PLoS ONE: Målrettet Sletting av Kcne2 årsaker Gastritt Cystica Profunda og Gastric Neoplasia

Abstract

Magekreft er den nest største årsaken til kreft død på verdensbasis. Predisponerende faktorer inkluderer aklorhydri, Helicobacter pylori
infeksjon, oxyntic atrofi og TFF2-uttrykke metaplasi. I parietalceller, apikale kaliumkanaler utgjør KCNQ1 α-subenheten og KCNE2 β-subenheten gi en K <sup>+ utstrømming strøm til rette syresekresjonen ved apikal H + K + ATPase. Følgelig genetisk sletting av murine Kcnq1
eller Kcne2
svekker syresekresjonen. Andre bevis har foreslått en rolle for KCNE2 i human magekreft celleproliferasjon, uavhengig av sin rolle i mage forsuring. Her viser vi at en-åringen Kcne2
- /- mus i et patogen-fritt miljø hele utstillingen en alvorlig mage preneoplastiske fenotype bestående gastritt cystica profunda, seks ganger økt mage masse, økt Ki67 og kjernekraft Cyclin D1 uttrykk, og TFF2- og cytokeratin 7-uttrykke metaplasi. Noen Kcne2
- /- mus også utstilt pyloriske polypoid adenomer som strekker seg inn i tolvfingertarmen, og neoplastiske invasjon av tynne vegger fartøy i sub-mucosa. Endelig, analyse av menneskelig magekreft vev indikerte redusert parietalcellen KCNE2 uttrykk. Sammen med tidligere funn, tyder resultatene KCNE2 avbrudd som en mulig risikofaktor for mage neoplasi</sup>

Citation. Roepke TK, Purtell K, kong EC, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) Målrettet Sletting av Kcne2
Årsaker Gastritt Cystica Profunda og Gastric neoplasi. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10,1371 /journal.pone.0011451

Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

mottatt: 3 mai 2010; Godkjent: 13 juni 2010; Publisert: 06.07.2010

Copyright: © 2010 Roepke et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. G.W.A. er støttet av National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health (R01 HL079275), American Heart Association (Grant-i-Aid 0855756D), og en Irma T. Hirschl Karriere Scientist Award. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er fortsatt en av de viktigste årsakene til dødelighet, og den nest største årsaken til kreftdød, over hele verden. Gastric kreftutvikling er en prosess som utvikler seg gjennom flere stadier inkludert oxyntic atrofi, sårdannelse, foveolar hyperplasi, hypo- og aklorhydri og slimete celle metaplasi [1]. Til tross for fremskritt i behandling av magekreft, er relativt lite kjent om de molekylære mekanismene som er involvert i mage karsinogenese, utvikling av normal mageslimhinnen i preneoplastiske helsefare, eller den potensielle rolle for ionekanaler i disse prosessene.

Parietal celler oppnå mage forsuring i kraft av en apikal H ^{+ K + ATPase (HKA) som pumper protoner i magen lumen i bytte for K + ioner. For å opprettholde denne aktiviteten, K + -ioner må reise fra parietalcellen inn i magelumen via den apikale membran, for å sikre fortsatt substrat for HKA [2]. Dette K + ion utstrømming skjer gjennom en eller flere typer av apikal, K + - selektive kanaler. Flere innover likeretter (KIR) kanaler er innblandet i denne prosess basert på parietalcellen ekspresjon og farmakologisk bevis [3], [4], men så langt det er genetisk bevis for kun en kanal denne rollen: KCNE2-KCNQ1 [5] - [7]. KCNQ1 er en seks-transmembrandomene α-subenheten fra S4 superfamilien, som danner funksjonelle, de spenningsstyrte, homotetrameric K + - selektive kanaler i heterologe ekspresjonsstudier [8], [9]. KCNQ1 kan også danne hetero kanal komplekser med tilhørende subenheter fra KCNE genfamilien, og alle fem kjente KCNE genprodukter har blitt vist å regulere KCNQ1 funksjon i heterologe ekspresjonsstudier [10]. One, KCNE2, konverterer KCNQ1 til en spenningsuavhengig, konstitutivt aktiv kanal hvis nåværende økes med lav pH. KCNE2 og KCNQ1 er begge uttrykt ved eller i nærheten av parietal celle apikale membran, og målrettet genet delesjon av enten subenhet resulterer i aklorhydri på grunn av nedsatt magesyresekresjon [5] - [7]. Dermed KCNE2-KCNQ1 kanaler blir ansett som viktig for utskillelsen av magesyre og tenkte å gi luminal K + ioner som et substrat for mage HKA}

