PLoS ONE: Gezielte Deletion von KCNE2 Ursachen Gastritis cystica profunda und Magen Neoplasia

Abstrakt

Magenkrebs weltweit die zweithäufigste Ursache für Krebstod ist. Prädisponierende Faktoren gehören achlorhydria, Helicobacter pylori
Infektion, oxyntic Atrophie und TFF2-exprimierenden Metaplasie. In Belegzellen, apikal Kaliumkanäle die KCNQ1 α-Untereinheit und die KCNE2 β umfasst die Untereinheit einen K liefern <sup>+ Ausstrom aktuellen Magensäuresekretion durch die apikal H + K + ATPase zu erleichtern. Dementsprechend genetische Deletion von murinen KCNQ1 oder in KCNE2
Magensäuresekretion beeinträchtigt. Andere Beweise in menschlichen Magenkrebszellproliferation, unabhängig von seiner Rolle in der Magen Versauerung eine Rolle für KCNE2 vorgeschlagen. Hier zeigen wir, dass 1-jährige KCNE2
- /- Mäuse in einer keimfreien Umgebung zeigen alle eine schwere Magen-präneoplastischen Phänotyp umfassend Gastritis cystica profunda, 6-fach erhöhte Magen Masse, erhöht Ki67 und Kern Cyclin D1-Expression und TFF2- und Cytokeratin 7-exprimierenden Metaplasie. Einige KCNE2
- /- Mäuse auch pyloric polypoid Adenome zeigten sich in den Zwölffingerdarm, und neoplastische Invasion von dünnwandigen Gefäße in der Sub-Schleimhaut. Schließlich Analyse von menschlichem Gewebe Magenkrebs angegeben reduzierten Parietalzelle KCNE2 Ausdruck. Zusammen mit früheren Ergebnissen, legen die Ergebnisse nahe KCNE2 Störung als möglicher Risikofaktor für Magen Neoplasie</sup>

Citation. Röpke TK, Purtell K, König EG, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) Gezielte Deletion von KCNE2
Gastritis cystica profunda und Magen-Neoplasien verursacht. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10.1371 /journal.pone.0011451

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Empfangen: 3. Mai 2010; Akzeptiert: 13. Juni 2010; Veröffentlicht am: 6. Juli 2010

© 2010 Röpke et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. G.W.A. wird durch das National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health (R01 HL079275), der American Heart Association (Grants-in-Aid 0855756D) und einer Irma T. Hirschl Career Scientist Award unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs bleibt eine der Hauptursachen der Sterblichkeit, und die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit. Magen-Karzinogenese ist ein Prozess, der durch mehrere Stufen, einschließlich oxyntic Atrophie, Geschwürbildung, Becherzellhyperplasie Hyperplasie, Hypo- und Achlorhydrie und Schleimhautzelle Metaplasie fortschreitet [1]. Trotz der Fortschritte in der Behandlung von Magenkrebs, ist relativ wenig über die molekularen Mechanismen in Magen Karzinogenese beteiligt bekannt, die Entwicklung normaler Magenschleimhaut in präneoplastischen Läsionen des Magens oder die potentielle Rolle für Ionenkanäle in diesen Prozessen.

Parietal Zellen erreichen durch eine apikale H ^{+ K + ATPase (HKA), die Protonen in das Magenlumen im Austausch für K + -Ionen Magen Versauerung pumpt. Um diese Aktivität aufrechtzuerhalten, K + Ionen aus der Belegzellen in das Magenlumen über die apikale Membran zurücklegen muss, fort Substrat für die HKA [2] zu gewährleisten. Diese K + Ionen-Ausstoss erfolgt durch eine oder mehrere Arten von apikal, K + - selektive Kanäle. Mehrere Einwärtsgleichrichter (Kir) Kanäle werden in diesem Prozess auf Basis von Belegzellen Ausdruck und pharmakologische Beweise [3], [4] verwickelt, aber so weit es genetische Beweise für nur einen Kanal, diese Rolle zu erfüllen: KCNE2-KCNQ1 [5] - [7]. KCNQ1 ist ein Sechs-Transmembran-Domäne α-Untereinheit aus dem S4 -Superfamilie, die funktionale Formen, spannungsgesteuerte homotetramerischen K + - selektive Kanäle in heterologe Expression Studien [8], [9]. KCNQ1 können auch heteromeren Kanal Komplexe mit Hilfsuntereinheiten vom KCNE Genfamilie bilden, und alle fünf bekannten KCNE Genprodukte haben gezeigt, dass KCNQ1 Funktion in heterologen Expressionsstudien [10] regulieren. Eine, KCNE2 wandelt KCNQ1 an einen spannungsunabhängigen, konstitutiv-aktiven Kanal, dessen Strom durch niedrigen pH-Wert erhöht wird. KCNE2 und KCNQ1 beide auf oder nahe der Parietalzellen apikalen Membran exprimiert und Zielgen Deletion entweder -Untereinheit Ergebnisse in achlorhydria aufgrund beeinträchtigter Magensäuresekretion [5] - [7]. So sind KCNE2-KCNQ1-Kanäle von wesentlicher Bedeutung für die Sekretion von Magensäure und dachte, als luminalen K + -Ionen als Substrat für die Magen-HKA bereitzustellen}

