PLoS ONE: Gerichte Schrapping van KCNE2 Oorzaken Gastritis cystica Profunda en Gastric neoplasie

Abstract

Maagkanker is de tweede belangrijke oorzaak van kanker overlijden wereldwijd. Predisponerende factoren omvatten achloorhydrie, Helicobacter pylori
infectie, oxyntic atrofie en-TFF2 uitdrukken metaplasie. In pariëtale cellen, apicale kaliumkanalen die het KCNQ1 α subunit en de KCNE2 β subeenheid te voorzien van een K <sup>+ efflux stroom aan maagzuursecretie door de apicale H + K + ATPase vergemakkelijken. Dienovereenkomstig genetische schrapping van muizen KCNQ1 golfreizen of KCNE2
schaadt maagzuursecretie. Ander bewijs heeft een rol voor KCNE2 in de menselijke maag-proliferatie van kankercellen, onafhankelijk van haar rol in de maag verzuring voorgesteld. Hier laten we zien dat de 1-jarige KCNE2
- /- muizen in een pathogeen-vrije omgeving allemaal vertonen een ernstige maag-preneoplastische fenotype omvat gastritis cystica profunda, 6-voudig verhoogd maag massa toegenomen Ki67 en nucleaire cycline D1 meningsuiting en TFF2- en cytokeratine 7 tot expressie metaplasie. Sommige KCNE2
- /- muizen ook tentoongesteld pyloric polypoid adenomen zich uitstrekt tot in de twaalfvingerige darm, en neoplastische invasie van dunwandige schepen in de sub-slijmvlies. Tot slot, de analyse van menselijke maagkanker weefsel aangegeven verminderde pariëtale cel KCNE2 expressie. Samen met eerdere bevindingen, de resultaten suggereren KCNE2 verstoring als een mogelijke risicofactor voor de maag neoplasie</sup>

Visum:. Roepke TK, Purtell K, Koning EG, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) gericht wissen van KCNE2
Oorzaken Gastritis cystica Profunda en Gastric neoplasie. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10.1371 /journal.pone.0011451

Editor: Xin-yuan Guan, de Universiteit van Hong Kong, China

Ontvangen: 3 mei 2010; Geaccepteerd: 13 juni 2010; Gepubliceerd: 6 juli 2010

Copyright: © 2010 Roepke et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. G.W.A. wordt ondersteund door de National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health (R01 HL079275), de American Heart Association (Grant-in-Aid 0855756D), en een Irma T. Hirschl Career Scientist Award. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker blijft een van de belangrijkste oorzaken van sterfte en de tweede belangrijke oorzaak van kanker overlijden wereldwijd. Gastric carcinogenese is een proces dat door meerdere stadia vordert waaronder oxyntic atrofie, de vorming van maagzweren, foveolar hyperplasie, hypo- en achloorhydrie en slijm cel metaplasie [1]. Ondanks vooruitgang in de behandeling van maagkanker, relatief weinig bekend over de moleculaire mechanismen maagkanker, de ontwikkeling van normale maagslijmvlies in preneoplastische gastrische lesies of de potentiële rol voor ionkanalen bij deze processen.

Pariëtale cellen bereiken maag verzuring krachtens een apicale H ^{+ K + ATPase (HKA) die protonen pompen in de maag lumen in ruil voor K + -ionen. Deze activiteit behouden, K + -ionen moeten reizen van de pariëtale cellen in de maag lumen via de apicale membraan om verdere substraat verzekeren ten HKA [2]. Deze K + ion uitstroom plaatsvindt door middel van één of meer soorten apicale, K + - selectieve kanalen. Verscheidene binnenwaartse gelijkrichter (Kir) kanalen zijn betrokken bij dit proces gebaseerd op pariëtale cel expressie en farmacologische bewijzen [3], [4], maar tot nu toe is genetisch bewijs voor één kanaal deze rol: KCNE2-KCNQ1 [5] - [7]. KCNQ1 is een zes-transmembraandomein α subeenheid van S4 superfamilie, die functioneel voltage-gated, homotetramere K + vormt - selectieve kanalen heterologe expressie studies [8], [9]. KCNQ1 kunnen vormen heteromere kanalen complexen met bijkomende subeenheden van KCNE genfamilie, en alle vijf bekende KCNE genproducten is aangetoond KCNQ1 functie reguleren heterologe expressie studies [10]. One, KCNE2, zet KCNQ1 een voltage-onafhankelijke, constitutief-actieve kanaal waarvan de stroom wordt verhoogd door lage pH. KCNE2 en KCNQ1 worden beide uitgedrukt op of nabij de pariëtale cel apicale membraan en doelgen deletie van één subeenheid leidt achloorhydrie gevolg van verminderde maagzuursecretie [5] - [7]. Zo KCNE2-KCNQ1 kanalen zijn van essentieel belang voor de maagzuursecretie beschouwd en dacht bij luminale K + ionen als een substraat voor de maag HKA}