Kcnq1
<sup>-. /- mus og Kcne2
- /- mus viser lignende mage fenotyper, preget av aklorhydri, hypergastrinemi og mage kjertel hyperplasi [5] - [7]. Parietalceller fra enten null showet ~ 10 ganger redusert evne til å gjenopprette fra proton lasting, noe som tyder på en primær defekt i utskillelsen av magesyre. Kcnq1
- /- mus også utvikle metaplasi, dysplasi og pre-maligne adenomatøs hyperplasi av magen uavhengig av infeksjon [11]. Dette tyder på at KCNQ1 dysfunksjon kan føre til mage neoplasi uavhengig av H. pylori
grunn av alvorlig aklorhydri, eller representere en ekstra risikofaktor som sammen med H. pylori
kunne disponere for magekreft</sup>

aklorhydri og mage hyperplasi vi tidligere observert i Kcne2
<sup>-. /- mus var slående gitt at pore-forming underenhet av komplekse, KCNQ1, var fortsatt til stede, og faktisk var det sterkt uttrykt i dobbelt antall celler per mage kjertel i Kcne2
- /- mus sammenlignet med Kcne2
+ /+ mus [7]. I en fersk undersøkelse, ble KCNE2 uttrykk funnet å være uttrykt ved relativt lave nivåer i humane mage svulster og i mage kreft cellelinjer; Videre, tvunget over-ekspresjon av KCNE2 trykkes veksten av humane magecancerceller i vevskultur, og i nakne mus [12]. Disse funnene hevet spennende mulighet for at KCNE2 kan være involvert i mage karsinogenese, og potensielt uavhengig av enten H. pylori
infeksjon eller aklorhydri. Her, for ytterligere å definere potensielle rolle KCNE2 i regulering av normal mage cellevekst, gransket vi mage patologi Kcne2
- /-. Mus opptil 15 måneders alder</sup>

Resultater

Kcne2 ^{- /-
mus utviser progressive mage hyperplasia}

Vi har tidligere vist at Kcne2 er nødvendig for normal regulering av mage mucosal cellevekst: 3- måneder gamle Kcne2
<sup>- /- mus har mage hyperplasi, aklorhydri og unormal parietalcellen morfologi [7]. Her sammenlignet vi magen masse av 3-ukers, 3-måneds- og 12-15 måneder gamle Kcne2
- /- mus. Massen av magene på 3 ukers alder var lik for Kcne2 + /+ Hotell og Kcne2
- /- mus, mens etter 3 måneder var det betydelig mage hyperplasia i Kcne2
- /- mus. Denne forskjellen har økt med 12-15 måneder i den grad at Kcne2
- /- mus hadde magene seks ganger større enn de av Kcne2 + /+
mus på samme alder (figur 1 A)</sup>

Kcne2 ^{-. /-
mus utviser gastritt cystisk profunda}

Selv ved 3 ukers alder, til tross for lik mage masse som for Kcne2 <sup>+ /+
mus, mageslimhinnen av Kcne2
- /- mus allerede viste vacuolations nær basolateral side (figur 1 B; forstørret i D). For å undersøke utviklingen av mage hyperplasi og dens konsekvenser, totalt elleve 12-15 måneder gamle Kcne2
- /- mus og fem Kcne2 + /+
musene ble histologisk undersøkt. Den mageslimhinnen i alt Kcne2
- /- mus viste glandular hypertrofi og diffus hyperplasi med økt antall slimceller og parietalceller som ble tidvis vacuolated (figur 1 C). Påfallende, gastritt cystica profunda (GCP) ble observert i 11/11 Kcne2
- /- mus, men 0/5 av Kcne2
+ /+ mus ( χ 2 p
= 0,002) (forstørrelse av cyste i figur 1 E). Utvidede kjertler inneholdt celleavfall, og i noen, men ikke alle Kcne2
- /- mus, nøytrofile. Det var også gastrisk epitel hyalinosis med sporadiske intraluminale krystaller, og Lymfoplasmacytær aggregater i slimhinnen, submucosa og muskularis. I noen 12-15 måneder gamle Kcne2
- /- mus mager, fremtredende lamina proprial fibrose ble oppdaget, særlig i de overfladiske lag. GCP, også tidligere kalt godartet gastrisk pseudo, vanligvis presenterer som et spektrum av hyperplastiske og metaplastiske forandringer etter skade på mageslimhinnen. Mens GCP demonstrerer histologiske funksjoner knyttet til malignitet, er det i seg selv generelt ansett funksjonelt godartet - selv om det har blitt foreslått som en mulig risikofaktor for magekreft [13], [14]</sup>