KCNQ1
<sup>-. /- Mäuse und KCNE2
- /- Mäuse zeigen ähnliche Magen-Phänotypen, von Achlorhydrie, Hypergastrinämie und Magen-Drüsen-Hyperplasie charakterisiert [5] - [7]. Parietal Zellen von entweder null Show ~ 10-fach reduzierten Kapazität von Proton Belastung zu erholen, einen primären Defekt der Sekretion von Magensäure hindeutet. KCNQ1
- /- Mäuse entwickeln auch Metaplasie, Dysplasie und prämalignen adenomatöse Hyperplasie des Magens unabhängig von Infektion [11]. Dies deutet darauf hin, dass KCNQ1 Dysfunktion magen Neoplasie unabhängig von H führen könnte. pylori
wegen schwerer achlorhydria oder einen zusätzlichen Risikofaktor dar, die in Verbindung mit H. pylori könnte
zu Magenkrebs prädisponieren</sup>

Die achlorhydria und Magen-Hyperplasie wir in früher beobachtet KCNE2
<sup>-. /- Mäusen war auffällig, dass die porenbildende Untereinheit des Komplex, KCNQ1, war noch vorhanden ist, und in der Tat war es stark in der doppelten Anzahl der Zellen pro Magen-Drüse in KCNE2 ausgedrückt
- /- Mäuse im Vergleich zu KCNE2
+ /+ Mäusen [7]. In einer aktuellen Studie wurde KCNE2 Ausdruck gefunden in relativ geringen Mengen in der menschlichen Magentumoren und bei Magenkrebs-Zelllinien exprimiert werden; Weiterhin gezwungen Überexpression von KCNE2 unterdrückt das Wachstum von menschlichen Magenkarzinomzellen in Gewebekultur und in Nacktmäusen [12]. Diese Erkenntnisse hob die faszinierende Möglichkeit, dass KCNE2 könnte im Magen Karzinogenese beteiligt sein und möglicherweise unabhängig von entweder H. pylori
Infektion oder Achlorhydrie. Hier, um die mögliche Rolle von KCNE2 definieren bei der Regulierung der normalen Magen-Zellwachstum, geprüft wir die Magen-Pathologie von KCNE2
- /-. Mäuse bis zu 15 Monate alt</sup>

Ergebnisse |

KCNE2 ^{- /-
Mäuse progressive Magen-Hyperplasie zeigen}

Wir zuvor gezeigt, dass KCNE2 für normale Regulation der Magenschleimhaut Zellwachstum erforderlich ist: 3- Monate alten KCNE2
<sup>- /- Mäuse haben Magen-Hyperplasie, achlorhydria und abnorme parietalen Zellmorphologie [7]. Hier verglichen wir die Magen Masse von 3-Wochen, 3-Monats- und 12 bis 15 Monate alten KCNE2
- /- Mäusen. Die Masse der Mägen bei 3 Wochen alt waren ähnlich für KCNE2 + /+
und KCNE2
- /- Mäuse, während spätestens 3 Monate gab es erhebliche Magen-Hyperplasie in KCNE2
- /- Mäusen. Dieser Unterschied war von 12-15 Monaten in dem Maße erhöht, dass KCNE2
- /- Mäusen hatten Mägen 6-fach größer als die von KCNE2 + /+ Mäusen
im gleichen Alter (Abbildung 1 A)</sup>

KCNE2 ^{-. /-
Mäuse zeigen Gastritis zystische profunda}

Selbst bei 3 Wochen alt, trotz ähnlicher Magen Masse, die der KCNE2 <sup>+ /+
Mäuse, Magenschleimhaut von KCNE2
- /- Mäuse zeigten bereits vacuolations nahe an der basolateralen Seite (Abbildung 1 B; vergrößert in D). Um das Fortschreiten der Magen-Hyperplasie zu untersuchen und ihre Folgen, insgesamt elf 12-15 Monate alten KCNE2
- /- Mäuse und fünf KCNE2 + /+
Mäuse wurden histologisch untersucht. Die Magenschleimhaut in alle KCNE2
- /- Mäuse zeigten Drüsenhypertrophie und diffuse Hyperplasie mit einer erhöhten Anzahl von Schleimhautzellen und Belegzellen, die gelegentlich vakuolisiert wurden (Abbildung 1 C). Auffallender, Gastritis cystica profunda (GCP) beobachtet wurde, in 11/11 KCNE2
- /- Mäuse, aber 0/5 der KCNE2
+ /+ Mäusen ( χ 2 p
= 0,002) (Vergrößerung der Zyste in Abbildung 1 E). Dilated Drüsen enthalten Zelltrümmer und, in einigen, aber nicht alle KCNE2
- /- Mäuse, Neutrophile. Es gab auch Magenepithelzellen Hyalinose mit gelegentlichen intraluminale Kristalle und lymphoplasmacytic Aggregate in der Schleimhaut, Submukosa und Muskularis. In einigen 12-15 Monate alten KCNE2
- /- Maus Mägen wurde prominent Lamina proprial Fibrose, vor allem in den oberflächlichen Schichten zur Kenntnis genommen. GCP, auch früher als gutartige Magenpseudo bezeichnet, in der Regel präsentiert als ein Spektrum von hyperplastischen und metaplastischen Veränderungen nach Schäden an der Magenschleimhaut. Während GCP histologische Eigenschaften im Zusammenhang mit malignen Erkrankungen zeigt, ist es an sich im Allgemeinen funktionell gutartig - obwohl es als ein möglicher Risikofaktor für Magenkrebs wurde vorgeschlagen, [13], [14]</sup>

