PLOS ONE: eliminação sistemática de KCNE2 provoca gastrite Cística Profunda e gástrico Neoplasia

Abstract

O câncer gástrico é a segunda principal causa de morte por câncer no mundo. Os fatores predisponentes incluem acloridria, Helicobacter pylori
, atrofia oxíntica e metaplasia-expressando TFF2. Em células parietais, os canais de potássio apicais que compõem o KCNQ1 α subunidade e as β KCNE2 subunidade fornecer um K atual <sup>+ efluxo para facilitar a secreção de ácido gástrico pela apical H + K + ATPase. Assim, a eliminação genética de murino KCNQ1
ou KCNE2
prejudica a secreção de ácido gástrico. Outras evidências têm sugerido um papel para KCNE2 na proliferação de células de cancro gástrico humano, independente de seu papel na acidificação gástrica. Aqui, demonstramos que 1-year-old KCNE2
- /- ratos em um ambiente livre de patógenos todos exibem uma grave fenótipo pré-neoplásica compreendendo profunda gastrite cystica gástrica, 6 vezes maior massa de estômago, aumento Ki67 e expressão da ciclina D1 nuclear, e TFF2- e citoqueratina 7 expressando metaplasia. Alguns KCNE2
- /- ratos também exibiram adenomas polipóides pilóricas que se estendem para o duodeno, e invasão neoplásica de vasos de paredes finas na sub-mucosa. Finalmente, a análise do tecido câncer gástrico humano indicado expressão KCNE2 reduzida de células parietais. Juntamente com os resultados anteriores, os resultados sugerem KCNE2 interrupção como um possível fator de risco para neoplasia gástrica</sup>

Citation:. Roepke TK, Purtell K, Rei CE, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) eliminação sistemática de KCNE2
provoca gastrite Cística Profunda e gástrico Neoplasia. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10.1371 /journal.pone.0011451

editor: Xin-yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 03 de maio de 2010; Aceito: 13 de junho de 2010; Publicação: 06 de julho de 2010

Direitos de autor: © 2010 Roepke et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. G.W.A. é suportado pelo National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health (R01 HL079275), a American Heart Association (Grant-in-Aid 0855756D), e um prêmio Irma T. Hirschl Carreira Scientist. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico continua sendo uma das principais causas de mortalidade, e a segunda principal causa de morte por câncer em todo o mundo. carcinogênese gástrica é um processo que avança através de múltiplas fases, incluindo a atrofia oxíntica, formação de úlcera, hiperplasia foveolar, hipo e achlorhydria e metaplasia de células mucosas [1]. Apesar dos avanços no tratamento do câncer gástrico, relativamente pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos na carcinogênese gástrica, o desenvolvimento da mucosa gástrica normal em lesões gástricas pré-neoplásicas, ou o papel potencial de canais de íons nestes processos.

parietal células conseguir acidificação gástrica em virtude de um apical H ^{+ K + ATPase (HKA) que bombeia protões no lúmen do estômago em troca de K + íons. Para manter esta actividade, K + iões deve viajar a partir da célula parietal para o lúmen do estômago através da membrana apical, para assegurar substrato contínuo para o HKA [2]. Este efluxo K + ion ocorre através de um ou mais tipos de apical, K + - canais seletivos. Vários rectificador de entrada canais (KIR) estão implicados neste processo com base na expressão da célula parietal e evidências farmacológicas [3], [4], mas até agora não há evidência genética para apenas um canal de cumprir este papel: KCNE2-KCNQ1 [5] - [7]. KCNQ1 é um domínio transmembranar de seis α subunidade da superfamília S4, que forma funcional, por voltagem, homotetrameric K + - canais selectivos em estudos de expressão heterólogos [8], [9]. KCNQ1 também podem formar complexos heteroméricos de canal com subunidades acessórias da família de genes KCNE, e todos os cinco produtos de genes KCNE conhecidos têm sido mostrados para regular a função KCNQ1 em estudos de expressão heterólogos [10]. Um, KCNE2, converte KCNQ1 para, um canal constitutivamente ativo independente de tensão cuja corrente é aumentada em pH baixo. KCNE2 e KCNQ1 são ambos expressos em ou perto da membrana apical de células parietais, e orientada deleção do gene da subunidade resultados tanto em acloridria devida a secreção de ácido gástrico prejudicada [5] - [7]. Assim canais KCNE2-KCNQ1 são considerados essenciais para a secreção de ácido gástrico e pensado para proporcionar luminal K + íons como um substrato para a HKA gástrica}