Økt proliferative markører i mage. slimhinnene i Kcne2 ^{- /-
mus}

Viktigere uttrykk for etablerte preneoplastiske markører ble økt i Kcne2
<sup>- /- mus sammenlignet med Kcne2
+ /+ mus. Ki67-antigen er et cellesyklusrelatert kjerneprotein som vanligvis brukes som en markør spredning i prolifererende og neoplastiske vev, inkludert mage [15]. Ki67 flekker i seksjoner fra Kcne2
+ /+ mus mager (3 måneder) indikerte en liten gruppe Ki67 positive celler i isthmus regioner av mage kjertler, mens dette proliferativ rommet ble betydelig utvidet i alders- matchet Kcne2
- /- mus (figur 2 A-C). Epitel fôr cystisk områder av GCP i 12-måneder gamle Kcne2
- /-. Mus viste også fremtredende farging av atomkjerner med Ki67, indikerer en høy spredning rate (figur 2 B)</sup>

Cytokeratin (CK) -7 er et 54 kDa polypeptid uttrykkes i en lang rekke av epitelvev, inkludert lunge-, bryst-, og føtal human mage; men det er imidlertid ikke uttrykt i gastrointestinal epithelia normal voksen [16]. Oppregulering av CK-7, en indikasjon på dedifferentiation, var tydelig i Kcne2
<sup>- /- mageslimhinnen ved 12 måneder; i alders matchet Kcne2
+ /+ mus, mageslimhinne positive epitelceller var mye sjeldnere (figur 2 D). CK-7 var også fremtredende rundt cyster (figur 2 E)</sup>

TFF2-uttrykke metaplasi i mageslimhinnen av Kcne2 ^{-. /-
Mus}

Trefoil- faktor familie (TFF) 2-uttrykke metaplasi er assosiert med progresjon til magekreft hos mennesker, og i mongolske ørkenrotte infisert med H. pylori product: [17]. Mageslimhinnen av Kcne2
^{- /- mus viste områdene metaplasi med fremtredende TFF2 uttrykk, blant annet i epitelceller lining cyster (figur 3 A-C). TFF2-uttrykke metaplasi er vanligvis forbundet med oxyntic atrofi, karakterisert som et tap av parietalceller [1]. Her, analyserte vi mageslimhinnen fra 12-måneder gamle mus med TFF2-uttrykke metaplasi for ekspresjon av HKA β-subenheten (HKA β), en parietalcellen markør. Påfallende var det ingen bevis for oxyntic atrofi i form av antall parietalceller (figur 4 A). Videre ble hka β uttrykt i cellene lining cyster (figur 4 B)}

Økt mage mucosal Cyclin D1 uttrykk og mage neoplasi i Kcne2 ^{-. /-
Mus}

Redusert KCNE2 uttrykk ble tidligere foreslått å øke spredning i magekreft cellelinje SGC7901 via økt uttrykk av cyclin D1 [12]. Her vestlige blotter antydet at Kcne2
genet sletting økt total Cyclin D1 uttrykk i mageslimhinnen av 12 måneder gamle mus (figur 5 A). Cyclin D1 viste svak og overveiende cytoplasmisk ekspresjon på basis av Kcne2
<sup>+ /+ oxyntic kjertler (figur 5 B, C, venstre panel), som tidligere beskrevet for normal, prolifererende celler i mus mage [ ,,,0],18]. I motsetning til dette, i Kcne2
- /- mus, Cyclin D1 viste mer utbredt og nukleær farging i halsen eidet region av magekjertler, og kjertel grop (figur 5 B, C, høyre panel). I to av elleve en-åringen Kcne2
- /- ble observert mus analysert, pylorusstenose polypoid adenomer, som strekker seg inn i tolvfingertarmen (figur 5 D). Den samme to Kcne2
- /- mus også utstilt neoplastisk vekst i form av tromber består av fibrin og kjertel epitel, i tynne vegger fartøy (identifisert ved hjelp av endothelial markør CD34) i mage submucosa ( Figur 5 E-H).</sup>