erhöhte Proliferationsmarker im Magen. Schleimhaut von KCNE2 ^{- /-
Mäuse}

Wichtig ist, dass die Expression von etablierten präneoplastischen Marker in erhöht wurde KCNE2
<sup>- /- Mäuse im Vergleich zu KCNE2
+ /+ Mäusen. Ki67 Antigen ein Zellzyklus bezogen Kernprotein üblicherweise als Proliferationsmarker verwendet in proliferierenden und neoplastischen Geweben, einschließlich Magen [15]. Ki67-Färbung in den Abschnitten von KCNE2
+ /+ Maus Mägen (3 Monate), um eine kleine Gruppe von Ki67-positiven Zellen innerhalb der isthmisch Regionen Magendrüsen angegeben, während diese proliferative Raum deutlich in alters- erweitert wurde abgestimmt KCNE2
- /- Mäuse (Abbildung 2 A-C). Epithel zystische Bereiche GCP in 12 Monate alten KCNE2
- /-. Mäuse zeigten auch prominente Färbung der Kerne mit Ki67, was auf eine hohe Proliferationsrate (Abbildung 2 B)</sup>

Cytokeratin (CK) -7 ist ein 54 kDa-Polypeptid in einer Vielzahl von epithelialen Geweben, einschließlich Lunge, Brust, und fetalen menschlichen Magen exprimiert wird; es ist jedoch nicht in normalen erwachsenen gastrointestinalen Epithels exprimiert [16]. Hochregulation von CK-7, bezeichnend für Entdifferenzierung, war offensichtlich in KCNE2
<sup>- /- Magenschleimhaut nach 12 Monaten; bei gleichaltrigen KCNE2
+ /+ Mäusen, Magenschleimhaut positive Epithelzellen waren viel seltener (Abbildung 2 D). CK-7 war auch prominente um Zysten (Abbildung 2 E)</sup>

TFF2-exprimierenden Metaplasie in der Magenschleimhaut von KCNE2 ^{-. /-
Mäuse}

Trefoil- Faktor-Familie (TFF) 2-exprimierenden Metaplasie wird beim Menschen mit der Progression zu Magenkrebs assoziiert und in der mongolischen Wüstenrennmäuse infiziert mit H. pylori
[17]. Magenschleimhaut von KCNE2
^{- /- Mäuse zeigten Bereichen Metaplasie mit prominenten TFF2 Expression in Epithelzellen einschließlich Futter Zysten (Abbildung 3 A-C). TFF2 exprimierenden Metaplasie ist typischerweise mit oxyntic Atrophie verbunden sind, als ein Verlust der Belegzellen charakterisiert [1]. Hier haben wir untersucht Magenschleimhaut von 12 Monate alten Mäusen mit TFF2 exprimierenden Metaplasie zur Expression der β-Untereinheit HKA (HKA β), ein Belegzellen-Marker. Erstaunlicherweise gab es keine Anzeichen von oxyntic Atrophie in Bezug auf die Zahl der Belegzellen (Abbildung 4 A). Ferner wurde HKA β in Zellen exprimiert Zysten (Abbildung 4 B)}

Erhöhte Magenschleimhaut Cyclin D1-Expression und Magen-Neoplasien in KCNE2 ^{Futter -. /-
Mäuse}

