PLoS ONE: Kohdennettu poistaminen Kcne2 Syyt gastriitti cystica Profunda ja Mahalaukun Neoplasia

tiivistelmä

Mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti. Altistavia tekijöitä ovat aklorhydrian, Helicobacter pylori
infektio, oxyntic surkastumista ja TFF2 ilmentäviä metaplasiaa. Vuonna parietaalisoluissa, apikaalisella kaliumkanavia käsittää KCNQ1 α-alayksikköä ja KCNE2 β-alayksikön tarjota K <sup>+ efflux virran helpottamiseksi mahahaponerityksestä apikaalisella H + K + ATP. Siten geneettinen poisto hiiren KCNQ1
tai Kcne2
heikentää mahahapon eritystä. Muita todisteita on ehdottanut rooli KCNE2 ihmisen mahasyövän solujen lisääntymistä, riippumatta sen rooli mahan happamuuden. Tässä osoitamme, että 1-vuotias Kcne2
- /- hiiret patogeenittomassa ympäristö kaikille näytteille vakavia mahalaukun preneoplastista fenotyyppiä käsittää gastriitti cystica profunda, 6-kertainen mahassa massa, lisääntynyt Ki67 ja ydinvoiman sykliini D1 ilmentyminen, ja TFF2- ja sytokeratiini 7-ilmentävien metaplasiaa. Jotkut Kcne2
- /- hiirillä oli myös mahanportin polypoid adenoomia ulottuu pohjukaissuoleen, ja neoplastisia hyökkäys ohutseinäiset alusten Saharan limakalvon. Lopuksi analyysi ihmisen mahasyövän kudos osoitti alentunut parietaalisolun KCNE2 ilme. Yhdessä aikaisempien havaintojen tulokset viittaavat KCNE2 häiriöitä mahdollisena riskitekijä maha- neoplasia.</sup>

Citation: Roepke TK, Purtell K, kuningas EY, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) Kohdennettu poisto on Kcne2
Syyt gastriitti cystica Profunda ja Mahalaukun neoplasia. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10,1371 /journal.pone.0011451

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 03 toukokuu 2010; Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2010; Julkaistu: 06 heinäkuu 2010

Copyright: © 2010 Roepke et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: G.W.A. tukee National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health (R01 HL079275), American Heart Association (Grant-In-Aid 0855756D) ja Irma T. Hirschl Ura tutkijan palkinnon. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on edelleen yksi tärkeimmistä syistä kuolleisuuden, ja toiseksi suurin syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Mahasyövän on prosessi, joka etenee useiden vaiheiden mukaan lukien oxyntic surkastuminen, haavaumia mahalaukussa, foveolar liikakasvu, hypo- ja aklorhydrian ja limakalvojen risolumuuntumisessa [1]. Edistysaskelista huolimatta hoidossa mahasyövän suhteellisen vähän tiedetään molekyylitason mekanismeja mahasyövän, tavanomaisista mahalaukun limakalvon läpi preneoplastinen mahavaurioita tai mahdollinen rooli ionikanavia näissä prosesseissa.

Päälaen solut saavuttaa mahalaukun happamuuden nojalla apikaalinen H ^{+ K + ATP (HKA) joka pumppaa protoneja mahalaukkuun onteloon vastineeksi K + ioneja. Säilyttää tämä toiminta, K + ionit täytyy matkustaa perietaalisolun vatsaan onteloon kautta apikaalisella kalvo, jatkumisen varmistamiseksi substraatti HKA [2]. Tämä K + ioni ulosvirtaus tapahtuu yhden tai useamman tyyppisten apikaalisella, K + - valikoiva kanavat. Useat sisäänpäin tasasuuntaaja (Kir) kanavat ovat sekaantuneet tähän prosessiin perustuva perietaalisolun ilmaisun ja farmakologinen todisteet [3], [4], mutta tähän mennessä ei ole geneettistä näyttöä vain yksi kanava tässä roolissaan: KCNE2-KCNQ1 [5] - [7]. KCNQ1 on kuusi transmembraanidomeeni α-alayksikköä päässä S4 superperheen, joka muodostaa toimiva, jänniteherkkiin, homotetrameeriset K + - valikoiva kanavien heterologisen ilmaisun tutkimuksissa [8], [9]. KCNQ1 voivat myös muodostaa heteromeeristen kanavan komplekseja avustavia alayksiköiden päässä KCNE geeniperheen, ja kaikki viisi tunnetaan KCNE geenituotteiden on osoitettu säätelevän KCNQ1 toiminnon heterologisen ilmentymisen tutkimukset [10]. Yksi, KCNE2, muuntaa KCNQ1 jännitteeseen riippumaton, konstitutiivisesti aktiivinen kanava, jonka virta on kasvanut alhainen pH. KCNE2 ja KCNQ1 ovat molemmat ilmaistaan ​​tai sitä lähellä perietaalisolun apikaalisella kalvo, ja kohdegeenin poistetaan joko alayksikön tuloksia aklorhydrian vuoksi heikentynyt mahahapon eritystä [5] - [7]. Näin KCNE2-KCNQ1 kanavat pidetään olennaisina mahahapon eritystä ja ajattelin tarjota luminaaliselle K + ioneja substraattina mahalaukun HKA.}

