 min con PBS.</sup>

• PLoS Pathogens: caveolina-1 protege a los ratones contra B6129 gastritis por Helicobacter pylori
• PLOS ONE: Virus de Epstein Barr y el Helicobacter pylori Co-Infección Positivamente se asocian con gastritis aguda en pacientes pediátricos