verminderte Expression KCNE2 wurde zuvor vorgeschlagen, die Proliferation in der Magenkrebs-Zelllinie SGC7901 über eine erhöhte Expression von Cyclin D1 [12] zu verbessern. Hier Western-Blots vorgeschlagen, dass KCNE2
Gen-Deletion insgesamt Cyclin D1-Expression in der Magenschleimhaut von 12 Monate alten Mäusen (Abbildung 5 A) erhöht. Cyclin D1 zeigten schwach und überwiegend Cytoplasma-Expression auf der Basis von KCNE2
<sup>+ /+ oxyntic Drüsen (Abbildung 5 B, C, linke Felder), wie zuvor für normalen, proliferierenden Zellen in Mäusemagen beschrieben [ ,,,0],18]. Im Gegensatz dazu ist in KCNE2
- /- Mäuse zeigten Cyclin D1 weiter verbreitet und Kernfärbung in den Hals Isthmus Region von Magendrüsen und Drüsen Grube (Abbildung 5 B, C, rechte Felder). In zwei von elf 1-jährigen KCNE2
- /- Mäusen analysiert wurden pyloric polypoid Adenome beobachtet, in das Duodenum erstreckt (Abbildung 5 D). Die beiden gleichen KCNE2
- /- Mäuse auch neoplastischem Wachstum in Form von Thromben, bestehend aus Fibrin und Drüsenepithel, in dünnwandige Gefäße (identifiziert unter Verwendung von endothelialen Marker CD34) innerhalb des Magen-Submukosa ausgestellt ( Abbildung 5 E-H).</sup>

reduzierte Parietalzelle KCNE2 Expression in menschlichen Magenkrebsgewebe

Da in einer früheren Studie reduziert KCNE2 Ausdruck gefunden wurde Magenkrebs-Zelllinie Proliferation zu verbessern und KCNE2 Expression wurde in menschlichen Magenkrebs [12] reduziert werden gefunden, die wir untersucht KCNE2 Expression in normalen menschlichen Magenschleimhaut und Magenkrebsgewebe. Immunofluoreszenz-Studien auffallende Unterschiede gegenüber KCNE2 und KCNQ1 Kolokalisation offenbart, zwischen normalen und malignen menschlichen Magenschleimhäuten. Wie erwartet, KCNQ1 und KCNE2 kolokalisiert stark in Belegzellen in normalen menschlichen Magenschleimhaut (Abbildung 6 A), wie auch KCNQ1 und HKA β (Abbildung 6 B). Im Gegensatz dazu, selten in menschlichen Magenkarzinome, KCNQ1 und KCNE2 Expression überlappt (Abbildung 6 C, D), obwohl KCNQ1 seine starke Co-Lokalisierung mit HKA β (Figur 6 E) erhalten. KCNE2 Ausdruck in Belegzellen So wurde selten in Magenkarzinom beobachtet. Der Mangel an KCNE2-KCNQ1 Co-Lokalisation war noch tiefer in der menschlichen Adenokarzinom des Magens (6 F), die wiederum beibehalten Co-Lokalisation von KCNQ1 und HKA β (Abbildung 6 G).

Diskussion

Kaliumkanäle in proliferative Erkrankungen

Kaliumkanäle haben als potentielles Ziel für Anti-Krebs-Therapien entstanden [19], einschließlich KCNQ1, hERG und Kv2.1, von denen alle α-Untereinheit Partner KCNE2 sind. Gestörte Prägung durch Mutationen im KCNQ1-Gen Ursache Beckwith-Wiedemann-Syndrom (BWS) verursacht, die zu Krebs prädisponiert [20] - [22], und KCNQ1 Knockout prädisponiert zu Magen-Metaplasie [11]. Der hERG Kaliumkanal α-Untereinheit, die Komplexe mit dem KCNE2 Hilfsuntereinheit in menschlichen Herzens [23] bildet, ist in einigen Tumoren überexprimiert und wurde identifiziert als Tumor Überlebensfaktor [24] - [27] als Kv2 hat. 1 [28].

KCNE2 wurde zuvor gefunden ausgedrückt werden 2-fach niedriger in menschlichen Magenkrebsgewebe als in den Nachbar normalen Magen-Zellen, und gezwungen upregulation von KCNE2 hatte anti-proliferative Wirkung auf die Magenkrebszellen in-vitro-
und in Nacktmäusen injiziert [12]. Der postulierte Mechanismus für diese anti-proliferative Effekt ist Herabregulierung von Cyclin D1, die Progression durch den Zellzyklus zu verzögern [12] ähnlich dem, was mit dem hERG blocker Cisaprid beobachtet wurde [29]. Erhöhte Expression von Cyclin D1 in menschlichen Magentumoren korreliert mit einer besonders schlechten Prognose [30], also Faktoren zu verstehen, die Cyclin D1-Expression erhöhen, um therapeutische Möglichkeiten für diese und andere Formen von Krebs führen kann. Die Überexpression von Cyclin D1 wurde vorgeschlagen, zu oncogenesis beitragen, indem sie den Zellzyklus zu stören, und wurde berichtet, dass ein wichtiger onkogenen Faktor in Ösophaguskarzinom zu sein [31], und mit der nuklearen Anreicherung von β-Catenin in ovarian endometrioid Adenokarzinomen assoziiert [32]; Kern Cyclin D1-Überexpression in Gallenblase Karzinomen ist ein kritisches Ereignis [33].