KCNQ1
<sup>- /- hiiret ja Kcne2
- /- hiirillä osoittavat samanlaisia ​​mahalaukun fenotyyppejä, jolle on ominaista aklorhydrian, hypergastri- ja mahalaukun rauhas liikakasvu [5] - [7]. Parietaalisoluihin joko null osoittavat ~ 10-kertaisesti alentunut kyky palautua protoni lastaus, mikä viittaa ensisijainen vika mahahapon eritystä. KCNQ1
- /- hiirillä myös kehittää metaplasiasta dysplasia ja premaligneja adenomatoottisen hyperplasiaa mahan riippumatta infektion [11]. Tämä viittaa siihen, että KCNQ1 toimintahäiriö voi johtaa mahalaukun kasvain riippumaton H. pylori
aiheuttamien vakavien aklorhydria tai muodostavat vaaran tekijä, joka yhdessä H. pylori
voisi altistaa mahasyövässä.</sup>

aklorhydrian ja mahan liikakasvun me aiemmin havaittu Kcne2
<sup>- /- hiirien silmiinpistävää, koska huokosia muodostava alayksikköä monimutkainen, KCNQ1, oli edelleen läsnä, ja itse asiassa se oli voimakkaasti ilmaistu kaksinkertainen määrä solua maharauhanen vuonna Kcne2
- /- hiirillä verrattuna Kcne2
+ /+ hiirillä [7]. Tuoreessa tutkimuksessa, KCNE2 ilmentyminen havaittiin ilmaistaan ​​suhteellisen alhaiselle tasolle ihmisen mahalaukun kasvaimet ja mahasyövän solulinjoissa; Lisäksi, pakotetaan-ilmentyminen KCNE2 tukahdutti kasvua ihmisen mahalaukun syövän solujen kudosviljelmässä ja nude-hiirissä [12]. Nämä havainnot esiin kiehtova mahdollisuus, että KCNE2 saattaa olla mukana mahasyövän, ja mahdollisesti itsenäisesti joko H. pylori
infektio tai aklorhydrian. Täällä määritellä tarkemmin mahdollista roolia KCNE2 säätelyssä normaalin mahalaukun solujen kasvua, me tutkinut mahalaukun patologian Kcne2
- /- hiirillä jopa 15 kuukauden iässä.</sup>

tulokset

Kcne2 ^{- /-
hiirillä progressiivinen mahalaukun liikakasvu}

aiemmin osoitettu, että Kcne2 tarvitaan normaaliin säätelyyn mahalaukun limakalvon solujen kasvua: 3- kuukauden ikäinen Kcne2
<sup>- /- hiirillä on mahalaukun liikakasvua, aklorhydrian ja epänormaali perietaalisolun morfologia [7]. Tässä vertasimme vatsan massa on 3 viikon, 3-kuukautta ja 12-15 kuukauden ikäinen Kcne2
- /- hiirissä. Massa mahat 3 viikon iässä olivat samanlaiset Kcne2 + /+
ja Kcne2
- /- hiirissä, kun taas 3 kuukauden aikana oli merkittävä mahalaukun liikakasvu in Kcne2
- /- hiirissä. Tämä ero oli kasvanut 12-15 kuukautta siinä määrin, että Kcne2
- /- hiirillä oli mahat 6-kertainen suurempi kuin Kcne2 + /+
hiirillä samanikäisiä (kuva 1 A).</sup>

Kcne2 ^{- /-
hiirillä gastriitti kystinen profunda}

Jo 3 viikon iässä, vaikka samanlaisia ​​vatsa massa kuin Kcne2 <sup>+ /+
hiirillä, mahalaukun limakalvo Kcne2
- /- hiiret osoittivat jo vacuolations lähellä basolateraalisessa puolelle (kuvio 1 B; suurennettu D). Tutkia etenemistä mahalaukun liikakasvun ja sen seuraukset, yksitoista 12-15 kuukausi ikäinen Kcne2
- /- hiiret ja viisi Kcne2 + /+
hiiriä histologisesti tutkittiin. Mahan limakalvon kaikissa Kcne2
- /- hiiret osoittivat rauhas liikakasvu ja hajanainen liikakasvu lisääntynyt määrä limakalvojen solujen ja parietaalisoluihin jotka ajoittain vakuoleja (kuvio 1 C). Silmiinpistävän, gastriitti cystica profunda (GCP) havaittiin 11/11 Kcne2
- /- hiirissä, mutta 0/5 on Kcne2
+ /+ hiirillä ( χ 2 p
= 0,002) (suurennos kysta kuvassa 1 E). Laajentuneet rauhaset sisälsi solun roskat ja joissakin mutta ei kaikissa Kcne2
- /- hiirissä, neutrofiilit. Myös mahalaukun epiteelin hyalinoosi satunnaiseen intraluminaaliset kiteitä, ja lymfoplasmasyyttinen aggregaatteja limakalvolla, submukoosassa ja muscularis. Joissakin 12-15 kuukauden ikäinen Kcne2
- /- hiiri mahat, näkyvä lamina proprial fibroosia Todettiin, erityisesti pintakerroksiin. GCP, myös aikaisemmin kutsuttiin hyvänlaatuisten maha- pseudotumor, yleensä esittelee kirjo hyperplastic ja metaplastiset muutokset vaurioitumisen mahan limakalvon. Vaikka GCP osoittaa histologisia piirteitä liittyy maligniteetti, se on sinänsä yleisesti pidetään toiminnallisesti hyvänlaatuinen - vaikka se on ehdotettu mahdolliseksi riskitekijä mahasyövän [13], [14].</sup>