KCNQ1
<sup>-. /- muizen en KCNE2
- /- muizen vertonen gelijkaardige maag fenotypes, gekenmerkt door achloorhydrie, hypergastrinemia en maag glandulaire hyperplasie [5] - [7]. Pariëtale cellen van null tonen -10-voudig verminderde capaciteit om te herstellen van proton geladen, suggereert een primair defect in maagzuursecretie. KCNQ1
- /- muizen ontwikkelen ook metaplasie, dysplasie en pre-kwaadaardige adenomateuze hyperplasie van de maag, onafhankelijk van infectie [11]. Dit suggereert dat KCNQ1 disfunctie kan leiden tot maag neoplasie onafhankelijk van H. pylori
als gevolg van ernstige achloorhydrie, of vormen een extra risico factor die in combinatie met de H. pylori
kunnen predisponeren voor maagkanker</sup>

De achloorhydrie en maag hyperplasie we eerder waargenomen bij KCNE2
<sup>-. /- muizen was opvallend gezien het feit dat de porievormende subunit van de complex, KCNQ1, was nog aanwezig, en in feite was het sterk uitgedrukt in het dubbele van het aantal cellen per maagklierwerking in KCNE2
- /- muizen in vergelijking met KCNE2
+ /+ muizen [7]. In een recente studie werd gevonden KCNE2 expressie tot expressie relatief laag in menselijke maag tumoren en bij maagkanker cellijnen; bovendien gedwongen overexpressie van KCNE2 onderdrukte de groei van menselijke maagkanker cellen in weefselkweek en in naakt muizen [12]. Deze bevindingen die de intrigerende mogelijkheid dat KCNE2 betrokken kan zijn bij maagkanker en eventueel onafhankelijk van ofwel H. pylori
infectie of achloorhydrie. Hier, verder de mogelijke rol van KCNE2 in de regulatie van normale maag celgroei te bepalen, onderzocht we het maag-pathologie van KCNE2
- /-. Muizen tot 15 maanden oud</sup>

Resultaten

KCNE2 ^{- /-
muizen vertonen progressieve maag hyperplasie}

We hebben eerder aangetoond dat KCNE2 nodig is voor de normale regulering van de maag groei mucosale cel: 3- maanden oude KCNE2
<sup>- /- muizen hebben maag hyperplasie, achloorhydrie en abnormale pariëtale cel morfologie [7]. Hier hebben we de maag massa van 3 weken, 3-maand- en 12-15 maanden oude KCNE2
- /- muizen. De massa van magen 3 weken oud waren vergelijkbaar voor KCNE2 + /+ Kopen en KCNE2
- /- muizen, terwijl door 3 maanden was er significant maag hyperplasie in KCNE2
- /- muizen. Dit verschil was met 12-15 maanden steeg in de mate dat KCNE2
- /- muizen hadden magen 6-voudig groter dan die van de KCNE2 + /+
muizen van dezelfde leeftijd (Figuur 1 A)</sup>

KCNE2 ^{-. /-
muizen vertonen gastritis cystic profunda}

Zelfs bij 3 weken oud, ondanks vergelijkbare maag massa aan die van KCNE2 <sup>+ /+
muizen, maagslijmvlies van KCNE2
- /- muizen bleek al vacuolations dicht bij de basolaterale zijde (figuur 1 B; vergroot in D). Om de progressie van de maag hyperplasie en de gevolgen daarvan, een totaal van elf onderzoeken 12-15 maanden oude KCNE2
- /- muizen en vijf KCNE2 + /+
muizen werden histologisch onderzocht. Het maagslijmvlies in elke KCNE2
- /- muizen vertoonden klier hypertrofie en diffuse hyperplasie met verhoogde aantallen muceuze cellen en pariëtale cellen die soms werden vacuolen (Figuur 1 C). Opvallend gastritis cystica profunda (GCP) werd waargenomen bij 11/11 KCNE2
- /- muizen, maar 0/5 van de KCNE2
+ /+ muizen ( χ 2 p
= 0,002) (vergroting van de cyste in figuur 1 E). Dilated klieren bevatte cel puin en, in sommige maar niet alle KCNE2
- /- muizen, neutrofielen. Er was ook maagepitheel hyalinose met af intraluminale kristallen en lymphoplasmacytic aggregaten in de mucosa, submucosa en muscularis. In een aantal 12-15-maanden oude KCNE2
- /- muis magen, prominent lamina proprial fibrose werd opgemerkt, vooral in de oppervlakkige lagen. GCP, ook voorheen aangeduid als benigne maag- pseudotumor, meestal voorgesteld als een spectrum van hyperplastische en metaplasie veranderingen na beschadiging van het maagslijmvlies. Terwijl GCP toont histologische kenmerken geassocieerd met kanker, is op zich algemeen als functioneel goedaardige - hoewel het als een mogelijke risicofactor voor maagkanker [13] voorgesteld, [14]</sup>