KCNQ1
<sup>-. /- camundongos e KCNE2
- /- ratos mostram fenótipos gástricas semelhantes, caracterizadas por achlorhydria, hipergastrinemia e hiperplasia glandular gástrica [5] - [7]. As células parietais a partir de qualquer mostram nula ~ 10 vezes a capacidade reduzida para se recuperar de carregamento de protões, sugerindo um defeito primário na secreção de ácido gástrico. KCNQ1
- /- camundongos também desenvolvem metaplasia, displasia e hiperplasia adenomatosa pré-malignas do estômago independente de infecção [11]. Isto sugere que a disfunção KCNQ1 poderia levar a neoplasia gástricas independentes de H. pylori
devido à achlorhydria grave, ou representar um fator de risco adicional, que em conjunto com o H. pylori
poderia predispor ao câncer gástrico</sup>

O achlorhydria e gástrica hiperplasia que anteriormente observada em KCNE2
<sup>-. /- camundongos foi marcante, uma vez que a subunidade de formação de poros do complexo, KCNQ1, ainda estava presente, e na verdade ele foi fortemente expresso no dobro do número de células por glândula gástrica em KCNE2
- /- ratos em comparação com KCNE2
+ /+ ratinhos [7]. Em um estudo recente, a expressão KCNE2 foi encontrado para ser expressa a níveis relativamente baixos em tumores gástricos humanos e em linhas celulares de cancro gástrico; Além disso, forçado a sobre-expressão de KCNE2 suprimiu o crescimento de células de cancro gástrico humano em cultura de tecidos, e em ratinhos nus [12]. Estes resultados levantaram a intrigante possibilidade de que KCNE2 podem estar envolvidos na carcinogénese gástrica, e, potencialmente, de forma independente de qualquer H. pylori
infecção ou acloridria. Aqui, para definir melhor o papel potencial da KCNE2 na regulação do crescimento celular gástrica normal, que examinou a patologia gástrica de KCNE2
- /-. Ratos até 15 meses de idade</sup>

resultados de

KCNE2 ^{- /-
ratos exibem hiperplasia gástrica progressiva}

Nós já demonstrou que KCNE2 é exigido para a regulação normal do crescimento celular da mucosa gástrica: 3- meses de idade, KCNE2
<sup>- /- ratos têm hiperplasia gástrica, achlorhydria e morfologia celular parietal anormal [7]. Aqui comparamos a massa de estômago, de 3 semanas, 3-mês- e 12-15 meses de idade, KCNE2
- /- ratos. A massa de estômagos de 3 semanas de idade foram semelhantes para KCNE2 + /+ Comprar e KCNE2
- ratos, enquanto que por 3 meses houve hiperplasia gástrica significativa - /em KCNE2
- /- ratos. Esta diferença aumentou em 12-15 meses, na medida em que KCNE2
- /- ratos tinham estômagos 6 vezes maiores que as de KCNE2 + /+
ratos da mesma idade (Figura 1 a)</sup>

KCNE2 ^{-. /-
ratos apresentam gastrite cística profunda}

mesmo com 3 semanas de idade, apesar de estômago semelhante massa à de KCNE2 <sup>+ /+
ratos, mucosa gástrica de KCNE2
- /- ratos já mostrou vacuolations perto do lado basolateral (Figura 1 B; ampliado em D). Para investigar a progressão da hiperplasia gástrica e suas consequências, um total de onze 12-15 meses de idade, KCNE2
- /- ratos e cinco KCNE2 + /+
os ratinhos foram examinados histologicamente. A mucosa gástrica em todos os KCNE2
- /- ratos mostraram hipertrofia glandular e hiperplasia difusa com aumento do número de células mucosas e células parietais que foram ocasionalmente vacúolos (Figura 1 C). Surpreendentemente, gastrite cística profunda (GCP) foi observada em 11/11 KCNE2
- /- ratos, mas 0/5 da KCNE2
camundongos + /+ ( χ 2 p
= 0,002) (ampliação de cisto na Figura 1 E). glândulas dilatadas continha restos de células e, em alguns, mas não todos KCNE2
- /- ratos, os neutrófilos. Houve também hialinose epitelial gástrica com cristais intraluminais ocasionais e agregados linfoplasmocíticos na mucosa, submucosa e muscular. Em algum 12-15 meses de idade, KCNE2
- estômagos rato, fibrose proprial lâmina proeminente foi observado, especialmente nas camadas superficiais - /. GCP, também já referido pseudotumor gástrica como benignos, geralmente apresenta-se como um espectro de alterações hiperplásicas e metaplásicas seguintes danos na mucosa gástrica. Enquanto GCP demonstra características histológicas associados à malignidade, é, em si, geralmente considerado funcionalmente benigna - embora tenha sido sugerida como um possível fator de risco para câncer gástrico [13], [14]</sup>