Lisääntynyt proliferatiivinen merkkiaineiden mahalaukun limakalvo Kcne2 - /-
hiirillä

Mikä tärkeintä, ilmaus perustettu esineoplastiset merkkiaineiden nostettiin Kcne2
<sup>- /- hiirillä verrattuna Kcne2
+ /+ hiirillä. Ki67-antigeeni on solusyklin liittyvät ydinvoiman proteiinia käytetään yleisesti proliferaatiota merkki lisääntyvissä ja neoplastiset kudokset, kuten mahalaukussa [15]. Ki67 värjäys kohdissa välillä Kcne2
+ /+ hiiri vatsat (3 kk) osoitti pieni joukkio Ki67 positiivisten solujen sisällä isthmic alueilla maharauhanen, kun taas tämä proliferatiivinen osasto laajennettiin merkittävästi ikääntymiseen Hyväksytty Kcne2
- /- hiirissä (kuva 2 A-C). Epiteelin vuori kystinen alueita GCP 12 kuukauden ikäinen Kcne2
- /- hiiret osoittivat myös näkyvä värjäys ytimien kanssa Ki67, osoittaa korkeaa leviämisen nopeudella (kuva 2 B).</sup>

sytokeratiinivasta (CK) -7 on 54 kDa: n polypeptidi, joka ilmaistaan ​​monenlaisia ​​epiteelikudosten, kuten keuhko-, rinta-, ihmisen ja sikiön vatsa; kuitenkin, se ei ilmenny normaaleissa aikuisen ruoansulatuskanavan epiteeli [16]. Ylössäätely CK-7, osoittaa erilaistamattomuuden, oli ilmeistä Kcne2
<sup>- /- mahalaukun limakalvon 12 kuukauden aikana; in samanikäisiin Kcne2
+ /+ hiirillä, mahalaukun limakalvon positiiviset epiteelisolut olivat paljon harvinaisempia (kuva 2 D). CK-7 oli myös merkittävä noin kystat (kuva 2 E).</sup>

TFF2 ilmentäviä metaplasiaa mahalaukun limakalvo Kcne2 - /-
hiirillä

Trefoil- tekijä perhe (TFF) 2-ilmentävien metaplasiaa on etenemiseen liittyvä mahalaukun syöpää ja Mongolian gerbiilit tartunnan H. pylori
[17]. Mahalaukun limakalvo on Kcne2
^{- /- hiiret osoittivat alueet metaplasiaa näkyvä TFF2 ilmentymistä, mukaan lukien epiteelisolujen kystat (kuvio 3 A-C). TFF2 ilmentäviä metaplasiaan liittyy tyypillisesti oxyntic atrofia, tunnettu siitä, menetykseksi parietaalisolujen [1]. Tässä olemme analysoineet mahalaukun limakalvo 12 kuukauden ikäisiä hiiriä, joissa TFF2 ilmentävien metaplasiaa ekspressiota varten HKA β-alayksikön (HKA β), joka on parietaalisolujen markkeri. Silmiinpistävän, ei ollut näyttöä oxyntic surkastumista mitattuna määrä parietaalisoluissa (kuva 4 A). Edelleen, HKA β ilmentyi epiteelisoluihin kystat (kuva 4 B).}

Lisääntynyt mahalaukun limakalvon sykliini D1 ilmentyminen ja mahalaukun kasvainten Kcne2 - /-
hiirillä

