PLOS ONE: Suppression ciblée de KCNE2 Causes Gastrite kystique Profunda gastrique et néoplasie

Résumé

Le cancer gastrique est la deuxième cause de décès par cancer dans le monde. Les facteurs prédisposants comprennent achlorhydria, Helicobacter pylori
infection, l'atrophie oxyntique et métaplasie de TFF2 exprimant. Dans les cellules pariétales, les canaux potassiques apical comprenant la KCNQ1 α sous-unité et les β KCNE2 sous-unité fournir un K Courant <sup>+ d'efflux pour faciliter la sécrétion d'acide gastrique par le apical H + K + ATPase. En conséquence, la suppression génétique de souris KCNQ1
ou KCNE2
altère la sécrétion d'acide gastrique. D'autres preuves ont suggéré un rôle pour KCNE2 dans l'estomac prolifération des cellules cancéreuses humaines, indépendamment de son rôle dans l'acidification gastrique. Ici, nous démontrons que le 1-year-old KCNE2
- /- souris dans un environnement exempt d'agents pathogènes présentent toutes un gastrique phénotype prénéoplasique comprenant profunda gastrite cystica sévère, 6 fois augmentation de la masse de l'estomac, a augmenté Ki67 et nucléaire expression de la cycline D1 et TFF2- et cytokératine 7 exprimant métaplasie. Certains KCNE2
- /- souris ont également présenté des adénomes polypoïdes pylore se prolongeant dans le duodénum et l'invasion néoplasique des minces parois des vaisseaux dans la sous-muqueuse. Enfin, l'analyse des tissus du cancer gastrique humain indiqué cellules pariétales réduite KCNE2 expression. Ensemble avec les résultats précédents, les résultats suggèrent une perturbation KCNE2 comme un facteur de risque possible pour néoplasie gastrique</sup>

Citation:. Roepke TK, Purtell K, roi CE, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) deletion ciblée de KCNE2
Causes Gastrite kystique Profunda gastrique et néoplasie. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10.1371 /journal.pone.0011451

Editeur: Xin-yuan Guan, l'Université de Hong Kong, la Chine

Reçu: 3 mai 2010; Accepté: Juin 13 2010; Publié 6 Juillet, 2010

Droit d'auteur: © 2010 Roepke et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. G.W.A. est soutenu par le National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health (R01 HL079275), l'American Heart Association (Grant-In-Aid 0855756D), et une Hirschl carrière en recherche Irma T.. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique reste l'une des principales causes de mortalité, et la deuxième cause de décès par cancer, dans le monde entier. carcinogenèse gastrique est un processus qui progresse à travers plusieurs étapes, y compris l'atrophie oxyntique, la formation d'ulcères, l'hyperplasie fovéolaire, hypo- et achlorhydrie et métaplasie des cellules muqueuses [1]. Malgré les progrès dans le traitement du cancer gastrique, on sait relativement peu sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la carcinogenèse gastrique, le développement de la muqueuse gastrique normale dans les lésions gastriques précancéreuses, ou le rôle potentiel des canaux ioniques dans ces processus.

pariétal les cellules atteignent l'acidification gastrique en vertu d'un apical H ^{+ K + ATPase (HKA) qui pompe protons dans la lumière de l'estomac, en échange de K + ions. Pour maintenir cette activité, K + ions doit se déplacer à partir de la cellule pariétale dans la lumière de l'estomac par l'intermédiaire de la membrane apicale, afin d'assurer le substrat continu à la HKA [2]. Ce efflux K + ion se produit à travers un ou plusieurs types de apical, K + - canaux sélectifs. Plusieurs redresseur entrant (kir) canaux sont impliqués dans ce processus basé sur l'expression des cellules pariétales et la preuve pharmacologique [3], [4], mais jusqu'à présent, il existe des preuves génétiques pour un seul canal remplir ce rôle: KCNE2-KCNQ1 [5] - [7]. KCNQ1 est un domaine transmembranaire de six sous-unité α de la superfamille S4, qui forme fonctionnelle, voltage-dépendants, homotétramérique K + - canaux sélectifs dans des études d'expression hétérologues [8], [9]. KCNQ1 peut également former des complexes hétéromères de canaux avec des sous-unités auxiliaires appartenant à la famille des gènes KCNE, et l'ensemble des cinq produits connus du gène KCNE a été démontré que pour réguler la fonction KCNQ1 dans les études d'expression hétérologue [10]. Un, KCNE2, convertit KCNQ1 à un canal constitutivement active tension indépendante dont le courant est augmenté par un faible pH. KCNE2 et KCNQ1 sont tous deux exprimés au niveau ou à proximité de la membrane cellulaire apicale pariétal, et la suppression du gène d'un des deux sous-unités de l'achlorhydrie cible due à une altération de la sécrétion d'acide gastrique [5] - [7]. Ainsi les canaux KCNE2-KCNQ1 sont considérés comme essentiels pour la sécrétion d'acide gastrique et de la pensée de fournir luminal K + ions comme substrat pour le HKA gastrique}