aumento dos marcadores de proliferação em gástrica. mucosa da KCNE2 ^{- /-
ratos}

É importante ressaltar que a expressão de marcadores pré-neoplásicas estabelecidos foi aumentado em KCNE2
<sup>- /- ratos em comparação com KCNE2
+ /+ camundongos. antigénio Ki67 é uma proteína nuclear relacionada ciclo celular vulgarmente utilizada como um marcador de proliferação de proliferação e tecidos neoplásicos, incluindo o estômago [15]. coloração Ki67 nas seções de KCNE2
+ /+ estômagos de rato (3 meses) indicou um pequeno grupo de células positivas Ki67 nas regiões ístmica de glândulas gástricas, que este compartimento proliferativo foi significativamente ampliado em etário combinado KCNE2
- /- ratos (Figura 2 A-C). Epitélio que reveste áreas císticas de GCP em 12 meses de idade, KCNE2
- /-. Ratos também demonstraram coloração proeminente dos núcleos com Ki67, indicativo de uma taxa de proliferação alta (Figura 2 B)</sup>

citoqueratina (CK) -7 é um polipéptido de 54 kDa expressa em uma ampla variedade de tecidos epiteliais incluindo o pulmão, mama, estômago e fetal humano; No entanto, não é expresso no epitélio gastrointestinal adulto normal [16]. Regulação positiva de CK-7, indicativo de desdiferenciação, foi evidente em KCNE2
<sup>- /- mucosa gástrica em 12 meses; A idade-correspondida KCNE2
+ /+ camundongos, as células epiteliais positivas da mucosa gástrica foram muito mais raros (Figura 2 D). CK-7 também foi destaque em torno de cistos (Figura 2) E</sup>

metaplasia-expressando TFF2 na mucosa gástrica de KCNE2 ^{-. /-
Ratos}

Trefoil- fator de família (TFF) 2-expressando metaplasia está associada com a progressão para o câncer gástrico nos seres humanos, e em gerbilos da Mongólia infectadas com o H. pylori
[17]. mucosa gástrica de KCNE2
^{- /- ratos áreas de metaplasia com expressão TFF2 proeminentes, incluindo em células epiteliais que revestem cistos expostas (Figura 3 A-C). TFF2-expressando metaplasia é tipicamente associada com atrofia oxíntica, caracteriza-se como uma perda de células parietais [1]. Aqui, nós analisamos mucosa gástrica a partir de murganhos com 12 meses de idade, com metaplasia-expressando TFF2 para a expressão da subunidade β HKA (HKA β), um marcador de células parietais. Surpreendentemente, não houve evidência de atrofia oxíntica em termos de número de células parietais (Figura 4 A). Além disso, β Hka foi expressa em células que revestem cistos (Figura 4 B)}

mucosa gástrica Aumento da expressão de ciclina D1 e neoplasia gástrica em KCNE2 ^{-. /-
Ratos}