verhoogde proliferatieve markers in de maag. slijmvlies van KCNE2 ^{- /-
muizen}

Belangrijk is dat de expressie van gevestigde preneoplastische markers werd in verhoogde KCNE2
<sup>- /- muizen in vergelijking met KCNE2
+ /+ muizen. Ki67 antigeen een celcyclus verwante kerneiwit algemeen gebruikt als proliferatie merker in prolifererende en neoplastische weefsels, zoals de maag [15]. Ki67 kleuring in coupes van KCNE2
+ /+ muis magen (3 maanden) wees op een kleine groep Ki67 positieve cellen in de isthmische gebieden van maag-klieren, dat deze proliferatieve compartiment aanzienlijk werd uitgebreid in leeftijd- geëvenaard KCNE2
- /- muizen (Figuur 2 A-C). Epitheel voering cystic gebieden van GCP in 12-maanden oude KCNE2
- /-. Muizen toonde ook prominent kleuring van kernen met Ki67, indicatief voor een hoge proliferatie snelheid (figuur 2 B)</sup>

Cytokeratin (CK) -7 is een 54 kDa polypeptide tot expressie gebracht in diverse epitheliale weefsels waaronder longen, borst en foetale menselijke maag; het is echter niet tot expressie in normale volwassen gastro-intestinale epitheel [16]. Opregulatie van CK-7, een indicatie van dedifferentiatie, was duidelijk in KCNE2
<sup>- /- maagslijmvlies na 12 maanden; in leeftijd-geëvenaard KCNE2
+ /+ muizen, maagslijmvlies positieve epitheelcellen waren veel zeldzamer (figuur 2 D). CK-7 was ook prominent aanwezig in de buurt van cysten (figuur 2 E)</sup>

-TFF2 uitdrukken metaplasie in maagslijmvlies van KCNE2 ^{-. /-
Muizen}

Trefoil- factor familie (TFF) 2 tot expressie metaplasie wordt geassocieerd met de progressie maagkanker bij mensen en in Mongoolse woestijnratten geïnfecteerd met H. pylori
[17]. Maagslijmvlies van KCNE2
^{- /- muizen vertoonden gebieden metaplasie met prominente TFF2 expressie, met inbegrip van epitheelcellen cysten (Figuur 3 A-C). TFF2 tot expressie metaplasie wordt doorgaans geassocieerd met oxyntic atrofie, gekenmerkt als een verlies van pariëtale cellen [1]. Hier, analyseerden we maagslijmvlies van 12 maanden oude muizen met TFF2 expressie metaplasie voor expressie van de HKA β subeenheid (HKA β), een pariëtale cel marker. Opvallend was er geen bewijs van oxyntic atrofie in termen van het aantal pariëtale cellen (Figuur 4 A). Verder werd HKA β uitgedrukt in epitheelcellen van cysten (figuur 4 B)}

Verhoogde maagslijmvlies Cycline D1 expressie en maag neoplasie in KCNE2 ^{-. /-
Muizen}

Minder KCNE2 expressie werd eerder voorgesteld om proliferatie in de maagkanker cellijn SGC7901 verbeteren via verhoogde expressie van Cycline D1 [12]. Hier, western blots voorgesteld KCNE2
gendeletie verhoogde totale cycline D1 expressie in het maagslijmvlies van 12 maanden oude muizen (Figuur 5 A). Cycline D1 toonde zwakke overwegend cytoplasmatische expressie aan de voet van KCNE2
<sup>+ /+ oxyntic klieren (Figuur 5 B, C, linker panelen), zoals eerder beschreven voor normale prolifererende cellen in de maag muizen [ ,,,0],18]. In tegenstelling, in de KCNE2
- /- muizen, Cycline D1 toonde meer wijdverspreid en nucleaire kleuring in de nek landengte regio maag klieren en klieren pit (Figuur 5 B, C, rechts panelen). In twee van de elf 1-jarige KCNE2
- /- muizen geanalyseerd, pyloric polypoid adenomen werden waargenomen, zich uitstrekt tot in de twaalfvingerige darm (Figuur 5 D). Dezelfde twee KCNE2
- /- muizen vertoonden ook neoplastische groei in de vorm van trombi bestaat uit fibrine en klieren epitheel, in dunwandige vaten (geïdentificeerd met behulp van endotheliale marker CD34) binnen de maag submucosa ( Figuur 5 E-H).</sup>