KCNQ1
<sup>-. /- souris et KCNE2
- /- souris montrent phénotypes gastriques similaires, caractérisés par achlorhydria, hypergastrinémie et hyperplasie glandulaire gastrique [5] - [7]. Les cellules pariétales de soit show null ~10 fois la capacité réduite pour récupérer du proton de chargement, ce qui suggère un défaut primaire de la sécrétion d'acide gastrique. KCNQ1
- /- souris développent également métaplasie, la dysplasie et l'hyperplasie adénomateuse pré-maligne de l'estomac indépendante de l'infection [11]. Ceci suggère que le dysfonctionnement KCNQ1 pourrait conduire à une néoplasie gastrique indépendants de H. pylori
en raison de achlorhydria sévère, ou représentent un facteur de risque supplémentaire qui, en conjonction avec H. pylori
pourrait prédisposer au cancer gastrique</sup>

L'hyperplasie achlorhydrie gastrique et que nous avons déjà observé dans KCNE2
<sup>-. /- souris a été frappante étant donné que la sous-unité de formation de pores de la complexe, KCNQ1, était encore présent, et en fait, il a été fortement exprimé dans le double du nombre de cellules par la glande gastrique dans KCNE2
- /- souris par rapport à KCNE2
souris + /+ [7]. Dans une étude récente, l'expression de KCNE2 a été trouvé être exprimé à des niveaux relativement faibles dans les tumeurs gastriques humaines et dans des lignées cellulaires de cancer gastrique; En outre, forcé surexpression de KCNE2 a supprimé la croissance des cellules cancéreuses gastriques humaines dans une culture tissulaire et chez la souris nude [12]. Ces résultats ont soulevé la possibilité intrigante que KCNE2 pourrait être impliqué dans la carcinogenèse gastrique, et potentiellement indépendamment soit H. pylori
infection ou achlorhydrie. Ici, pour définir davantage le rôle potentiel du KCNE2 dans la régulation de la croissance cellulaire gastrique normale, nous avons examiné la pathologie gastrique KCNE2
- /- souris jusqu'à 15 mois</sup>

Résultats

KCNE2 ^{- /-
souris présentent une hyperplasie gastrique progressive}

Nous avons déjà démontré que KCNE2 est nécessaire pour la régulation normale de la croissance cellulaire de la muqueuse gastrique: 3- month-old KCNE2
<sup>- /- souris ont une hyperplasie gastrique, achlorhydrie et la morphologie des cellules pariétales anormale [7]. Ici, nous avons comparé la masse de l'estomac de 3 semaines, 3-mois- et 12-15-month-old KCNE2
- /- souris. La masse des estomacs à 3 semaines d'âge étaient similaires pour KCNE2 + /+
et KCNE2
- /- souris, alors que de 3 mois il y avait une hyperplasie gastrique significative dans KCNE2
- souris - /. Cette différence a augmenté de 12-15 mois dans la mesure où KCNE2
- /- souris ont des estomacs de 6 fois plus grand que ceux de KCNE2 + /+
souris du même âge (figure 1 A)</sup>

KCNE2 ^{-. /-
souris présentent une gastrite kystique profunda}

même à 3 semaines d'âge, en dépit de l'estomac similaire masse à celle de KCNE2 <sup>+ /+
souris, la muqueuse gastrique de KCNE2
- /- souris ont déjà montré vacuolisations proches du côté basolatéral (Figure 1 B; grossie en D). Pour étudier la progression de l'hyperplasie gastrique et ses conséquences, un total de onze 12-15 mois, KCNE2
- /- souris et cinq KCNE2 + /+
les souris ont été examinés histologiquement. La muqueuse gastrique dans tous les KCNE2
- /- souris ont montré une hypertrophie glandulaire et une hyperplasie diffuse avec l'augmentation du nombre de cellules muqueuses et les cellules pariétales qui ont été occasionnellement vacuolisées (figure 1 C). Il est frappant, gastrite cystica profunda (GCP) a été observée chez 11/11 KCNE2
- /- souris, mais 0/5 du KCNE2
souris + /+ ( χ 2 p
= 0,002) (grossissement de kyste dans la figure 1 E). glandes dilatées contenaient des débris cellulaires et, dans certains, mais pas tous les KCNE2
- /- souris, neutrophiles. Il y avait aussi hyalinosis épithéliale gastrique avec des cristaux intraluminaux occasionnels, et les agrégats lymphoplasmocytaires dans la muqueuse, la sous-muqueuse et musculeuse. Dans certains 12-15-month-old KCNE2
- estomacs de souris, de premier plan lamina fibrose proprial a été noté, en particulier dans les couches superficielles - /. GCP, également précédemment appelé pseudotumor gastrique bénigne, généralement présente comme un spectre de changements hyperplasiques et métaplasiques suivants lésions de la muqueuse gastrique. Bien que GCP démontre des caractéristiques histologiques associés à la malignité, il est en elle-même généralement considéré comme fonctionnellement bénigne - bien qu'il ait été suggéré comme un facteur de risque possible de cancer gastrique [13], [14]</sup>