KCNE2 expressão reduzida foi anteriormente sugerida para aumentar a proliferação na linha celular de cancro SGC7901 gástrica através de um aumento da expressão da Ciclina D1 [12]. Aqui, transferências de Western sugeriu que KCNE2
deleção do gene total de aumento da expressão da Ciclina D1 na mucosa gástrica de ratos com 12 meses de idade (Figura 5 A). A ciclina D1 mostrou fraca expressão e predominantemente citoplasmática na base de KCNE2
<sup>+ /+ oxíntica glândulas (Figura 5 B, C, deixou painéis), tal como anteriormente descrito para as células normais em proliferação, no estômago do rato [ ,,,0],18]. Em contraste, KCNE2
- /- ratos, ciclina D1 apresentaram coloração mais generalizada e nuclear na região do istmo do pescoço de glândulas gástricas, e glandular poço (Figura 5 B, C, painéis direitos). Em dois dos onze 1-year-old KCNE2
- /- foram observados ratos analisados, adenomas polipóides pilóricas, estendendo-se para o duodeno (Figura 5 D). Os mesmos dois KCNE2
- /- ratos também exibiram crescimento neoplásico sob a forma de trombos de fibrina e composto de epitélio glandular, em vasos de paredes finas (identificado usando o marcador endotelial CD34) no interior da submucosa gástrica ( Figura 5 e-H).</sup>

expressão KCNE2 célula parietal reduzido no tecido do cancro gástrico humano

Tendo em conta que em um estudo anterior reduzida expressão KCNE2 foi encontrado para aumentar a proliferação de linha celular de cancro gástrico e KCNE2 expressão foi encontrado para ser reduzida no cancro gástrico humano [12], examinamos a expressão KCNE2 na mucosa gástrica humana normal, e tecido de câncer gástrico. estudos de imunofluorescência revelou diferenças marcantes em relação a KCNE2 e co-localização KCNQ1, entre mucosa gástrica humana normal e maligno. Como esperado, KCNQ1 e KCNE2 co-localizada fortemente em células parietais da mucosa gástrica humana normal (Figura 6 A), assim como KCNQ1 e β Hka (Figura 6 B). Em contraste, nos carcinomas gástricos humanos, KCNQ1 e expressão KCNE2 raramente sobrepostas (Figura 6 C, D), apesar de KCNQ1 manteve a sua co-localização com forte β Hka (Figura 6E). Assim, a expressão KCNE2 em células parietais foi raramente observada no carcinoma gástrico. A falta de co-localização KCNE2-KCNQ1 foi ainda mais profunda no adenocarcinoma gástrico humano (Figura 6 F), que mais uma vez manteve co-localização de KCNQ1 e Hka β (Figura 6 G).

Discussão

Os canais de potássio em desordens proliferativas

Os canais de potássio têm emergido como um potencial alvo para terapias anti-câncer [19], incluindo KCNQ1, hERG e Kv2.1, todos os quais são parceiros subunidade a de KCNE2. imprinting interrompido causada por mutações no gene causam KCNQ1 síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS), o que predispõe ao câncer [20] - [22], e knockout KCNQ1 predispõe a metaplasia gástrica [11]. O canal de potássio hERG α subunidade, que forma complexos com a subunidade acessória KCNE2 no coração humano [23], é sobre-expressa nalguns tumores, e tem sido identificada como um factor de sobrevivência de tumores [24] - [27], como tem KV2. 1 [28].

KCNE2 foi encontrado anteriormente a ser expressa 2 vezes mais baixa em tecido de cancro gástrico humano do que em células gástricas normais vizinhos, e forçou a regulação positiva de KCNE2 tinha efeitos anti-proliferativa em células cancerosas gástricas in vitro Comprar e injetado em ratos pelados [12]. O mecanismo proposto para este efeito anti-proliferativo é a sub-regulação da ciclina D1, retardando a progressão através do ciclo celular [12] similar ao que foi observado com o bloqueador de cisaprida hERG [29]. expressão elevada de ciclina D1 em tumores gástricos humanos correlaciona-se com um prognóstico particularmente ruim [30], portanto, compreender os fatores que aumentam a expressão da ciclina D1 pode levar a caminhos terapêuticos para esta e outras formas de câncer. A sobreexpressão da ciclina D1 foi sugerido para contribuir para a oncogénese por alterar o ciclo celular, e tem sido relatada como sendo um factor oncogénica importante no carcinoma esofágico [31], e associada com a acumulação nuclear de β-catenina em adenocarcinomas endometrióides ovarianos [32]; nuclear ciclina D1 superexpressão em carcinomas da vesícula biliar é um evento crítico [33].