Minder pariëtale cel KCNE2 expressie in menselijke maagkanker weefsel

Gezien het feit dat in een eerdere studie verminderde KCNE2 expressie werd gevonden aan maagkanker cellijn proliferatie verbeteren, en KCNE2 expressie bleek te zijn verminderd in menselijke maagkanker [12], onderzochten we KCNE2 expressie in normaal menselijk maagslijmvlies en maagkanker weefsel. Immunofluorescentie studies toonden opmerkelijke verschillen met betrekking tot KCNE2 en KCNQ1 co-lokalisatie tussen normale en maligne humane gastrische mucosa. Zoals verwacht, KCNQ1 en KCNE2 sterk co-gelokaliseerd pariëtale cellen in normaal menselijk maagslijmvlies (figuur 6 A), evenals KCNQ1 en HKA β (figuur 6 B). Daarentegen, in menselijke maagcarcinomen, KCNQ1 en KCNE2 expressie zelden overlappen (figuur 6 C, D), terwijl KCNQ1 behield zijn sterke co-lokalisatie met HKA β (figuur 6E). Aldus werd KCNE2 expressie in pariëtale cellen zelden waargenomen bij maagcarcinoom. Het gebrek aan KCNE2-KCNQ1 co-lokalisatie was nog dieper in de menselijke adenocarcinoom van de maag (figuur 6 F), die opnieuw behield co-lokalisatie van KCNQ1 en HKA β (Figuur 6 G).

Discussie

kaliumkanalen in proliferatieve aandoeningen

Kaliumkanalen zijn ontstaan ​​als een potentieel doelwit voor anti-kankertherapieën [19], zoals KCNQ1, hERG en Kv2.1, die allemaal α subeenheid partners van KCNE2. Verstoord imprinting veroorzaakt door mutaties in het gen KCNQ1 oorzaak Syndroom van Beckwith-Wiedemann (BWS), die predisponeert voor kanker [20] - [22], en KCNQ1- knockout predisponeert voor gastrische metaplasie [11]. De hERG kaliumkanalen α subeenheid, die complexen vormt met de KCNE2 bijkomende subeenheid mensenhart [23], is overexpressie gebracht in bepaalde tumoren, en is geïdentificeerd als een tumor overlevingsfactor [24] - [27] evenals Kv2. 1 [28].

KCNE2 is eerder gevonden dat expressie 2-voudig lager in menselijke maagkanker weefsel dan in de omringende normale gastrische cellen en gedwongen opregulatie van KCNE2 had antiproliferatieve effecten op gastrische kankercellen in vitro Kopen en geïnjecteerd in naakt muizen [12]. Het veronderstelde mechanisme voor deze anti-proliferatieve effect neerwaartse regulatie van cycline D1, vertragen voortgang door de celcyclus [12] gelijk aan wat werd waargenomen bij de hERG blocker cisapride [29]. Verhoogde expressie van cycline D1 in humane maag tumoren correleert met een zeer slechte prognose [30], derhalve begrijpen dat factoren Cycline D1 expressie verhogen kunnen leiden tot therapeutische mogelijkheden voor deze en andere vormen van kanker. Overexpressie van cycline D1 is gesuggereerd bijdragen aan oncogenese door verstoring van de celcyclus, en is gerapporteerd dat zij een belangrijke oncogene factor slokdarmcarcinoom [31], en in verband met nucleaire accumulatie van β-catenine in ovarian endometrioïde adenocarcinomen [32]; nucleaire cycline D1 overexpressie galblaas carcinomen is een kritieke gebeurtenis [33].