marqueurs prolifératives accrus dans l'estomac. muqueuse de KCNE2 ^{- /-
souris}

Il est important, l'expression de marqueurs prénéoplasiques établis a augmenté dans KCNE2
<sup>- /- souris par rapport à em <> KCNE2
+ /+. l'antigène Ki67 est une protéine nucléaire liée au cycle cellulaire couramment utilisé comme marqueur de prolifération dans la prolifération et les tissus néoplasiques, y compris l'estomac [15]. Ki67 coloration dans les sections de KCNE2
+ /+ estomacs de souris (3 mois) ont indiqué un petit groupe de cellules positives Ki67 dans les régions isthmiques des glandes gastriques, alors que ce compartiment prolifératif a été considérablement élargie en fonction de l'âge appariés KCNE2
- /- souris (Figure 2 A-C). Epithelium alignant les zones kystiques du GCP en 12-month-old KCNE2
- /-. Souris ont également montré une coloration marquée des noyaux avec Ki67, indicatif d'un taux de prolifération élevé (figure 2 B)</sup>

cytokératine (CK) -7 est un polypeptide de 54 kDa exprimée dans une grande variété de tissus épithéliaux y compris le poumon, du sein, de l'estomac et du foetus humain; cependant, il n'a pas été exprimé dans l'épithélium gastro-intestinal adulte normal [16]. La régulation positive de la CK-7, indicatif de dédifférenciation, était évidente dans KCNE2
<sup>- /- muqueuse gastrique à 12 mois; âge appariés KCNE2
+ /+ souris, les cellules épithéliales de la muqueuse gastrique positifs étaient beaucoup plus rares (figure 2 D). CK-7 a également été importante autour des kystes (Figure 2 E)</sup>

métaplasie TFF2 exprimant dans la muqueuse gastrique de KCNE2 ^{-. /-
Souris}

Trefoil- famille des facteurs (TFF) 2 exprimant la métaplasie est associée à la progression d'un cancer gastrique chez l'homme et dans gerbilles de Mongolie infectés par H. pylori
[17]. muqueuse gastrique de KCNE2
^{- /- souris zones de métaplasie avec expression TFF2 importante, y compris dans les cellules épithéliales qui tapissent les kystes exposés (Figure 3 A-C). TFF2 exprimant métaplasie est généralement associée à une atrophie oxyntique, caractérisée par une perte de cellules pariétales [1]. Ici, nous avons analysé la muqueuse gastrique chez des souris de 12 mois avec métaplasie TFF2 exprimant pour l'expression de la sous-unité β HKA (HKA β), un marqueur de cellule pariétale. Il est frappant, il n'y avait aucune preuve d'atrophie oxyntique en termes de nombre de cellules pariétales (Figure 4 A). En outre, β HKA a été exprimée dans les cellules qui tapissent les kystes (figure 4 B)}

muqueuse gastrique accrue cycline D1 expression et néoplasie gastrique KCNE2 ^{-. /-
Souris}