Vähentynyt KCNE2 ilmentyminen on aiemmin ehdotettu parantaa proliferaatiota mahalaukun syövän solulinja SGC7901 kautta lisääntyneen ilmentymisen sykliini D1 [12]. Täällä, western blotit ehdotti, että Kcne2
geenideleetio- kasvoi yhteensä sykliini D1 ilmentyminen mahalaukun limakalvon 12 kuukauden ikäisiä hiiriä (kuvio 5 A). Sykliini D1 osoitti heikkoa ja pääasiassa sytoplasmista ekspressiota juuressa Kcne2
<sup>+ /+ oxyntic rauhaset (kuvio 5 B, C, vasen paneeli), kuten aiemmin on kuvattu normaalia, lisääntyvät solut hiiren mahan [ ,,,0],18]. Sen sijaan Kcne2
- /- hiirissä, sykliini D1 osoitti laajempi ja tumavärjäystä kaulan kannaksella alueella maharauhanen, ja rauhas kuoppa (kuvio 5 B, C, oikea paneeli). Kahdessa yhdentoista 1-vuotiaan Kcne2
- /- hiiret analysoitiin, mahanportin polypoid adenoomia havaittiin, ulottuu pohjukaissuoleen (kuva 5 D). Samat kaksi Kcne2
- /- hiirillä oli myös neoplastisen kasvun muodossa trombien koostuvat fibriinin ja rauhasepiteeliin, ohutseinäisissä alukset (tunnistaa käyttäen endoteelimerkkiaineelle CD34) sisällä mahalaukun submukoosasta ( Kuvio 5 E-H).</sup>

alennetulla parietaalisolujen KCNE2 ilmentymistä ihmisen mahasyövän kudoksen

Koska aikaisemmassa tutkimuksessa vähentää KCNE2 ilmentyminen havaittiin parantaa mahalaukun syövän solulinja lisääntymistä, ja KCNE2 ilmentyminen havaittiin vähennetään ihmisen mahasyövän [12], tutkimme KCNE2 ilmentyminen normaaleissa ihmisen mahan limakalvoa, ja mahasyövän kudosta. Immunofluoresenssitutkimukset paljastivat hätkähdyttäviä eroja suhteessa KCNE2 ja KCNQ1 kolokalisaation, normaalin ja pahanlaatuisen ihmisen mahalaukun limakalvon. Kuten odotettua, KCNQ1 ja KCNE2 co-lokalisoitu voimakkaasti parietaalisoluissa normaaleissa ihmisen mahan limakalvon (kuvio 6 A), samoin kuin KCNQ1 ja HKA β (kuvio 6 B). Sen sijaan ihmisen mahakarsinoomat, KCNQ1 ja KCNE2 lauseke harvoin päällekkäin (kuvio 6 C, D), vaikka KCNQ1 säilytti vahvan kolokalisaation kanssa HKA β (kuva 6 E). Niinpä KCNE2 ilmentyminen parietaalisoluissa harvoin havaittu mahakarsinoo-. Puute KCNE2-KCNQ1 co-localization oli vielä selvempi ihmisen mahalaukun adenokarsinooman (kuvio 6 F), joka puolestaan ​​säilyttää kolokalisaation KCNQ1 ja HKA β (kuvio 6 G).

Keskustelu

kaliumkanavia lisääntymishäiriöiden

kaliumkanavia ovat nousseet potentiaalisimmaksi syöpälääkkeiden [19], mukaan lukien KCNQ1, hERG ja Kv2.1, jotka kaikki ovat α-alayksikköä kumppaneita KCNE2. Häiritsi merkintä aiheuttamat mutaatiot KCNQ1 geenissä aiheuttavat Beckwith-Wiedemann oireyhtymä (BWS), joka altistaa syöpää [20] - [22], ja KCNQ1 Knockout altistaa mahan metaplasiaa [11]. HERG kaliumkanavan α-alayksikköä, joka muodostaa komplekseja KCNE2 avustavia alayksikön ihmisen sydämessä [23], on yli-ilmentynyt joissakin kasvaimissa, ja on todettu kasvain eloonjäämistekijä [24] - [27], kuten on Kv2. 1 [28].

KCNE2 aiemmin oli ilmaistaan ​​2-kertaa pienempi ihmisen mahasyövän kudosten kuin viereisissä normaali mahan soluja, ja pakotti säätelyä KCNE2 oli antiproliferatiivisia vaikutuksia mahalaukun syöpäsoluihin in vitro
ja ruiskutettiin paljaisiin hiiriin [12]. Oletetun mekanismia antiproliferatiivinen vaikutus on alas-säätely sykliini D1, viivyttäminen etenemistä solusyklin läpi [12] samanlainen kuin mitä havaittiin hERG esto sisapridin [29]. Kohonnut ekspressio sykliini D1 ihmisen mahalaukun kasvaimet korreloi erityisen huonoon ennusteeseen [30], siis ymmärtää tekijät, jotka lisäävät sykliini D1 ilmentyminen voi johtaa hoidon mahdollisuuksia tämän ja muiden syöpään. Yliekspressio sykliini D1 on ehdotettu vaikuttavan onkogeneesiin häiritsemällä solusyklin, ja sen on raportoitu olevan tärkeä onkogeenisen tekijä ruokatorven syöpä [31], ja jotka liittyvät ydinvoiman kertyminen β-kateniinin munasarjojen endomet- adenokarsinoomat [32]; ydinaseiden sykliini D1 yli-ilmentymisen sappirakon karsinoomien on kriittinen tapahtuma [33].