We beschrijven metaplastische uitgebreide veranderingen in de maag muscosa door genetische verstoring van KCNE2
. Dit is geassocieerd met verhoogde nucleaire cycline D1 expressie in het maagslijmvlies, die doet denken aan de resultaten van eerdere In vitro studies
KCNE2 [12]. Noch het huidige rapport, noch de vorige studie, echter, af te bakenen het mechanisme voor cycline D1 opwaartse regulatie in KCNE2
^{- /- slijmvlies - is het een gevolg van metaplastische veranderingen secundair aan achloorhydrie in deze muizen, of is er een direct verband tussen KCNE2 Kopen en Cycline D1? Het onderzoek van Yanglin en collega pleit voor de laatste althans gedeeltelijk, omdat in hun studie de Cycline D1 veranderingen aangebracht in geïsoleerde cellen zonder de invloed van achlorhydria [12]. Wij zijn van mening dat veranderingen secundair aan achloorhydrie zijn de meest waarschijnlijke dominante factor, maar een rechtstreeks verband kan niet worden uitgesloten. Interessant, hERG, een andere partner van KCNE2, wordt uitgedrukt in maagkanker cellen, maar niet normaal maag epitheel, en de hERG-blokker cisapride werd eerder gevonden om de maag de groei van kankercellen te onderdrukken door het remmen van de toegang tot de S-fase van G (1) fase in de celcyclus, apoptose verhogen [29]. Omdat KCNE2 gedeeltelijk hERG stromen onderdrukt door vermindering unitaire geleiding en snellere deactivering [23], is een intrigerende mogelijkheid dat de waargenomen anti-proliferatieve effecten van overexpressie KCNE2 in vitro
[12] zijn door hERG suppressie bevorderen apoptose, en omgekeerd dat KCNE2 down-regulatie of genetische verstoring kan maag- cellulaire proliferatie te bevorderen door het verhogen van hERG stroomdichtheid}

GCP en-TFF2 uitdrukken metaplasie (SPEM) in KCNE2 ^{-. /-
muizen}

GCP kunnen presenteren in de menselijke wezens met intermitterende epigastrische pijn, opgeblazen gevoel, maag obstructie of gastro-intestinale bloeden, en wordt het meest gezien bij patiënten met een geschiedenis van een van beide gastrectomie of gastrostomie [34]. Er zijn echter een paar gevallen gemeld met geen associatie voorafgaande maagchirurgie [35], [36]. De pathogenese van humaan GCP wordt aangenomen afkomstig te zijn van een verwonding van de muscularis mucosae, die kan ectopische vangende van maagklieren in de submucosa, muscularis mucosae en serosa of chronische ontsteking. GCP wordt algemeen beschouwd als een goedaardige klinisch entiteit, hoewel samenwerking met maagkanker is gemeld [14], [37], [38].

Bij proefdieren, GCP secundair aan Helicobacter sp
. infectie is beschreven als een voorloper van het darmslijmvlies dysplasie en neoplasie [39], en geassocieerd met de ontwikkeling van maagcarcinoom. GCP werd vaak gevonden in de H. pylori
geïnfecteerde Mongoolse gerbils die ook adenocarcinoom van de maag en lymfoïde hyperplasie [40] ontwikkeld. In een eerdere muizen genetisch model van GCP, TGF beta ontwikkelde 1 <sup>+/- muizen ingeboren hyperplastische laesies die morfologische kenmerken gedeeld met de menselijke GCP, met gemengde inflammatoire infiltratie van de omringende slijmvlies en chronische vasculitis in de weefsels grenzend aan deze laesies [ ,,,0],41]. Hier, in KCNE2
- /- muizen, GCP treedt in de afwezigheid van een primaire inflammatoire laesie en onafhankelijk van vasculaire vernietiging. In plaats daarvan, stellen wij voor dat het primaire defect is het verlies van de KCNE2 β subunit van kanaal complexen met KCNQ1, waardoor een belangrijke apicale K + recycling route in de pariëtale cellen aantasten en het voorkomen van maag verzuring door de pariëtale cel HKA. Hoewel dit een "functionele atrofie in de pariëtale celpopulatie in eerdere studies van intestinale metaplasie een werkelijk verlies van pariëtale cellen, zogenaamde" oxyntic atrofie, werd beschouwd als een belangrijk proces in de etiologie van intestinale metaplasie, geassocieerd met zure reflux of H.
pylori infectie, en is de meest voorkomende metaplastisch proces waargenomen in het bovenste maagdarmkanaal [42].</sup>