KCNE2 expression réduite a déjà été suggéré d'améliorer la prolifération dans l'estomac SGC7901 lignée de cellules cancéreuses par l'intermédiaire d'une expression accrue de cycline D1 [12]. Ici, western blots ont suggéré que gène de suppression de KCNE2 augmentation totale expression de la cycline D1 dans la muqueuse gastrique de 12-month-old souris (Figure 5 A). Cycline D1 a montré une expression faible et principalement cytoplasmique à la base de KCNE2
<sup>+ /+ oxyntique glandes (Figure 5 B, C, panneaux de gauche), comme décrit précédemment pour les cellules normales, qui prolifèrent dans l'estomac de la souris [ ,,,0],18]. En revanche, dans KCNE2
- /- souris, la cycline D1 ont montré une coloration plus répandue et nucléaire dans la région de l'isthme du cou des glandes gastriques, et de la fosse glandulaire (Figure 5 B, C, panneaux de droite). Dans deux des onze 1 ans KCNE2
- /- souris analysées, les adénomes polypoïdes pyloriques ont été observés, se prolongeant dans le duodénum (Figure 5 D). Le même deux KCNE2
- /- souris ont également montré une croissance néoplasique sous la forme de thrombus composée de fibrine et épithélium glandulaire, dans des récipients à parois minces (identifié en utilisant le marqueur endothelial CD34) dans la sous-muqueuse gastrique ( Figure 5 E-H).</sup>

cellules pariétales réduit KCNE2 expression dans le tissu de cancer de l'estomac humain

Étant donné que dans une étude précédente expression KCNE2 réduite a été trouvé pour améliorer gastrique prolifération de lignées de cellules cancéreuses, et KCNE2 l'expression a été trouvée être réduite dans le cancer gastrique humain [12], nous avons examiné l'expression de KCNE2 dans la muqueuse gastrique humaine normale et de tissus du cancer gastrique. Les études d'immunofluorescence ont révélé des différences frappantes en ce qui concerne KCNE2 et KCNQ1 co-localisation, entre muqueuse gastrique humaine normale et maligne. Comme on s'y attendait, KCNQ1 et KCNE2 co-localisés fortement dans les cellules pariétales de la muqueuse gastrique humaine normale (Figure 6 A), tout comme KCNQ1 et β HKA (figure 6 B). En revanche, dans les carcinomes gastriques humaines, KCNQ1 et d'expression KCNE2 rarement chevauchaient (Figure 6 C, D), même si KCNQ1 a conservé sa forte co-localisation avec β HKA (Figure 6 E). Ainsi, l'expression KCNE2 dans les cellules pariétales a été rarement observée dans le cancer gastrique. Le manque de KCNE2-KCNQ1 co-localisation a été encore plus profond dans l'adénocarcinome gastrique humaine (Figure 6 F), qui encore une fois retenu la co-localisation de KCNQ1 et HKA β (figure 6 G).

Discussion

les canaux potassiques dans des troubles prolifératifs

les canaux potassiques sont apparus comme une cible potentielle pour les thérapies anti-cancer [19], y compris KCNQ1, hERG et Kv2.1, qui sont des partenaires de la sous-unité alpha de KCNE2. imprinting Perturbation causée par des mutations dans la cause du gène KCNQ1 syndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS), qui prédispose au cancer [20] - [22], et KCNQ1 knockout prédispose à métaplasie gastrique [11]. Le canal potassique hERG α sous-unité, ce qui forme des complexes avec la sous-unité auxiliaire KCNE2 dans le cœur humain [23], est surexprimée dans certaines tumeurs, et a été identifiée comme un facteur de survie des tumeurs [24] - [27] a Kv2. 1 [28].

KCNE2 a déjà été trouvé à exprimer 2 fois plus faible dans les tissus du cancer gastrique humain que dans les cellules gastriques normales voisines, et forcé surexpression de KCNE2 avaient des effets anti-prolifératifs sur les cellules de cancer gastrique in vitro
et injecté dans des souris nude [12]. Le mécanisme postulé pour cet effet anti-prolifératif est la régulation de la cycline D1, ce qui retarde la progression à travers le cycle cellulaire [12] similaire à ce qui a été observé avec le bloqueur cisapride hERG [29]. Une expression élevée de la cycline D1 dans les tumeurs gastriques humaines est en corrélation avec un pronostic particulièrement défavorable [30], donc des facteurs qui augmentent l'expression de la cycline D1 peut conduire à des avenues thérapeutiques pour cette et d'autres formes de cancer comprendre. La surexpression de la cycline D1 a été suggéré de contribuer à l'oncogenèse en perturbant le cycle cellulaire, et a été rapportée comme étant un facteur oncogène important dans l'oesophage du carcinome [31], et associée à l'accumulation nucléaire de la β-caténine dans les adénocarcinomes endométrioïde de l'ovaire [32]; nucléaire cycline D1 surexpression dans les carcinomes de la vésicule biliaire est un événement critique [33].