Hier beschreiben wir umfangreiche metaplastischen Veränderungen im Magen-muscosa durch genetische Störung von KCNE2
. Dies ist mit einer erhöhten Kern Cyclin D1-Expression in der Magenschleimhaut, erinnert an die Ergebnisse früherer In-vitro-Studien
von KCNE2 [12] verbunden. Weder der vorliegende Bericht noch die vorherige Studie jedoch beschreiben den Mechanismus für Cyclin D1 upregulation in KCNE2
^{- /- Schleimhaut - ist es eine Folge von metaplastischen Veränderungen Sekundär in diesen Mäusen zu Achlorhydrie, oder ist es einen direkten Zusammenhang zwischen der KCNE2
und Cyclin D1? Die Studie von Yanglin und Kollegen spricht für diese zumindest teilweise, weil in ihrer Studie traten die Cyclin D1 Veränderungen in isolierten Zellen ohne den Einfluss von achlorhydria [12]. Wir sind der Ansicht, dass Änderungen sekundär zu achlorhydria die wahrscheinlichste dominierende Faktor sind, aber eine direkte Verbindung nicht ausgeschlossen werden kann. Interessanterweise hERG, ein weiterer Partner von KCNE2 wird bei Magenkrebs-Zellen exprimiert, aber nicht normale Magen-Epithelien und der Kanalblocker Cisaprid hERG wurde zuvor durch die Hemmung der Eintritt in die S-Phase von G (1) Phase in der Magenkrebs-Zellwachstum zu unterdrücken gefunden Zellzyklus, Apoptose zunehmende [29]. Da KCNE2 partielle Ausblendung Ströme hERG durch einheitliche Leitfähigkeit zu verringern und die Beschleunigung Deaktivierung [23], ist es eine faszinierende Möglichkeit, dass die beobachteten anti-proliferative Wirkung von KCNE2 Überexpression In-vitro-
[12] sind aufgrund hERG Stromunterdrückung Förderung Apoptose, und umgekehrt, dass KCNE2 Herunterregulierung oder genetische Störung kann eine Magen zelluläre Proliferation begünstigen durch hERG steigender Stromdichte}

GCP und TFF2-exprimierenden Metaplasie (SPEM) in KCNE2 ^{-. /-
Mäuse}

GCP kann mit intermittierender Magenschmerzen, Blähungen, Magen-Obstruktion oder oberen Magen-Darm-Blutungen bei Menschen darstellen, und wird am häufigsten bei Patienten mit einer Vorgeschichte von entweder Gastrektomie oder Gastrostomie [34] gesehen. Allerdings haben einige Fälle wurden ohne Verein vor Magen-Operation berichtet [35], [36]. Die Pathogenese des menschlichen GCP wird angenommen, dass von einer Verletzung des Muscularis mucosae entstehen, die zu Eileiter einschließende von Magendrüsen in der Submukosa führen kann, muscularis mucosae oder Serosa oder an einer chronischen Entzündung. GCP ist häufig eine gutartige klinische Entität betrachtet, obwohl Zusammenhang mit Magenkrebs berichtet wurde [14], [37], [38].

Bei Labortieren GCP sekundär zu Helicobacter sp
. Infektion wurde als Vorläufer der intramuköse Dysplasie und Neoplasie [39], und im Zusammenhang mit der Entwicklung von Magenkarzinomen beschrieben. GCP wurde häufig in H gefunden. pylori
infiziertem Mongolische Rennmäuse, die auch Adenokarzinom des Magens und lymphatischen Hyperplasie [40] entwickelt. In einem früheren murinen genetischen Modell von GCP, TGF beta 1 <sup>+/- Mäuse entwickelten Drüsenhyperplastischen Läsionen, die morphologische Merkmale mit menschlichen GCP, mit gemischten entzündlichen Infiltration der umgebenden Schleimhaut und chronische Vaskulitis in den Geweben neben diesen Läsionen geteilt [ ,,,0],41]. Hier in KCNE2
- /- Mäusen, GCP tritt in Abwesenheit einer primären entzündlichen Läsion und unabhängig von vaskulären obliteration. Stattdessen schlagen wir vor, dass der primäre Defekt Verlust der β-Untereinheit von Kanal-Komplexe mit KCNQ1 KCNE2 ist und damit einen wichtigen apikal K + Recycling Weg in Belegzellen zu beeinträchtigen und Magen-Versauerung durch die Belegzellen HKA zu verhindern. Während dies eine "funktionelle Atrophie" in der Belegzellen Bevölkerung darstellt, eine tatsächliche Verlust der Belegzellen in früheren Studien mit intestinale Metaplasie "oxyntic Atrophie" bezeichnet, wurde ein wichtiger Prozess bei der Entstehung von intestinale Metaplasie, im Zusammenhang mit saurem Reflux-Krankheit betrachtet oder H. pylori
Infektion und ist die häufigste metaplastischen Prozess im oberen Gastrointestinaltrakt beobachtet [42].</sup>