Aqui, descrevemos grandes alterações metaplásicas no muscosa gástrica devido ao rompimento genético de KCNE2
. Isto é associado com aumento nuclear expressão da ciclina D1 na mucosa gástrica, uma reminiscência de resultados anteriores in vitro
estudos de KCNE2 [12]. Nem o relatório atual, nem o estudo anterior, no entanto, delinear o mecanismo para a ciclina D1 regulação positiva em KCNE2
^{- /- mucosa - é uma consequência das alterações metaplásicas secundária a acloridria nesses camundongos, ou é há uma associação mais direta entre KCNE2 Comprar e ciclina D1? O estudo por Yanglin e colegas defende a este último pelo menos em parte, porque no seu estudo, as alterações ciclina D1 ocorreu em células isoladas, sem a influência de acloridria [12]. Consideramos que alterações secundárias à achlorhydria são o fator mais provável dominante, mas uma ligação directa não pode ser excluída. Curiosamente, hERG, outro parceiro de KCNE2, é expresso em células de cancro gástrico, mas não epitélio gástrico normal, e a cisaprida bloqueador de canais de hERG foi encontrada anteriormente para suprimir o crescimento de células de cancro gástrico inibindo a entrada na fase S de L (1) fase no ciclo celular, aumentar a apoptose [29]. Porque KCNE2 suprime parcialmente correntes hERG, reduzindo a condutância unitária e acelerando desactivação [23], é uma possibilidade intrigante de que os efeitos anti-proliferativos observados de sobreexpressão KCNE2 In vitro
[12] são devidos à supressão de corrente de hERG promover apoptose, e, inversamente, que KCNE2 infra-regulação ou perturbação genética podem favorecer a proliferação celular gástrica através do aumento da densidade de corrente hERG}

GCP e metaplasia-expressando TFF2 (SPEM) em KCNE2 ^{-. /-
camundongos}

GCP pode apresentar em seres humanos com dor intermitente epigástrica, distensão abdominal, obstrução gástrica ou hemorragia digestiva alta, e é mais comumente visto em pacientes com história de ambos os gastrectomia ou gastrostomia [34]. No entanto, alguns casos têm sido relatados com nenhuma associação à cirurgia antes gástrica [35], [36]. A patogénese da GCP humano Acredita-se que surgem a partir de uma lesão da mucosa muscular, o que pode levar a aprisionamento ectópica de glândulas gástricas na submucosa, muscularis da mucosa ou serosas, ou de inflamação crónica. GCP é comumente considerada uma entidade clínico benigno, embora associação com câncer gástrico tem sido relatada [14], [37], [38].

Em animais de laboratório, GCP secundária a Helicobacter sp
. infecção tem sido descrito como um antecessor de displasia e intramucosal neoplasia [39], e associada com o desenvolvimento de carcinoma gástrico. GCP foi frequentemente encontrada em H. pylori
gerbilos da Mongólia infectados, que também desenvolveram adenocarcinoma gástrico e hiperplasia linfóide [40]. Em um modelo genético murino anterior do GCP, TGF beta 1 <sup>+/- ratinhos desenvolveram lesões hiperplásicas glandulares que compartilham características morfológicas com GCP humana, com infiltrado inflamatório misto dos mucosa circundantes e vasculite crônica nos tecidos adjacentes a estas lesões [ ,,,0],41]. Aqui, em KCNE2
- /- ratos, GCP ocorre na ausência de uma lesão inflamatória primária, e independente de obliteração vascular. Em vez disso, propõe-se que o defeito primário é a perda do β subunidade KCNE2 de complexos canais com KCNQ1, prejudicando, assim, um importante + via de reciclagem apical K nas células parietais e impedindo a acidificação gástrica pela célula parietal HKA. Embora isto represente uma "atrofia funcional na população de células parietais, em estudos anteriores de metaplasia intestinal uma perda real de células parietais, denominado« atrofia oxíntica ', foi considerado um processo importante na etiologia de metaplasia intestinal, associada com doença de refluxo ácido ou H. pylori
infecção, e é o processo mais comum metaplásicas observadas no tracto gastrointestinal superior [42].</sup>