Ici, nous décrivons d'importants changements métaplasiques dans le muscosa gastrique due à la perturbation génétique de KCNE2
. Ceci est associé à une augmentation nucléaire cycline D1 expression dans la muqueuse gastrique, qui rappelle les résultats du précédent in vitro
études de KCNE2 [12]. Ni le rapport actuel, ni l'étude précédente, cependant, délimiter le mécanisme de la cycline D1 dans la régulation positive KCNE2
^{- /- muqueuse - est-il une conséquence des changements métaplasiques secondaire à Achlorhydrie chez ces souris, ou est il une association plus directe entre KCNE2
et cycline D1? L'étude menée par Yanglin et ses collègues plaide pour ce dernier au moins en partie, parce que dans leur étude, les changements cycline D1 se sont produites dans des cellules isolées sans l'influence de achlorhydrie [12]. Nous considérons que les changements secondaires à achlorhydria sont le facteur le plus susceptible dominante, mais un lien direct ne peut être exclue. Fait intéressant, hERG, un autre partenaire de KCNE2, est exprimé dans les cellules de cancer gastrique mais pas épithéliums gastrique normale et le hERG bloqueur des canaux cisapride a déjà été trouvé pour supprimer la croissance des cellules du cancer gastrique en inhibant l'entrée en phase S de G (1) phase dans le cycle cellulaire, ce qui augmente l'apoptose [29]. Parce que KCNE2 supprime partiellement les courants hERG en réduisant la conductance unitaire et accélérer la désactivation [23], il est une possibilité intrigante que les effets anti-prolifératifs observés de KCNE2 surexpression in vitro
[12] sont dues à la suppression de courant hERG promotion l'apoptose, et inversement que KCNE2 la régulation ou la perturbation génétique peut favoriser la prolifération cellulaire gastrique en augmentant la densité de courant hERG}

GCP et TFF2 exprimant métaplasie (SPEM) dans KCNE2 ^{-. /-}

GCP de souris peut présenter des êtres humains avec des douleurs intermittentes épigastriques, des ballonnements, une obstruction gastrique ou saignement gastro-intestinal supérieur, et est le plus souvent observé chez les patients avec une histoire de l'une gastrectomie ou gastrostomie [34]. Cependant, quelques cas ont été rapportés avec aucune association à la chirurgie avant gastrique [35], [36]. La pathogenèse de la GCP humaine est censée résulter d'une lésion des muqueuses musculeuse, qui peut conduire à piégeant ectopique de glandes gastriques dans la sous-muqueuse, muscularis mucosae ou séreuse, ou d'une inflammation chronique. GCP est généralement considéré comme une entité clinique bénigne, bien que l'association avec le cancer gastrique a été rapporté [14], [37], [38].

Chez les animaux de laboratoire, GCP secondaire à Helicobacter sp
. l'infection a été décrit comme un prédécesseur de la dysplasie et la néoplasie [39] intramuqueux, et associée au développement du cancer de l'estomac. GCP a été fréquemment trouvée dans H. pylori
gerbilles de Mongolie qui a également développé infectés par l'adénocarcinome gastrique et hyperplasie lymphoïde [40]. Dans un modèle génétique murine précédent de GCP, TGF beta 1 souris <sup>+/- développé des lésions hyperplasiques glandulaires qui partagent des caractéristiques morphologiques avec GCP humaine, avec une infiltration inflammatoire mixte de la muqueuse environnante et la vascularite chronique dans les tissus adjacents à ces lésions [ ,,,0],41]. Ici, dans KCNE2
- /- souris, GCP se produit en l'absence d'une lésion inflammatoire primaire, et indépendante de l'oblitération vasculaire. Au lieu de cela, nous proposons que le principal défaut est la perte de la sous-unité β KCNE2 de complexes de canaux avec KCNQ1, compromettant ainsi un K voie de recyclage importante apical + dans les cellules pariétales et de prévenir l'acidification gastrique par la cellule pariétale HKA. Bien que cela représente une «atrophie fonctionnelle» dans la population des cellules pariétales, dans des études antérieures de la métaplasie intestinale une perte réelle de cellules pariétales, appelée 'atrophie oxyntique', a été considérée comme un processus important dans l'étiologie de la métaplasie intestinale, associée à la maladie de reflux acide ou H. pylori de l'infection, et le processus métaplasique le plus fréquemment observé dans le tractus gastro-intestinal supérieur [42].</sup>