Oxyntic Atrophie in Abwesenheit signifikanter Entzündung kann durch DMP-777, einem Neutrophilen-Elastase-Inhibitor induziert werden, die richtet sich auch auf seine Wirkung durch als protonophore Belegzellen [43]. Oxyntic Atrophie in Magen-defizienten Mäusen nach der Behandlung mit DMP-777, führt rasch zu TFF2 exprimierenden Metaplasie, die auch als krampflösende Peptid exprimierenden Metaplasie (SPEM) bezeichnet [44]. SPEM ist bemerkenswert wegen seiner starken Assoziation mit menschlichen Adenokarzinom des Magens, und es wird in der Mehrzahl der Fundusdrüsen-Biopsien von menschlichen H beobachtet. pylori Gastritis
-infizierten Patienten [45]. Das Auftreten von SPEM in KCNE2
<sup>- /- Mäusen in Abwesenheit von entweder H. pylori in oder klassische oxyntic Atrophie legt nahe, dass die "funktionelle Atrophie", verursacht durch KCNE2
Löschen genug sein kann SPEM auszulösen. Ein wesentlicher Unterschied zwischen KCNE2
- /- Mäuse und die in der Nozaki Studie ist, dass KCNE2
- /- Mäuse sind hypergastrinemic, nicht Gastrin-Mangel. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass DMP-777 ein Magen tubulovesicle Protonengradient stört ohne Beeinträchtigung H + K + - ATPase-Funktion, während gezielte KCNE2
Störung verhindert H + /K + -ATPase-Funktion durch seine luminale Substrat entfernt, K + -Ionen [7], [44]. Vielleicht ist diese letztere Mechanismus in der Zukunft offenbaren Hinweise in Bezug auf die kritischen Ereignisse in oxyntic Atrophie, die in SPEM führen: es derzeit wird vorgeschlagen, dass SPEM Induktion ergibt sich aus einem Mangel an Belegzellen abgesonderten Regulatoren der normalen Magenschleimhaut Erneuerung, die sonic hedgehog umfassen und TGF-α [46], [47] durch den Verlust von Parietalzellen. Weitere Studien von KCNE2
- /- Belegzellen -, die noch vorhanden sind, aber eine Fehlfunktion - Regler kann sich herausstellen, die sie noch ausscheiden können, und solche, die sie nicht können</sup>

Die Magenschleimhaut. von KCNE2
<sup>- /- Mäuse zeigen auch eine erhöhte Expression des etablierten Proliferationsmarker Ki67, wie eine Erhöhung der Breite der Schleimhaut proliferative Band manifestiert, und als Ki67-positive Zellen entlang der Zysten in den Regionen von GCP. In ähnlicher Weise CK7 die de-Differenzierungsmarker, nicht in 1-jährige ausgedrückt KCNE2
+ /+ Magenschleimhaut wurde in der von allgemein ausgedrückt KCNE2
- /- Mäusen. Unter diesen und die Markierungen oben zusammen beschrieben, die KCNE2
- /- Magenschleimhaut zeigt Metaplasie mit mehreren Funktionen von preneoplasia, und in einigen Fällen Neoplasie, insbesondere in einem spezifischen Pathogen-freie Umgebung ohne Anzeichen von Magen Helicobacter
Infektion oder oxyntic Atrophie, und in Abwesenheit von chemischen Inhibitoren von Magen Ansäuerung. Zusammen mit der Erkenntnis hier, dass Belegzellen KCNE2 Ausdruck erscheint in menschlichen Magenkrebsgewebe (Abbildung 4) und dem vorherigen Bericht reduziert werden, dass KCNE2 Magenkrebs-Zellproliferation [12] hemmt, legen die Daten nahe KCNE2 Störung mit Magenkrebs Progression assoziiert ist. Zukünftige Studien werden einbeziehen zu prüfen, ob KCNE2
Störung Prädisposition für Magenkrebs innerhalb Erreger und Karzinogen-basierte Protokolle erhöht, die Mechanismen hinter diesen möglichen Unterschiede, und die möglichen mechanistischen Verbindungen zwischen KCNE2
, Cyclin D1 und Zellzyklus-Störung außerhalb des Bereichs der achlorhydria-assoziierten Krankheit Ätiologie. Ferner ist, wie KCNQ1 und KCNE2 werden auch in Schilddrüsen Epithelzellen exprimiert CO-, wo sie für Schilddrüsenhormon-Biosynthese wichtig sind [48], wird es von Interesse sein, eine mögliche Rolle für KCNE2 in abnormal thyrocyte Proliferation zu untersuchen.</sup>

Materialien und Methoden

Generation und die Verwendung von Gen-Targeting-Mäuse

Alle in dieser Studie beschriebenen Mäuse wurden nach NIH und der Cornell University Institutional Animal Care und Use Committee Richtlinien untergebracht ist, verwendet und eingeschläfert. Alle Mäuse in dieser Studie beschrieben wurden untergebracht ist, verwendet und eingeschläfert nach NIH und Weill Medical College Institutional Animal Care und Use Committee-Richtlinien. Ethische Zustimmung zu züchten und zu ernten Gewebe von Wildtyp und KCNE2
<sup>- /- Mäuse für die biomedizinische Forschung wurde genehmigt von Weill Medical College Institutional Animal Care und Use Committee (Protokoll 0704-610A). KCNE2
- /- Mäuse von C57BL wie zuvor beschrieben /6 KCNE2 + /
erzeugt wurden - x KCNE2 +/-
Kreuze [7]. Numerische Daten wurden mit EXCEL-Software (Microsoft) analysiert Einwegvarianzanalyse (ANOVA) mit statistischer Signifikanz gesetzt bei P
. ≪ 0,05</sup>