Oxyntic atrofie in de afwezigheid van significante ontsteking kan worden geïnduceerd door DMP-777, een neutrofiele elastase remmer die ook richt pariëtale cellen als gevolg van haar optreden als een protonophore [43]. Oxyntic atrofie van maag-deficiënte muizen, na behandeling met DMP-777, leidt snel tot expressie TFF2 metaplasie, ook wel spasmolytische peptide tot expressie metaplasie (SPEM) [44]. SPEM is opmerkelijk vanwege de sterke associatie met humane maagdarmkanker en wordt waargenomen in de meeste fundic klier biopten uit menselijk H. pylori
geïnfecteerde gastritis patiënten [45]. De verschijning van SPEM in KCNE2
<sup>- /- muizen in de afwezigheid van beide H. pylori
of klassiek oxyntic atrofie suggereert dat de 'functionele atrofie' veroorzaakt door KCNE2
schrapping kan genoeg zijn om SPEM op gang te brengen. Een belangrijk verschil tussen de KCNE2
- /- muizen en die in de Nozaki studie is dat KCNE2
- /- muizen zijn hypergastrinemic, niet gastrine-deficiënt. Een ander verschil is dat de DMP-777 verstoort een gastric tubulovesicle proton gradiënt zonder afbreuk H + K + - ATPase-functie, terwijl gerichte KCNE2
verstoring voorkomt H + /K + -ATPase functie door verwijdering van de luminale substraat, K + -ionen [7], [44]. Misschien is dit laatste mechanisme kan in de toekomst te onthullen aanwijzingen met betrekking tot de kritieke gebeurtenissen in oxyntic atrofie die resulteren in SPEM: het is momenteel gesuggereerd dat SPEM inductie gevolg is van een tekort in de pariëtale cel uitgescheiden regulatoren van normale maagslijmvlies vernieuwing, die sonic hedgehog en omvatten [47] TGF-α [46], door het verlies van pariëtale cellen. Nader onderzoek van de KCNE2
- /- pariëtale cellen - die nog steeds aanwezig, maar functioneren - kan toezichthouders die ze nog kunnen afscheiden onthullen, en die welke zij niet kunnen</sup>

De maagslijmvlies. van KCNE2
<sup>- /- muizen vertonen eveneens verhoogde expressie van de vastgestelde proliferatie merker Ki67, manifesteren als een toename van de breedte van de mucosale proliferatieve band en als Ki67-positieve epitheelcellen van de cysten in regio van GCP. Ook de de-differentiatie marker CK7, niet uitgedrukt in 1-jarige KCNE2
+ /+ maagslijmvlies, werd op grote schaal uitgedrukt in die van de KCNE2
- /- muizen. Rekening houdend met deze markers en de hierboven beschreven samen de KCNE2
- /- maagslijmvlies vertoont metaplasie met meerdere functies van preneoplasia, en in sommige gevallen neoplasie, met name in een specifieke pathogeenvrije omgeving zonder bewijs van maag Helicobacter
infectie of oxyntic atrofie, en in de afwezigheid van chemische remmers van de maag verzuring. Samen met de vaststelling hier dat pariëtale cel KCNE2 expressie blijkt te worden verlaagd in menselijke maagkanker weefsel (figuur 4) en eerdere rapport dat KCNE2 remt maagkanker celproliferatie [12], suggereren de gegevens KCNE2 verstoring wordt geassocieerd met maagkanker progressie. Toekomstig onderzoek zal betrekken onderzoeken of KCNE2
verstoring verhoogt aanleg voor maagkanker binnen pathogeen en carcinogeen-gebaseerde protocollen, de mechanismen achter deze mogelijke verschillen, en de mogelijke mechanistische verband tussen KCNE2
, Cycline D1 en celcyclus verstoring buiten het domein van achloorhydrie geassocieerde ziekte etiologie. Bovendien, zoals KCNQ1 en KCNE2 zijn ook co-uitgedrukt in de schildklier epitheelcellen, waar ze van belang zijn voor schildklierhormoon biosynthese [48], zal het interessant zijn om een ​​mogelijke rol voor KCNE2 in abnormale thyrocyte proliferatie te onderzoeken.</sup>

Materialen en methoden

Generation en het gebruik van gen-gerichte muizen

Alle in deze studie beschreven muizen werden gehuisvest, benut en gedood volgens NIH en Cornell University Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen. Alle muizen in deze studie beschreven waren gehuisvest, benut en gedood volgens NIH en Weill Medical College Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen. Ethische goedkeuring om te broeden en de oogst weefsel van wild-type en KCNE2
<sup>- /- muizen voor biomedisch onderzoek werd door Weill Medical College Institutional Animal Care en gebruik Comite (protocol 0704-610A) goedgekeurd. KCNE2
- /- muizen werden gegenereerd zoals eerder beschreven van C57BL /6 KCNE2 + /
- x KCNE2 +/-
kruisen [7]. Numerieke gegevens werden geanalyseerd met EXCEL software (Microsoft) met behulp van one-way variantie-analyse (ANOVA) met ingesteld op P Restaurant <statistische significantie. 0.05</sup>