atrofia oxínticas na ausência de inflamação significativa pode ser induzida pela DMP-777, um inibidor de elastase de neutrófilos que também dirige as células parietais, devido à sua ação como um protonophore [43]. atrofia oxínticas gástricas em ratos com deficiência de, a seguir ao tratamento com DMP-777, conduz rapidamente a metaplasia-expressando TFF2, também referido como péptido espasmolítico expressando metaplasia (SPEM) [44]. SPEM é notável por causa da sua forte associação com adenocarcinoma gástrico humano, e observa-se na maioria das biópsias das glândulas fúndicas de humano H. pylori
pacientes com gastrite infectados [45]. O aparecimento de SPEM em KCNE2
<sup>- /- ratos, na ausência de qualquer um H. pylori
ou atrofia oxíntica clássica sugere que a "atrofia funcional causada por KCNE2
exclusão pode ser suficiente para desencadear SPEM. Uma diferença importante entre KCNE2
- /- ratos e aqueles no estudo Nozaki é que KCNE2
- /- ratos são hypergastrinemic, não gastrina-deficiente. Outra diferença é que DMP-777 interrompe um gradiente de prótons tubulovesicle gástrica sem prejudicar H + K + - ATPase função, ao passo que direccionada KCNE2
interrupção impede H + /K + -ATPase função removendo seu substrato luminal, K + íons [7], [44]. Talvez este último mecanismo pode no futuro revelar pistas sobre os eventos críticos na atrofia oxíntica que resultam em SPEM: atualmente é sugerido que SPEM resultados de indução de uma deficiência em reguladores secretada por células parietais do normal de renovação da mucosa gástrica, que incluem sonic hedgehog e TGF-α [46], [47], devido à perda de células parietais. Mais estudos de KCNE2
- /- células parietais - que ainda estão presentes, mas com defeito - pode revelar reguladores que eles ainda podem secretar, e aqueles que não podem</sup>

A mucosa gástrica. de KCNE2
<sup>- /- ratos mostram também o aumento da expressão do marcador de proliferação Ki67 estabelecido, que se manifesta como um aumento na largura da banda proliferativa da mucosa, e como células Ki67-positivas que reveste os cistos em regiões de GCP. Da mesma forma, o marcador CK7 de-diferenciação, não expressa em 1-year-old KCNE2
+ /mucosa gástrica +, foi amplamente expressa no de KCNE2
- /- ratos. Tomando estes e os marcadores descrito acima em conjunto, o KCNE2
- /- gástrica exposições mucosa metaplasia com várias características de preneoplasia e, em alguns casos, neoplasia, especialmente em um ambiente específico isento de agentes patogénicos sem evidência de gástrica Helicobacter
infecção ou atrofia oxíntica, e na ausência de inibidores químicos de acidificação gástrica. Juntamente com a descoberta aqui que a expressão KCNE2 célula parietal parece ser reduzida em tecido de cancro gástrico humano (Figura 4) e no relatório anterior que KCNE2 inibe a proliferação de células de câncer gástrico [12], os dados sugerem KCNE2 interrupção está associada com a progressão do cancro gástrico. Estudos futuros envolverá examinar se KCNE2
interrupção aumenta a predisposição ao câncer gástrico dentro de protocolos de patógenos e baseada cancerígena, os mecanismos por trás dessas diferenças possíveis e as potenciais ligações mecânicas entre KCNE2
, ciclina D1 e perturbação do ciclo celular fora do reino da etiologia da doença associada à acloridria. Além disso, como KCNQ1 e KCNE2 são também co-expressos em células epiteliais da tiróide, onde eles são importantes para a hormona da tiróide biossíntese [48], que será de interesse para examinar um papel potencial para KCNE2 na proliferação tirócito anormal.</sup>

Materiais e Métodos

Geração e uso de camundongos direcionados gene-

Todos os ratos descritos neste estudo foram alojados, utilizados e sacrificados de acordo com as diretrizes do NIH e da Universidade de Cornell Institutional animal Care e do Comitê Use. Todos os ratos descritos neste estudo foram alojados, utilizados e sacrificados de acordo com as diretrizes do NIH e Weill Medical College Institutional Animal Care e do Comitê Use. A aprovação ética para se reproduzir e tecido colheita a partir do tipo selvagem e KCNE2
<sup>- /- ratos de pesquisa biomédica foi aprovado pelo Weill Medical College Institutional Animal Care e Use Committee (protocolo 0704-610A). KCNE2
- /- ratos foram gerados como descrito anteriormente a partir de C57BL /6 KCNE2 + /Tablet - x KCNE2 +/-
cruzes [7]. Os dados numéricos foram analisados ​​com o software Excel (Microsoft), utilizando-se análise de variância (ANOVA) com significância estatística definida em P
. < 0,05</sup>