Histologie

Für Histologie und Magen Masse Quantifizierung, KCNE2 <sup>+ /+
und KCNE2
- /- Mäusen nach 3 Wochen, 3 Monate und 12-15 Monate wurden unter Verwendung von CO geopfert _{2 Erstickung (5-10 pro Genotyp). Die Mägen wurden entfernt post-mortem, Magenmasse bestimmt, dann Magengewebe in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert wurde, durch Routineverfahren verarbeitet und in Paraffinwachs eingebettet. Magenschleimhaut Abschnitte bei 5 &mgr; m Abständen geschnitten wurden, platziert auf positiv geladenen Superfrost Dias, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Und ausgewertet mit einem Olympus BX45 Mikroskop}</sup>

Immunhistochemie

immunhistochemische Detektion von Ki67, CK-7 und TFF2 (auch spasmolytische Peptid bekannt ist) wurde unter Verwendung eines Discovery-XT Prozessor (Ventana Medical Systems) durchgeführt. Die primären Antikörperkonzentrationen wurden verwendet: 0,05 &mgr; g /ml (polyklonaler Kaninchen-anti-Ki67, Vector Labs); 1 &mgr; g /ml (monoklonaler Maus anti-CK-7; Abcam); 1 &mgr; g /ml (monoklonaler Maus anti-TFF2; Abcam). Vorstehenden primären Antikörper Inkubation Gewebeschnitte wurden für 30 min in 10% normalem Ziegenserum, 2% BSA in PBS (anti-Ki67) blockiert; 30 min in 10% normalem Ziegenserum, 2% BSA in PBS und Avidin /Biotin für 8 min (anti-CK-7); 30 min in 10% normalem Ziegenserum, 2% BSA in PBS und Avidin /Biotin für 4 min (anti-TFF2). Primärantikörper Inkubationszeiten waren: 3 hr (Ki67 und CK-7); 5 Stunden (anti-TFF2). Sekundär-Antikörper-Inkubationen waren: 32 min in 1:200 biotinyliertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Vector Labs) für Ki67; 60 min in 1:200 biotinyliertem Pferde-anti-Maus-IgG (Vector Labs) für CK-7 und TFF2. Für Ki67 sekundären Antikörper Inkubation Blocker D, Streptavidin-HRP und DAB-Nachweis-Kit (Ventana Medical Systems) wurden nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Für CK-7 und TFF2, Maus IgG1 (5 ug /ml) wurde als Isotyp negative Kontrolle und Blocker D, Streptavidin-HRP und DAB-Nachweis-Kit (Ventana Medical Systems) wurden verwendet.

Für Cyclin D1 Detektions wurden Magenobjektträger 30 min bei 58-60 ° C erhitzt und dann entparaffiniert. Endogene Peroxidaseaktivität wurde 15 min durch Inkubieren Abschnitte in 1% Wasserstoffperoxid in PBS blockiert (8,3 ml 30% H _{2 O 2 /241,7 ml PBS) durch Demaskierung des antigenen Epitops gefolgt von in 10 mM Citrat microwaving Puffer bei hoher Leistung für 15 min. Die Objektträger wurden für 20 min abgekühlt, für 5 min in destilliertem Wasser gewaschen, bis PBS überführt und in 10% normalem Pferdeserum (in 2% BSA-PBS Verdünnungsmittel) für 30 min in einer feuchten Kammer inkubiert. Maus monoklonaler anti-Cyclin D1-Antikörper (Cell Signaling) wurde bei 1:1000 mit 2% BSA in PBS zugegeben und über Nacht bei 4 ° C in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Objektträger wurden in PBS und die Sekundär biotinyliertem Pferde-anti-Maus-IgG-Antikörper (Vector Labs) wurde für 30 min bei RT bei 1:500 in PBS gespült angewendet. Die Objektträger wurden gewaschen und einem Avidin-Biotin-Komplex (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Labs) wurde für 30 min angelegt, um 1:25 in PBS verdünnt. Das Signal wurde in 3,3-Diaminobenzidin (Sigma, Chargen-Nr 026K3767), bis die gewünschte Farbintensität wurde erreicht durch Inkubation nachgewiesen. Nach dem letzten Waschen in Wasser wurden die Objektträger in Hämatoxylin leicht gegengefärbt. KCNQ1 und HKA β einzigen Markierung und zum Nachweis durchgeführt wurden, wie zuvor beschrieben [7]. CD34-Detektion erfolgte mit 01.50 anti-CD34-Antikörper (Abcam). Die Objektträger wurden mit einem Nikon Eclipse-E600 Mikroskop betrachtet und fotografiert mit einer RT-Farbkamera und SPOT-Software (Diagnostic Instruments, Inc.).}