Histologie

Voor histologie en maag massa kwantificering, KCNE2 <sup>+ /+ Kopen en KCNE2
- /- muizen op 3 weken, 3 maanden en 12-15 maanden werden gedood met behulp van CO _{2 stikken (5-10 per genotype). Magen werden verwijderd post-mortem, maag bepaalde massa, daarna werd de maag weefsel gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline, verwerkt door routine werkwijzen en ingebed in paraffine. Maagslijmvlies secties werden gesneden in 5 urn intervallen geplaatst op positief geladen Superfrost objectglaasjes, gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E)., En geëvalueerd met een Olympus BX45 microscoop}</sup>

Immunohistochemie

immunohistochemische bepaling van Ki67, CK-7 en TFF2 (ook bekend als spasmolytische peptide) werd uitgevoerd met een Discovery XT processor (Ventana Medical Systems). Het primaire antilichaam concentraties waren: 0,05 ug /ml (konijn polyklonaal anti-Ki67, Vector Labs); 1 ug /ml (monoklonaal anti-CK-7, Abcam); 1 ug /ml (monoklonaal anti-TFF2; Abcam). Voorgaande primaire antilichaam incubatie werden de weefselcoupes gedurende 30 minuten geblokkeerd in 10% normaal geit serum, 2% BSA in PBS (anti-Ki67); 30 min in 10% normaal geit serum, 2% BSA in PBS en avidine /biotine gedurende 8 min (anti-CK-7); 30 min in 10% normaal geit serum, 2% BSA in PBS en avidine /biotine gedurende 4 min (anti-TFF2). Primaire antilichaam incubatietijden waren: 3 uur (Ki67 en CK-7); 5 uur (anti-TFF2). Secundair antilichaam incubaties waren: 32 min in 1:200 gebiotinyleerd geit anti-konijn IgG (Vector Labs) voor Ki67; 60 min in 1:200 paard-anti-muizen-IgG (Vector Labs) voor CK-7 en TFF2. Voor Ki67 tweede antilichaam incubatie Blocker D, streptavidine-HRP en DAB detectie kit (Ventana Medical Systems) werden volgens de instructies van de fabrikant. CK-7 en TFF2, muis IgG1 (5 ug /ml) werd gebruikt als een isotype negatieve controle en Blocker D, streptavidine-HRP en DAB detectie kit (Ventana Medical Systems) gebruikt.

voor cycline D1 detectie werden maag objectglaasjes verwarmd bij 58-60 ° C gedurende 30 minuten en vervolgens gedeparaffineerd. Endogene peroxidase activiteit werd geblokkeerd door incuberen secties 1% waterstofperoxide in PBS gedurende 15 minuten (8,3 ml 30% H _{2O 2 /241,7 ml PBS), gevolgd door ontmaskering van het antigene epitoop door de magnetron in 10 mM citraat buffer bij hoog vermogen gedurende 15 min. Objectglaasjes werden gekoeld gedurende 20 minuten, gewassen in gedestilleerd water gedurende 5 minuten, overgebracht naar PBS en geïncubeerd in 10% normaal paardenserum (in 2% BSA-PBS verdunningsmiddel) gedurende 30 min in een vochtige kamer. Monoklonaal anti-cycline D1-antilichaam (Cell Signaling) werd bij 1:1000 toegevoegd met 2% BSA in PBS en overnacht geïncubeerd bij 4 ° C in een vochtige kamer. Glaasjes werden gespoeld in PBS en secundair paard-anti-muis IgG antilichaam (Vector Labs) werd bij 1:500 gedurende 30 minuten toegepast in PBS bij kamertemperatuur. Dia's werden gewassen en een avidine-biotine Complex (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Labs) verdund 1:25 in PBS werd toegepast gedurende 30 minuten. Het signaal werd gedetecteerd door incubatie in 3,3-diaminobenzidine (Sigma, Batch No. 026K3767) totdat de gewenste kleurintensiteit werd bereikt. Na de definitieve wassingen in water, werden dia's licht tegengekleurd in hematoxyline. KCNQ1 en HKA β interne labeling en detectie werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [7]. CD34 detectie was bij 1:50 anti-CD34 antilichaam (Abcam). Dia's werden bekeken met een Nikon Eclipse E600 microscoop en gefotografeerd met behulp van een RT kleurencamera en SPOT software (Diagnostic Instruments, Inc.).}