Tässä kuvaamme laajoja metaplastiset muutoksia mahalaukun muscosa johtuu geneettisestä häiriöt Kcne2
. Tämä liittyy lisääntynyt ydinvoiman sykliini D1 ilmentyminen mahalaukun limakalvon, muistuttaa tulokset aikaisemmista in vitro
tutkimuksissa KCNE2 [12]. Että nykyisen raportin eikä edellisessä tutkimuksessa kuitenkin rajata mekanismi sykliini D1 säätelyyn ylöspäin Kcne2
^{- /- limakalvo - on se seurausta metaplastiset muutosten toissijainen aklorhydria näissä hiirissä, tai on siellä suoremman yhdistyksen välillä Kcne2
ja sykliini D1? Tutkimuksen mukaan Yanglin ja kollegoiden esittää jälkimmäisen ainakin osittain, koska niiden tutkimuksessa sykliini D1 muutoksia tapahtunut eristettyjä soluja ilman vaikutusta aklorhydrian [12]. Katsomme, että muutokset toissijainen aklorhydria ovat todennäköisesti hallitseva tekijä, mutta suora yhteys ei voida sulkea pois. Mielenkiintoista, hERG, toinen kumppani KCNE2, ilmaistaan ​​mahalaukun syöpäsoluissa mutta ei normaaleissa mahalaukun epiteelin, ja hERG salpaaja sisapridi aiemmin oli vähentää mahan syöpäsolujen kasvua estämällä S-vaiheeseen siirtymistä G (1) vaiheeseen solusyklin lisääminen apoptoosin [29]. Koska KCNE2 osittain vaimentaa hERG virtojen vähentämällä yhtenäinen johtokyky ja ylinopeus deaktivointi [23], se on kiehtova mahdollisuus, että havaittu antiproliferatiivisia vaikutuksia KCNE2 yli-ilmentymisen in vitro
[12] johtuvat hERG vaimennustyypin edistämällä apoptoosin, ja toisaalta, että KCNE2 alassäätöä tai geneettinen häiriö voidaan suosia mahalaukun solujen lisääntymistä lisäämällä hERG virrantiheyttä.}

GCP ja TFF2 ilmentäviä metaplasiaa (SPEM) in Kcne2 ^{- /-
hiiret}

GCP voi esitellä ihmisillä ajoittain vatsakipu, turvotus, mahalaukun tukos tai ylemmän ruoansulatuskanavan verenvuotoa, ja on yleisimmin havaittu potilailla, joilla on ollut joko gastrectomy tai gastrostomian [34]. Kuitenkin joissain tapauksissa on raportoitu ilman yhdistyksen ennen mahalaukun leikkausta [35], [36]. Patogeneesissä ihmisen GCP uskotaan syntyvän lääkintähenkilöstön muscularis limakalvojen, mikä voi johtaa kohdunulkoisen sulkeutumi- mahalaukun rauhasten submucosa, muscularis limakalvoille tai herakalvojen, tai krooninen tulehdus. GCP pidetään yleisesti hyvänlaatuinen kliininen kokonaisuus, vaikka yhdessä mahasyöpä on raportoitu [14], [37], [38].

Koe-eläimillä GCP toissijainen Helicobacter sp
. infektio on kuvattu edeltäjä intramucosal dysplasia ja neoplasia [39], ja liittyvät kehittäminen mahalaukun syöpä. GCP on usein löydetty H. pylori
infektoiduista Mongolian gerbiilit että myös kehittäneet mahalaukun adenokarsinoomaa ja imukudoksen liikakasvu [40]. Aiemmassa hiiren geneettistä mallia GCP, TGF beta 1 <sup>+/- hiirille kehittyi rauhas hyperplastic vaurioita, että jaettu morfologisia piirteitä ihmisen GCP, sekavin tulehduksellinen soluttautumista ympäröivä limakalvon ja krooninen vaskuliittia kudoksissa vieressä nämä muutokset [ ,,,0],41]. Täällä Kcne2
- /- hiirissä, GCP tapahtuu ilman ensisijainen Tulehdusmuutosten, ja riippumaton verisuonten tuhoutumisen. Sen sijaan ehdotamme, että ensisijainen vika on menetys KCNE2 β-alayksikön kanavalta komplekseja KCNQ1 heikentää siten tärkeä apikaalisella K + kierrätys väylän parietaalisoluihin ja estää mahalaukun happamuuden lisääminen parietaalisolun HKA. Vaikka tämä merkitsee "toiminnallinen surkastumista" in perietaalisolun väestö, aiemmissa tutkimuksissa suoliston metaplasiaa todellinen menetys parietaalisoluissa, kutsutaan "oxyntic surkastumista", pidettiin tärkeä prosessi etiologiassa suoliston metaplasiasta liittyy happo refluksitauti tai H. pylori
infektio, ja on yleisin metaplastiset prosessi havaittu maha-suolikanavan yläosassa [42].</sup>