Immunofluoreszenz

Alle menschlichen Gewebe aus Prosci erhalten wurde, Poway, CA, und wurde bescheinigt, dass der von qualifizierten und lizenzierten Pathologie Dienstleistungen erhalten worden ist, unter Verwendung von geeigneten Zustimmung in der biomedizinischen Forschung und die Anonymität des Spenders Schutz für den Einsatz angepasst; daher wurde zusätzliches Weill Medical College Institutional Review Board Ethik Genehmigung nicht erforderlich. Immunfluoreszenz-Nachweis von HKA β, KCNQ1 und KCNE2 in menschlichen Magengewebe (Prosci) wurde mit einem Discovery-XT-Prozessor (Ventana Medical Systems) durchgeführt. Die folgenden menschlichen Geweben wurden verwendet: normale Magengewebe von einer 50-jährigen Frau (PSC-10-809-XB1); Magenkarzinomgewebe, Patienteninformationen nicht verfügbar (PSC-10-814-CA1); Adenokarzinom des Magens Gewebe von einem 51-jährigen Frau (PSC-10-809-XA1). Die primären Antikörperkonzentrationen wurden eingesetzt: 0,5 mg /ml anti- HKA β (Maus-monoklonal, Affinity Bioreagents), 1 mg /ml anti-KCNQ1 (Kaninchen oder Ziegen polyklonale, Chemicon) und in-house anti-KCNE2 Serum wurde verwendet, um eine 1:500 Verdünnung nach Spalte-Anreicherung IgG. Vor der primären Antikörper-Inkubation wurden die Gewebeschnitte für 30 min in 10% normalem Ziegenserum blockiert, 2% BSA in PBS, gefolgt von 8 min Avidin /Biotin-Block. Der primäre Antikörper Inkubation (3 h) wurde mit biotinyliertem anti-Maus-IgG (ABC Kit von Vector Labs) nach 32 min Inkubation, 60 min Inkubation mit biotinylierten anti-Ziege IgG (ABC Kit von Vector Labs) oder biotinyliertem anti-rabbit Antikörper bei 1:200 Verdünnung (Vectastain ABC-Kit). Die sekundäre Erfassungs wurde mit Streptavidin-HRP D (Ventana Medical Systems) durchgeführt, gefolgt von Inkubation mit Tyramid-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) oder Tyramid Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Stained Objektträger wurden mit einem Zeiss Axiovert 200 Weitfeld- Mikroskop betrachtet und Bilder wurden mit MetaMorph Software erworben 7.1 (Molecular Devices).

Western-Blot

Für das Western Blotting wurden Magen-Membranfraktionen hergestellt, wie zuvor beschrieben, [7]. Drei Mägen von 12 Monate alten KCNE2 <sup>+ /+
und KCNE2
- /- Mäuse wurden entfernt post-mortem, aufgeschnitten entlang der curvatura großen ventriculi, geräumt ingesta und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Mägen wurden dann in einem Puffer homogenisiert, der 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 ug /ml PMSF, 1 ug /ml Nonidet P40, 0,5% SDS und 0,5% Natriumorthovanadat, dann für 30 min auf Eis inkubiert und zentrifugiert, um 12000 × g
für 20 min bei 4 ° C. Die Proteinkonzentration des Überstandes wurde nach dem Bradford-Verfahren gemessen. Gesamtprotein (40 &mgr; g /Spur) wurde in einen vorgegossenen Tris-Glycin 4-20% Gel (Jule Inc, Milford, CT) und durch Elektrophorese geladen. Die Proteine ​​wurden dann auf eine PVDF-Membran überführt (Bio-Rad, Hercules, CA) und blockiert mit 5% Milch, 0,05% Tween-20 in PBS für 12 Stunden bei 4 ° C auf einem Schüttler. Primäre Antikörper-Inkubationen (4 h, RT in 1% Milch, 0,05% Tween-20, PBS, 'Puffer A') waren: 1:2000 anti-Cyclin-D1 (Abcam); 1:5000 anti-GAPDH (Abcam). Membranen wurden 4-mal gewaschen, jeweils 20 min mit Puffer Antikörperinkubation dann mit den entsprechenden Sekundärantikörper (BioRad) verdünnt 1:10000 in Puffer A für 2 Stunden bei RT inkubiert, dann 4 × 20 min gewaschen mit jeweils Puffer A und einmal für 5 min mit PBS.</sup>

• PLoS Pathogens: Caveolin-1 Schützt B6129 Mäuse gegen Helicobacter pylori Gastritis
• PLoS ONE: Epstein-Barr-Virus und Helicobacter pylori Co-Infektion positiv verbunden mit schweren Gastritis bei pädiatrischen Patienten