atrophie oxyntique en l'absence d'inflammation importante peut être induite par DMP-777, un inhibiteur de l'élastase neutrophile qui vise également les cellules pariétales en raison de son action en tant que protonophore [43]. une atrophie gastrique pariétale chez les souris déficientes, après un traitement avec DMP-777, conduit rapidement à TFF2 exprimant métaplasie, aussi appelé peptide spasmolytique exprimant une métaplasie (SPEM) [44]. SPEM est remarquable en raison de sa forte association avec l'adénocarcinome gastrique humaine, et il est observé dans la majorité des biopsies des glandes fundiques de l'homme H. pylori des patients infectés par le gastrite [45]. L'apparition de SPEM dans KCNE2
<sup>- /- souris en l'absence soit H. pylori
ou l'atrophie oxyntique classique suggère que la «atrophie fonctionnelle» causée par KCNE2 de la suppression peut être suffisant pour déclencher SPEM. Une différence majeure entre KCNE2
souris - /- et ceux de l'étude Nozaki est que KCNE2
- /- souris sont hypergastrinemic, pas gastrine déficient. Une autre différence est que DMP-777 perturbe un tubulovesicle gastrique gradient de protons sans altérer H + K + - fonction ATPase, alors ciblées KCNE2 de la perturbation empêche H + /K + ATPase fonction en retirant son substrat luminal, K + ions [7], [44]. Peut-être ce dernier mécanisme pourrait à l'avenir des indices sur les événements critiques dans l'atrophie oxyntique qui aboutissent à SPEM révéler: il est actuellement suggéré que spem induction résulte d'une carence en pariétales régulateurs sécrétées par les cellules de renouvellement normal de la muqueuse gastrique, qui comprennent le hérisson sonique et Le TGF-α [46], [47] en raison de la perte de cellules pariétales. D'autres études de KCNE2
- /- cellules pariétales - qui sont encore présents, mais un dysfonctionnement - peut révéler les régulateurs dont ils peuvent encore sécréter, et ceux qu'ils ne peuvent pas</sup>

La muqueuse gastrique. de KCNE2
<sup>- /- souris présentent aussi une expression accrue du marqueur de prolifération établi Ki67, se manifestant par une augmentation de la largeur de la bande de prolifération de la muqueuse, et en tant que cellules Ki67-positives qui tapissent les kystes dans les régions du GCP. De même, le marqueur CK7 de-différenciation, pas exprimée dans 1 ans KCNE2
+ /+ muqueuse gastrique, a été largement exprimé dans celui de KCNE2
- /- souris. Compte tenu de ces et les marqueurs décrits ci-dessus ensemble, le KCNE2
- /- gastrique des expositions de la muqueuse métaplasie avec de multiples caractéristiques de prénéoplasie, et dans certains cas de néoplasie, notamment dans un environnement exempt d'organismes pathogènes spécifiques sans preuve de l'estomac Helicobacter
infection ou une atrophie oxyntique, et en l'absence d'inhibiteurs chimiques de l'acidification gastrique. Conjointement avec la découverte ici que la cellule pariétale KCNE2 expression semble être réduite dans les tissus du cancer gastrique humain (figure 4) et le rapport précédent que KCNE2 inhibe gastrique prolifération des cellules cancéreuses [12], les données suggèrent une perturbation KCNE2 est associée à la progression du cancer gastrique. Les études futures comprendront examiner si KCNE2 de la perturbation augmente la prédisposition au cancer gastrique dans les protocoles d'agents pathogènes et à base de substances cancérogènes, les mécanismes à l'origine de ces différences possibles et les liens potentiels entre mécanistes KCNE2
, cycline D1 et la perturbation du cycle cellulaire en dehors du domaine de la maladie étiologie achlorhydria associée. En outre, comme KCNQ1 et KCNE2 sont également co-exprimés dans les cellules épithéliales thyroïdiennes, où ils sont importants pour l'hormone thyroïdienne biosynthèse [48], il sera intéressant d'examiner le rôle potentiel de KCNE2 dans la prolifération thyrocyte anormale.</sup>

Matériel et méthodes

Production et utilisation de souris
gènes ciblés

Toutes les souris décrites dans cette étude ont été logés, utilisés et euthanasiés selon les directives du NIH et de l'Université Cornell Institutional animal Care et l'utilisation du Comité. Toutes les souris décrites dans cette étude ont été logés, utilisés et euthanasiés selon les directives du NIH et Weill Medical College Institutional Animal Care et l'utilisation du Comité. L'approbation éthique pour se reproduire et de tissus de la récolte de type sauvage et KCNE2
<sup>- /- souris pour la recherche biomédicale a été approuvée par Weill Medical College Institutional Animal Care et utilisation Comité (protocole 0704-610A). KCNE2
- /- souris ont été générées comme décrit précédemment de C57BL /6 KCNE2 + /
- x KCNE2 +/-
croix [7]. Les données numériques ont été analysées avec le logiciel EXCEL (Microsoft) à l'aide d'une analyse de variance (Anova) avec une signification statistique fixé à P
<. 0.05</sup>