Oxyntic surkastumista ilman merkittävää tulehdusta voidaan indusoida DMP-777, neutrofiilien elastaasi-inhibiittori, jota kohdentaa myös parietaalisolujen takia sen toiminnan kanssa protonofori [43]. Oxyntic atrofia mahalaukun-hiirillä, hoidon jälkeen DMP-777, johtaa nopeasti TFF2 ilmentävien metaplasia, jota kutsutaan myös spasmolyyttinen peptidi ilmentävät metaplasiaa (SPEM) [44]. SPEM on merkittävä, koska se liittyy läheisesti ihmisen mahalaukun adenokarsinooma, ja se havaitaan useimmissa fundic rauhasen koepalat ihmisen H. pylori
infektoiduista gastriitti potilaiden [45]. Ilmestyminen SPEM in Kcne2
<sup>- /- hiiret puuttuessa joko H. pylori
tai klassista oxyntic surkastumista viittaa siihen, että "toiminnallinen surkastuminen" aiheuttama Kcne2
poisto voi riittää laukaisemaan SPEM. Yksi merkittävä ero Kcne2
- /- hiiret ja ne, jotka ovat Nozaki tutkimuksessa on, että Kcne2
- /- hiiret eivät hypergastrinemisia, ei gastriini-puutosta. Toinen ero on, että DMP-777 häiritsee mahan tubulovesicle protonigradienttia heikentämättä H + K + - ATPaasi-toiminto, kun taas kohdennettu Kcne2
häiriö ehkäisee H + /K + -ATPaasi toiminto poistamalla sen luminaaliselle alustan, K + ionit [7], [44]. Ehkä tämä jälkimmäinen mekanismi saattaa tulevaisuudessa paljastaa vihjeitä koskien kriittisten tapahtumien oxyntic surkastumista, jotka johtavat SPEM: se on tällä hetkellä ehdotettu, että SPEM induktio poikkeama johtuu in perietaalisolun-erittyy normaalien mahalaukun limakalvon uudistumista, joka sisältää Sonic Hedgehog ja TGF-α [46], [47] menettämisen vuoksi parietaalisolujen. Lisätutkimuksia Kcne2
- /- parietaalisoluihin - jotka ovat vielä läsnä, mutta virheellisesti - voi paljastaa sääntelyviranomaisten jota he voivat silti erittää, ja ne, joita ne eivät voi.</sup>

mahalaukun limakalvo on Kcne2
<sup>- /- hiirillä osoittavat myös lisääntynyt ilmentyminen perustettu leviämisen merkki Ki67, joka ilmenee kasvu leveys limakalvon proliferatiivisen bändi, ja niin Ki67-positiivisten solujen vuori kystat alueilla GCP. Samoin de-differentiaatiomarkkeri CK7, ei ilmaistu 1-vuotias Kcne2
+ /+ mahalaukun limakalvon, laajasti ilmaistu että Kcne2
- /- hiirissä. Kun nämä ja merkkiaineiden edellä kuvatut yhdessä, Kcne2
- /- mahalaukun limakalvon näyttelyitä metaplasiaa useita piirteitä preneoplasian, ja joissakin tapauksissa neoplasia, etenkin tietyn patogeenittomassa ympäristössä ilman näyttöä mahalaukun helikobakteeri
infektion tai oxyntic surkastumista, ja ilman kemiallisia estäjiä mahalaukun happamoitumista. Yhdessä havainto tässä, että perietaalisolun KCNE2 ilmaisu näyttää pienenevän ihmisen mahasyövän kudoksen (kuva 4) ja edellisen raportin, joka KCNE2 estää mahasyövän soluproliferaatiota [12], tulokset viittaavat KCNE2 häiriöitä liittyy mahalaukun syövän etenemisessä. Jatkotutkimuksissa edellyttää tutkittaessa Kcne2
häiriöitä lisää alttiutta mahasyövässä sisällä taudinaiheuttajista ja karsinogeeni-pohjaiset protokollat, taustalla olevia mekanismeja nämä mahdolliset erot, ja mahdolliset mekanistinen yhteyksiä Kcne2
, sykliini D1 ja solukierron häiritseekin rajojen ulkopuolella aklorhydrian liittyvät sairaudet verestä. Lisäksi, kuten KCNQ1 ja KCNE2 myös koekspressoidusta kilpirauhasen epiteelisoluissa, missä ne ovat tärkeitä kilpirauhashormonin biosynteesin [48], se on kiinnostavaa tutkia mahdollisen roolin KCNE2 epätavallisissa thyrocyte lisääntymistä.</sup>