Histologia

Para histologia e massa estômago quantificação, KCNE2 <sup>+ /+ Comprar e KCNE2
- /- ratos em 3 semanas, 3 meses e 12-15 meses foram sacrificados usando CO _{2 asfixia (5-10 por genótipo). Os estômagos foram removidos post mortem, estômago massa determinada, em seguida, tecido do estômago foi fixado em 10% de formalina tamponada neutra, processados ​​por métodos de rotina e embebido em cera de parafina. seções da mucosa gástrica foram cortados em 5 mm intervalos, colocados em lâminas Superfrost carregados positivamente, corados com hematoxilina e eosina (H & E)., e avaliada com um microscópio Olympus BX45}</sup>

Imunohistoquímica

detecção imunohistoquímica de Ki67, CK-7 e TFF2 (também conhecido como péptido espasmolítico) foi realizada utilizando um processador de Descoberta XT (Ventana Medical Systems). As concentrações de anticorpos primários utilizados foram: 0,05 ng /ml (anticorpo policlonal de coelho anti-Ki67, Vector Labs); 1 ng /ml (anticorpo monoclonal de ratinho anti-CK-7; Abcam); 1 ug /ml (monoclonal de ratinho anti-TFF2; Abcam). Precedendo incubação do anticorpo primário, as secções de tecido foram bloqueadas por soro de cabra normal 30 min em 10%, 2% de BSA em PBS (anti-Ki67); 30 min em soro de cabra normal a 10%, 2% de BSA em PBS e a avidina /biotina para 8 min (anti-CK-7); 30 min em soro de cabra normal a 10%, 2% de BSA em PBS e avidina /biotina durante 4 min (anti-TFF2). vezes anticorpo incubação primários foram: 3 hr (Ki67 e CK-7); 5 horas (anti-TFF2). As incubações do anticorpo secundário foram: 32 min em 1:200 IgG anti-coelho de cabra biotinilado (Vector Labs) para Ki67; 60 min em 1:200 cavalo biotinilado de rato anti IgG (Vector Labs) para CK-7 e TFF2. Para Ki67 incubação do anticorpo secundário, o bloqueador de D, Estreptavidina-HRP e kit de detecção de DAB (Ventana Medical Systems) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Para CK-7 e TFF2, IgG1 de ratinho (5 ug /ml) foi usado como um controlo negativo do isotipo, e Bloqueador D, Estreptavidina-HRP e kit de detecção de DAB (Ventana Medical Systems) foram usadas.

Para Ciclina detecção D1, estômago lâminas foram aquecidas a 58-60 ° C durante 30 min e, em seguida, desparafinizados. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada por secções a incubar em 1% de peróxido de hidrogénio em PBS durante 15 min (8,3 ml 30% H _{2O 2 /241,7 ml de PBS), seguido de desmascaramento do epitopo antigénico por microondas em Citrato 10 mM tampão com alto poder por 15 min. As lâminas foram arrefecidas durante 20 min, lavadas em água destilada durante 5 minutos, transferidas para PBS e incubadas em soro de cavalo normal a 10% (em 2% de BSA-PBS diluente) durante 30 minutos numa câmara húmida. Monoclonal de rato anti-ciclina D1-anticorpo (Cell Signaling) foi adicionado a 1:1000 com 2% de BSA em PBS e incubados durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida. As lâminas foram lavadas em PBS e aplicou-se o anti-IgG do rato anticorpo secundário cavalo biotinilado (Vector Labs) em 1:500 em PBS durante 30 min à TA. As lâminas foram lavadas e um complexo de (kit Vectastain ABC Elite, Vector Labs) Avidina-Biotina diluída a 1:25 em PBS, foi aplicada durante 30 minutos. O sinal foi detectado por incubação em 3,3-diaminobenzidina (Sigma, Lote N ° 026K3767) até que a intensidade de cor desejada foi alcançada. Após lavagens finais em água, as lâminas foram ligeiramente contrastadas em hematoxilina. KCNQ1 e HKA β rotulagem única e detecção foram realizados como previamente descrito [7]. detecção de CD34 foi 1:50 com anticorpo anti-CD34 (Abcam). As lâminas foram vistos com um microscópio Nikon Eclipse E600 e fotografado usando uma câmera RT Cor e software SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.).}