histologie

Pour histologie et de la masse de l'estomac quantification, KCNE2 <sup>+ /+
et KCNE2
- /- souris à 3 semaines, 3 mois et 12-15 mois ont été sacrifiés en utilisant CO _{2 asphyxie (5-10 par génotype). Estomacs ont été enlevés post-mortem, de l'estomac déterminé la masse, puis les tissus de l'estomac a été fixé à 10% du formol tamponné neutre, traitées par des méthodes de routine et incorporé dans la cire de paraffine. sections de la muqueuse gastrique ont été coupées à 5 um intervalles, placées sur des lames Superfrost chargées positivement, colorées à l'hématoxyline et l'éosine (H & E)., et évalués avec un microscope Olympus BX45}</sup>

immunohistochimie

la détection immunohistochimique de Ki67, CK-7 et TFF2 (également connu sous le nom de peptide spasmolytique) a été réalisée en utilisant un processeur Discovery XT (Ventana Medical Systems). Les concentrations d'anticorps primaires utilisés étaient les suivants: 0,05 pg /ml (polyclonal de lapin anti-Ki67, Vector Labs); 1 pg /ml (anticorps monoclonal de souris anti-CK-7; Abcam); 1 pg /ml (anticorps monoclonal de souris anti-TFF2; Abcam). Précédant l'incubation de l'anticorps primaire, les coupes de tissu ont été bloqués pendant 30 minutes dans 10% de sérum de chèvre normal à 2% de BSA dans du PBS (anti-Ki67); 30 minutes dans 10% de sérum de chèvre normal à 2% de BSA dans du PBS et avidine /biotine pendant 8 min (anti-CK-7); 30 minutes dans 10% de sérum de chèvre normal à 2% de BSA dans du PBS et avidine /biotine pendant 4 minutes (anti-TFF2). temps d'incubation anticorps primaires étaient: 3 h (Ki67 et CK-7); 5 heures (anti-TFF2). Les incubations d'anticorps secondaires étaient les suivantes: 32 min 1:200 chèvre biotinylé anti-lapin IgG (Vector Labs) pour Ki67; 60 min à cheval 1:200 anticorps biotinylé anti-IgG de souris (Vector Labs) pour CK-7 et TFF2. Pour Ki67 anticorps secondaire incubation, Blocker D, Streptavidin-HRP et le kit de détection de DAB (Ventana Medical Systems) ont été utilisés selon les instructions du fabricant. Pour CK-7 et TFF2, IgG1 de souris (5 ug /ml) a été utilisé comme un contrôle isotypique négatif et Blocker D, Streptavidin-HRP et le kit de détection de DAB (Ventana Medical Systems) ont été utilisés.

Pour cycline détection D1, les lames d'estomac ont été chauffés à 58-60 ° C pendant 30 min puis déparaffinées. une activité de peroxydase endogène a été bloquée par les sections d'incubation à 1% de peroxyde d'hydrogène dans du PBS pendant 15 min (8,3 ml de 30% de H _{2 O 2 /241,7 ml de PBS), suivi par le démasquage de l'épitope antigénique par micro-ondes en mM Citrate 10 tampon à puissance élevée pendant 15 min. Les lames ont été refroidie pendant 20 min, on l'a lavé à l'eau distillée pendant 5 minutes, transférées dans du PBS et incubées dans 10% de sérum normal de cheval (2% BSA-PBS diluant) pendant 30 minutes dans une chambre humide. D1-souris d'anticorps anti-cycline monoclonal (Cell Signaling) a été ajouté à 1:1000 avec 2% de BSA dans du PBS et mis à incuber pendant une nuit à 4 ° C dans une chambre humide. Les lames ont été rincées dans du PBS et le cheval biotinylée anticorps IgG anti-souris secondaire (Vector Labs) a été appliqué à 1:500 dans du PBS pendant 30 min à température ambiante. Les lames ont été lavées et un complexe (Kit Vectastain ABC Elite, Vector Labs) avidine-biotine dilué à 1:25 dans du PBS a été appliquée pendant 30 minutes. Le signal a été détecté par incubation dans du 3,3-diaminobenzidine (Sigma, lot n ° 026K3767) jusqu'à ce que l'intensité de couleur désirée soit atteinte. Après des lavages finaux dans l'eau, les lames ont été légèrement contrecolorées en hématoxyline. KCNQ1 et HKA β marquage unique et la détection ont été réalisées comme décrit précédemment [7]. détection de CD34 était avec 1:50 d'anticorps anti-CD34 (ABcam). Les lames ont été visualisées avec un microscope Nikon Eclipse E600 et photographiées en utilisant un appareil photo RT couleur et le logiciel SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.).}