Materiaalit ja menetelmät

Generation ja käyttöä geenin kohdistettujen hiiret

Kaikki hiiret kuvattu tässä tutkimuksessa oli pidetty, hyödynnetty ja lopetettiin mukaan NIH ja Cornell University Institutional Animal Care ja Käytä komitean ohjeita. Kaikki hiiret kuvattu tässä tutkimuksessa oli pidetty, hyödynnetty ja lopetettiin mukaan NIH ja Weill Medical College Institutional Animal Care ja Käytä komitean ohjeita. Eettinen hyväksyntä kasvattaa ja sato kudoksen villin tyypin ja Kcne2
<sup>- /- hiiret biolääketieteellisen tutkimuksen hyväksyi Weill Medical College Institutional Animal Care ja Käytä komitea (protokolla 0704-610A). Kcne2
- /- hiiret synnytettiin kuten on aikaisemmin kuvattu C57BL /6 Kcne2 + /
- x Kcne2 +/-
ristit [7]. Numeeriset tiedot analysoitiin Excel-ohjelmiston (Microsoft) käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysi (ANOVA) ja tilastollista merkittävyyttä asetettu P
< 0,05.</sup>

Histologia

histologia ja vatsa massa kvantifiointiin, Kcne2 <sup>+ /+
ja Kcne2
- /- hiirillä 3 viikkoa, 3 kuukautta ja 12-15 kuukausi tapettiin käyttämällä CO _{2 tukehtumisen (5-10 per genotyyppi). Mahat poistettiin post mortem, vatsa määritetty massa, sitten vatsa kudos fiksoitiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin, käsitellään rutiinimenetelmiä ja upotetaan parafiini. Mahalaukun limakalvon leikkeet leikattiin 5 um välein, sijoitetaan positiivisesti varautuneet Superfrost dioja, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H &E), ja arvioidaan Olympus BX45 mikroskoopilla.}</sup>

immunohistokemia

immunohistokemiallinen tunnistus Ki67, CK-7 ja TFF2 (tunnetaan myös nimellä spasmolyyttinen peptidi) suoritettiin käyttäen Discovery XT prosessori (Ventana Medical Systems). Primaarisen vasta-aineen pitoisuudet käytettiin: 0,05 ug /ml (kanin polyklonaalinen anti-Ki67, Vector Labs); 1 ug /ml (hiiren monoklonaalinen anti-CK-7, Abcam); 1 ug /ml (hiiren monoklonaalinen anti-TFF2, Abcam). Edeltävät primaarisen vasta-aineen inkubointi, kudosleikkeet blokattiin 30 min 10% normaalia vuohen seerumia, 2% BSA: ta PBS: ssä (anti-Ki67); 30 min 10% normaalia vuohen seerumia, 2% BSA: ta PBS: ssä ja Avidin /biotiini 8 min (anti-CK-7); 30 min 10% normaalia vuohen seerumia, 2% BSA PBS: ssä ja Avidin /Biotiini 4 min (anti-TFF2). Ensisijainen vasta-inkubaatioajat olivat: 3 h (Ki67 ja CK-7); 5 tuntia (anti-TFF2). Toissijaiset vasta-inkubaatiot olivat: 32 min 1:200 biotinyloidun vuohen anti-kani-lgG (Vector Labs) ja Ki67; 60 min 1:200 biotinyloidun hevosen anti-hiiri-IgG: tä (Vector Labs) ja CK-7 ja TFF2. Sillä Ki67 sekundäärinen vasta-aine inkuboinnin esto D, streptavidiini-HRP ja DAB detektioreagenssipakkaus (Ventana Medical Systems) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. CK-7 ja TFF2, hiiren IgG1 (5 ug /ml) käytettiin isotyypin negatiivisena kontrollina, ja esto D, streptavidiini-HRP ja DAB detektioreagenssipakkaus (Ventana Medical Systems) käytettiin.

sykliini- D1 havaitseminen, vatsa dioja kuumennettiin 58-60 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten parafiini. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla osiot 1% vetyperoksidilla PBS: ssä 15 min (8,3 ml 30% H _{2O 2 /241,7 ml PBS), jota seuraa peittymisen antigeenisen epitoopin mikrossa 10 mM sitraattia puskuri suurella teholla 15 min. Objektilasit jäähdytettiin 20 min ajan, pestiin tislatussa vedessä 5 minuutin ajan, siirretään PBS: ää ja inkuboitiin 10% tavallista hevosen seerumia (2% BSA-PBS: ssä liuotin) 30 minuutin ajan kosteassa kammiossa. Hiiren monoklonaalinen anti-sykliini D1-vasta-ainetta (Cell Signaling), lisättiin 1:1000 2% BSA PBS: ssä ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Objektilasit huuhdeltiin PBS: ssä ja toisen hevosen biotinyloidun anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Vector Labs) levitettiin 1:500 PBS: ssä 30 minuutin ajan RT: ssä. Objektilasit pestiin ja Avidin-Biotin Complex (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Labs), joka oli laimennettu 1:25 PBS: ssä käytettiin 30 min. Signaali havaittiin inkuboimalla 3,3-Diaminobenzidine (Sigma, erä nro 026K3767), kunnes haluttu värin intensiteetti saavutettiin. Kun lopulliset pesujen veteen, objektilasit kevyesti vastavärjät- vuonna hematoksyliinillä. KCNQ1 ja HKA β yhden merkinnät ja tunnistus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [7]. CD34 tunnistus oli kanssa 01:50 anti-CD34-vasta-aine (Abcam). Objektilasit suhtautua Nikon Eclipse E600 mikroskoopilla ja valokuvattiin käyttäen RT värikamera ja SPOT-ohjelmisto (Diagnostic Instruments, Inc.).}