Imunofluorescência

Todos os tecidos humanos foi obtida a partir ProSci, Poway, CA, e foi certificado como tendo sido obtido a partir de serviços de patologia qualificados e licenciados, usando apropriado conformado consentimento para o uso em pesquisa biomédica e com a protecção do dador anonimato; portanto, aprovação adicional ética Weill Medical College Institutional Review Board não era necessária. detecção de imunofluorescência de β Hka KCNQ1, e KCNE2 em tecido gástrico humano (ProSci) foi realizada utilizando um processador de Descoberta XT (Ventana Medical Systems). Foram utilizados os seguintes tecidos humanos: tecido do estômago normal a partir de uma mulher de 50 anos de idade (PSC-10-809-XB1); tecido de carcinoma gástrico, informação do paciente disponível (PSC-10-814-CA1); tecido adenocarcinoma gástrico de uma mulher de 51 anos de idade (PSC-10-809-XA1). As concentrações de anticorpos primários utilizados foram: 0,5 mg /ml de anti-β Hka (monoclonal de ratinho, a afinidade Bioreagents), 1 mg /ml de anti-KCNQ1 (coelho ou cabra policlonal, Chemicon) e anti-soro KCNE2 in-house foi utilizado a uma diluição 1:500 depois IgG-enriquecendo coluna. Precedendo a incubação do anticorpo primário, as secções de tecido foram bloqueadas durante 30 minutos em soro de cabra normal a 10%, BSA a 2% em PBS, seguido de 8 min bloco de avidina /biotina. A incubação do anticorpo primário (3 h) foi seguido por 32 min de incubação com (kit ABC dos laboratórios Vector) biotinilado anti-IgG de ratinho, 60 min de incubação com IgG anti-cabra biotinilado (kit ABC dos laboratórios Vector), ou anti-coelho biotinilado anticorpo em 1:200 de diluição (Vectastain ABC kit). A detecção secundária foi realizada com estreptavidina-HRP D (Ventana Medical Systems), seguido por incubação com Tyramide-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ou Tyramide Alexa Fluor 568 (Invitrogen). lâminas coradas foram visualizadas com um Zeiss Axiovert 200 widefield microscópio e imagens foram adquiridas utilizando software Metamorph 7.1 (Molecular Devices).

Western blot

Para western blot, frações de membrana gástricos foram preparadas como descrito anteriormente [7]. Três estômagos dos 12 meses de idade, KCNE2 <sup>+ /+ Comprar e KCNE2
- /- ratos foram removidos post-mortem, corte aberto ao longo da curvatura ventrículos major, inocentado de ingesta e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. Os estômagos foram, em seguida, homogeneizados num tampão contendo Tris-HCl a 50, 150 mM de NaCl, 100 ug /PMSF mL, 1 ug /ml de Nonidet P40, 0,5% SDS e 0,5% de ortovanadato de sódio, em seguida, incubadas em gelo durante 30 min e centrifugou-se a 12000 × g
durante 20 min a 4 ° C. A concentração de proteína do sobrenadante foi medido de acordo com o método de Bradford. A proteína total (40 ug /pista) foi carregado num gel pré-moldados de Tris-glicina a 4-20% (Jule Inc., Milford, CT) e separados por electroforese. As proteínas foram então transferidas para uma membrana de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA), e bloqueadas com 5% de leite, 0,05% de Tween-20 em PBS durante 12 horas a 4 ° C num agitador rotativo. As incubações do anticorpo primário (4 hr, temperatura ambiente em leite a 1%, 0,05% de Tween-20, PBS, "Tampão A ') eram: 1:2000 anti-ciclina D1 (Abcam); 1:5000 anti-GAPDH (Abcam). As membranas foram lavadas 4 vezes, 20 minutos cada, com tampão de incubação de anticorpo, em seguida, incubadas com os anticorpos secundários adequados (BioRad) diluído em tampão A 1:10000 durante 2 h à TA, em seguida, lavou-se 4 x 20 minutos cada, com tampão A e uma vez durante 5 min com PBS.</sup>

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• PLOS ONE: Virus Epstein Barr e Helicobacter pylori Co-Infecção Positivamente está associada à gastrite grave em pacientes pediátricos