immunofluorescence

Tous les tissus humains a été obtenu à partir de Prosci, Poway, CA, et a été certifié comme ayant été obtenu à partir des services de pathologie qualifiés et autorisés, en utilisant appropriée conforme consentement pour une utilisation dans la recherche biomédicale et à la protection de l'anonymat des donateurs; par conséquent, plus l'approbation éthique Conseil d'examen Weill Medical College institutionnel n'a pas été nécessaire. la détection par immunofluorescence de β HKA, KCNQ1 et KCNE2 dans le tissu gastrique humaine (Prosci) a été réalisée à l'aide d'un processeur Discovery XT (Ventana Medical Systems). Les tissus humains suivants ont été utilisés: les tissus de l'estomac normale d'une femme de 50 ans (PSC-10-809-XB1); tissu de carcinome gastrique, l'information du patient indisponible (PSC-10-814-CA1); tissu adénocarcinome gastrique d'une femme de 51 ans (PSC-10-809-XA1). Les concentrations d'anticorps primaires utilisés étaient: 0,5 mg /ml anti-HKA β (monoclonaux de souris, d'affinité Bioreagents), 1 mg /ml anti-KCNQ1 (lapin ou de chèvre polyclonaux, Chemicon), et de sérum en interne anti-KCNE2 a été utilisé à une dilution 1:500 après IgG de colonne enrichissant. Précédant l'incubation des anticorps primaires, les coupes de tissu ont été bloqués pendant 30 minutes dans 10% de sérum de chèvre normal à 2% de BSA dans du PBS, suivi par 8 min bloc avidine /biotine. L'incubation de l'anticorps primaire (3 h) a été suivie par 32 minutes d'incubation avec (kit ABC des laboratoires de vecteur) biotinylé anti-IgG de souris, 60 min d'incubation avec biotinylé anti-IgG de chèvre (kit ABC des laboratoires de vecteur), ou anti-lapin biotinylé anticorps à 1:200 dilution (kit Vectastain ABC). La détection secondaire a été effectuée avec de la streptavidine-HRP D (Ventana Medical Systems), suivie d'une incubation avec tyramide-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ou tyramide Alexa Fluor 568 (Invitrogen). diapositives colorées ont été vus avec un Zeiss Axiovert 200 Widefield microscope et images ont été acquises à l'aide du logiciel MetaMorph 7.1 (Molecular Devices).

Western blot

Pour western blot, des fractions membranaires gastriques ont été préparés comme décrit précédemment [7]. Trois estomacs de 12-month-old KCNE2 <sup>+ /+
et KCNE2
- /- souris ont été enlevés post-mortem, coupe ouverte le long de la curvatura ventriculi majeur, débarrassé des ingesta et immédiatement snap-congelé dans l'azote liquide. Les estomacs ont ensuite été homogénéisés dans un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl, NaCl 150 mM, 100 pg /ml de PMSF, 1 ug /ml de Nonidet P40, 0,5% de SDS et de l'orthovanadate de sodium 0,5%, puis on incube sur de la glace pendant 30 minutes et on centrifuge à 12000 × g
pendant 20 min à 4 ° C. La concentration en protéines du surnageant a été mesurée selon la méthode de Bradford. La protéine totale (40 pg /piste) a été chargé dans un pré-casting tris-glycine gel 4-20% (Jule Inc, Milford, CT) et séparé par électrophorèse. Les protéines ont été ensuite transférées sur une membrane PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA), et bloquées avec 5% de lait, 0,05% de Tween-20 dans du PBS pendant 12 heures à 4 ° C sur une bascule. Les incubations d'anticorps primaire (4 hr, RT à 1% de lait, 0,05% de Tween 20, PBS, "tampon A") étaient les suivants: 1:2000 anti-cycline D1 (Abcam); 1:5000 anti- GAPDH (Abcam). Les membranes ont été lavées 4 fois, 20 minutes à chaque fois avec le tampon d'incubation d'anticorps, puis mis en incubation avec les anticorps secondaires appropriés (BioRad) dilué 1:10000 dans le tampon A pendant 2 heures à température ambiante puis lavé 4 fois 20 minutes à chaque fois avec le tampon A et une fois pendant 5 min avec du PBS.</sup>

• PLOS Pathogens: Caveolin-1 protège les souris B6129 contre Helicobacter pylori Gastrite
• PLOS ONE: Epstein Barr Virus et Helicobacter pylori co-infections sont positivement associées avec sévère Gastrite pédiatrique Patients