Immunofluorescentie

Alle menselijk weefsel werd verkregen van Prosci, Poway, CA, en werd gecertificeerd als zijnde afkomstig van gekwalificeerde en gelicentieerd pathologie diensten, met behulp van passende gelijkvormig toestemming voor gebruik in het biomedisch onderzoek en bescherming van de donor anonimiteit; Daarom werd extra Weill Medical College Institutional Review Board ethiek goedkeuring niet vereist. Immunofluorescentie detectie van HKA β, KCNQ1 en KCNE2 in menselijk maagweefsel (Prosci) werd uitgevoerd met een Discovery XT processor (Ventana Medical Systems). De volgende menselijke weefsels werden gebruikt: normaal maag weefsel van een 50-jarige vrouw (PSC-10-809-XB1); maagcarcinoom weefsel, de patiënt informatie beschikbaar is (PSC-10-814-CA1); adenocarcinoom van de maag weefsel van een 51-jarige vrouw (PSC-10-809-XA1). Het primaire antilichaam concentraties waren: 0,5 mg /ml anti- HKA β (muizenmonoklonaal, Affinity Bioreagents), 1 mg /ml anti-KCNQ1 (konijn of geit polyklonaal, Chemicon) en interne anti-KCNE2 serum werd gebruikt een 1:500 verdunning na-kolom verrijkt IgG. Voorafgaand aan het primaire antilichaam incubatie werden de weefselcoupes gedurende 30 minuten geblokkeerd in 10% normaal geit serum, 2% BSA in PBS, gevolgd door 8 min avidine /biotine blokkeren. Het primaire antilichaam incubatie (3 uur) gevolgd door 32 min incubatie met gebiotinyleerde anti-muis IgG (ABC kit van Vector Labs), 60 min incubatie met gebiotinyleerd anti-geit IgG (ABC kit van Vector Labs) of gebiotinyleerd anti-konijn antilichaam bij 1:200 verdunning (Vectastain ABC kit). De secundaire detectie werd uitgevoerd met streptavidine-HRP D (Ventana Medical Systems), gevolgd door incubatie met Tyramide-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) of Tyramide Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Stained dia's werden bekeken met een Zeiss Axiovert 200 groothoek microscoop en foto's werden verkregen met behulp van MetaMorph software 7.1 (Molecular Devices).

Western blotting

Voor western blotting, maag membraan fracties werden bereid zoals eerder beschreven [7]. Drie magen van 12 maanden oude KCNE2 <sup>+ /+ Kopen en KCNE2
- /- muizen werden verwijderd post-mortem, opengesneden langs de curvatura ventriculi major, verwijdering van voedselmassa en direct snel bevroren in vloeibare stikstof. Magen werden vervolgens gehomogeniseerd in een buffer die 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 ug /ml PMSF, 1 ug /ml Nonidet P40, 0,5% SDS en 0,5% natriumorthovanadaat, vervolgens geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten en gecentrifugeerd bij 12.000 x g
gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Eiwitconcentratie van het supernatans werd gemeten volgens de Bradford methode. Totaal eiwit (40 ug /laan) werd geladen in een prefab tris-glycine 4-20% gel (Jule Inc, Milford, CT) en gescheiden door elektroforese. Eiwitten werden daarna overgebracht op een PVDF-membraan (Bio-Rad, Hercules, CA), en geblokkeerd met 5% melk, 0,05% Tween-20 in PBS gedurende 12 uur bij 4 ° C op een rocker. Primair antilichaam incubaties (4 uur, RT in 1% melk, 0,05% Tween-20, PBS, 'Buffer A') waren: 1:2000 anti-cycline-D1 (Abcam); 1:5000 anti-GAPDH (Abcam). Membranen werden 4 maal, 20 minuten elk met antilichaam incubatiebuffer daarna geïncubeerd met het geschikte secundaire antilichamen (BioRad) verdund 1:10000 in buffer A gedurende 2 uur bij KT vervolgens gewassen 4 x 20 min elk met buffer A en eenmaal gedurende 5 minuten gewassen met PBS.</sup>

• PLoS Pathogens: Caveolin-1 beschermt B6129 muizen tegen Helicobacter pylori Gastritis
• PLoS ONE: Epstein Barr Virus en Helicobacter pylori co-infectie zijn positief geassocieerd met ernstige gastritis in Pediatric Patients