Immunofluoresenssikoe

Kaikki ihmisen kudosta saatiin ProSci, Poway, CA, ja sen, jotka on vahvistettu saatu pätevä ja lisensoitu patologian palvelut, käyttäen asianmukaisia ​​sopeutui suostumus käytettäväksi biolääketieteellisen tutkimuksen ja luovuttajan nimettömyyden suoja; siksi, ylimääräinen Weill Medical College Institutional Review Board eettinen hyväksyntä ei tarvita. Immunofluoresenssimenetelmällä havaitseminen HKA β, KCNQ1 ja KCNE2 ihmisen mahalaukun kudoksesta (ProSci) suoritettiin käyttäen Discovery XT prosessori (Ventana Medical Systems). Seuraavat ihmisen kudoksia käytettiin: normaali mahalaukku kudosta 50-vuotiaan naisen (PSC-10-809-XB1); mahasyöpä kudos, potilastietoja käytettävissä (PSC-10-814-CA1); mahalaukun adenokarsinooman kudosta 51-vuotiaan naisen (PSC-10-809-XA1). Primaarisen vasta-aineen pitoisuudet käytettiin: 0,5 mg /ml anti HKA β (hiiren monoklonaalinen, Affinity Bioreagents), 1 mg /ml anti-KCNQ1 (kanin tai vuohen polyklonaalinen, Chemicon), ja in-house anti-KCNE2 seerumia käytettiin 1:500 laimennus jälkeen pylväs-rikastamista IgG. Edeltävät primaarisen vasta-aineen inkubointi, kudosleikkeet blokattiin 30 min 10% normaalia vuohen seerumia, 2% BSA: ta PBS: ssä, mitä seurasi 8 min Avidin /Biotiini lohko. Primaarisen vasta-aineen inkuboinnin jälkeen (3 h), minkä jälkeen 32 minuutin inkuboinnin biotinyloidulla anti- hiiri-lgG (ABC-kitti Vector Labs), 60 min inkuboinnin biotinyloidulla anti- vuohi lgG: llä (ABC-kitti Vector Labs), tai biotinyloitu anti-kani vasta-ainetta 1:200 laimennus (Vectastain ABC-kitti). Toissijainen tunnistus suoritettiin streptavidiini-HRP D (Ventana Medical Systems), jonka jälkeen inkuboitiin Tyramide-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) tai Tyramide Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Stained diat näytettiin Zeiss Axiovert 200 Widefield mikroskoopilla ja kuvat hankittiin käyttäen MetaMorph ohjelmistoa 7,1 (Molecular Devices).

Western blotting

western blotting, mahalaukun kalvofraktiot valmistettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [7]. Kolme mahat 12 kuukauden ikäinen Kcne2 <sup>+ /+
ja Kcne2
- /- hiiret poistettiin post mortem, leikattu auki pitkin curvatura ventriculi suuria, poistettu ingesta ja välittömästi snap-jäädytettiin nestetypessä. Mahat homogenisoitiin sitten puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 100 ug /ml PMSF, 1 ug /ml Nonidet P40, 0,5% SDS: ää ja 0,5% natriumortovanadaattia, inkuboitiin sitten jään päällä 30 min ja sentrifugoitiin 12000 × g
20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus supernatantissa mitattiin Bradfordin menetelmällä. Kokonaisproteiinista (40 ug /kaista) laitettiin valmiiksi valettu tris-glysiini 4-20% geeli (Jule Inc, Milford, CT) ja erotettiin elektroforeettisesti. Proteiinit siirrettiin sitten PVDF-kalvolle (Bio-Rad, Hercules, CA), ja blokattiin 5% maitoa, 0,05% Tween-20 PBS: ssä 12 tunnin ajan 4 ° C: keinuvivun. Primaarista vasta-ainetta inkubaatiot (4 h, RT 1% maitoa, 0,05% Tween-20, PBS, "puskuri A ') olivat: 1:2000 anti-sykliini-D1 (Abcam); 1:5000 anti-GAPDH (Abcam). Membraanit pestiin 4 kertaa, 20 minuutin ajan kunkin vasta-aineen kanssa inkuboinnin ja inkuboitiin sitten sopivan sekundaarisen vasta-aineiden (BioRad) laimennettuna 1:10000 puskuriin A 2 h RT: ssa ja pestiin sitten 4 x 20 min kullakin puskurilla A ja kerran 5 min PBS: llä.</sup>

• Plos Pathogens: Caveolin-1 suojaa B6129 Hiiret Helicobacter pylori Gastritis
• PLoS ONE: Epstein-Barrin virus ja helikobakteeri-infektio on myönteinen vaikutus Vaikea gastriitti lapsipotilaille