redusert parietalcellen KCNE2 uttrykk i menneskelig magekreft vev

Gitt at i en tidligere studie redusert KCNE2 uttrykk ble funnet å forbedre magekreft cellelinje spredning, og KCNE2 ekspresjon ble funnet å bli redusert i human magekreft [12], undersøkte vi KCNE2 ekspresjon i normalt humant gastrisk mucosa, og magekreft vev. Immunofluorescence studier viste slående forskjeller med hensyn til KCNE2 og KCNQ1 samlokalisering, mellom normal og ondartet menneskelig mage slimhinner. Som forventet, KCNQ1 og KCNE2 samlokalisert sterkt i parietalceller i normal menneskelig mageslimhinnen (figur 6 A), som gjorde KCNQ1 og hka β (Figur 6 B). I motsetning til i menneskelige mage karsinom, KCNQ1 og KCNE2 uttrykk sjelden overlappet (Figur 6 C, D), selv om KCNQ1 beholdt sin sterke samlokalisering med hka β (figur 6 E). Dermed KCNE2 uttrykk i parietalceller ble sjelden observert i magekreft. Mangelen på KCNE2-KCNQ1 samlokalisering var enda mer dyptgripende i menneskelig adenokarsinom i ventrikkel (figur 6 F), som igjen beholdt samlokalisering av KCNQ1 og hka β (figur 6 G).

Diskusjoner

kaliumkanaler i proliferative forstyrrelser

Kaliumkanaler kanaler~~POS=HEADCOMP har dukket opp som et potensielt mål for anti-kreft terapi [19], inkludert KCNQ1, hERG og Kv2.1, som alle er alfa subenheten partnere KCNE2. Forstyrret prege forårsaket av mutasjoner i genet KCNQ1 årsaken Beckwith-Wiedemann syndrom (BWS), som predisponerer for kreft [20] - [22], og KCNQ1 knockout predisponerer for gastrisk metaplasi [11]. HERG kaliumkanal α underenhet, som danner komplekser med den KCNE2 hjelpe-underenheten i humant hjerte [23], er over-uttrykt i noen svulster, og er blitt identifisert som en tumor overlevelsesfaktor [24] - [27] som har KV2. 1 [28].

KCNE2 ble tidligere funnet å bli uttrykt to ganger lavere i human magekreft vev enn i nabo normale gastriske celler, og tvunget oppregulering av KCNE2 hadde anti-proliferative effekt på magecancerceller in vitro Hotell og injisert i hårløse mus [12]. Mekanismen for denne anti-proliferativ effekt er nedregulering av Cyclin D1, forsinke progresjon gjennom cellesyklusen [12] lik det som ble observert med den hERG-blokkering cisaprid [29]. Forhøyet uttrykk for cyclin D1 i menneskelige mage svulster korrelerer med en særdeles dårlig prognose [30], derfor forstå faktorer som øker Cyclin D1 uttrykk kan føre til terapeutiske muligheter for dette og andre former for kreft. Overekspresjon av syklin D1 har vært foreslått for å bidra til onkogenesen ved å forstyrre cellesyklusen, og er blitt rapportert å være en viktig onkogent faktor i spiserørskreft [31], og forbundet med atom akkumulering av β-catenin in ovarian endometrioid adenokarsinomer [32]; kjernekraft Cyclin D1 overekspresjon i galleblæren karsinomer er en kritisk hendelse [33].

Her beskriver vi omfattende metaplastiske forandringer i gastrisk muscosa grunn av genetisk forstyrrelse av Kcne2
. Dette er assosiert med økt atom Cyclin D1 uttrykk i mageslimhinnen, minner om resultatene fra forrige in vitro
studier av KCNE2 [12]. Verken dagens rapport eller forrige undersøkelse, men avgrense mekanisme for Cyclin D1 oppregulering i Kcne2
^{- /- slimhinne - er det en konsekvens av metaplastiske endringer sekundært til aklorhydri i disse musene, eller er det en mer direkte sammenheng mellom Kcne2 Hotell og Cyclin D1? Studien av Yanglin og kolleger argumenterer for den sistnevnte i det minste delvis, fordi i deres studie av Cyclin D1 endringer inntraff i isolerte celler uten påvirkning av aklorhydri [12]. Vi anser at endringer sekundært til aklorhydri er mest sannsynlig dominerende faktor, men en direkte kobling kan ikke utelukkes. Interessant, hERG, en annen partner i KCNE2, er uttrykt i magekreftceller, men ikke normal mage epitel, og hERG kanal blocker cisaprid ble tidligere funnet å undertrykke magekreft cellevekst ved å hemme inntreden i S-fasen fra G (1) fase i cellesyklusen, og øker apoptose [29]. Fordi KCNE2 delvis undertrykker hERG-strøm ved å redusere enhetlig konduktans og raskere deaktivering [23], er det en interessant mulighet for at de observerte anti-proliferative effekter av KCNE2 overekspresjon in vitro product: [12] er på grunn av hERG strøm undertrykkelse fremmer apoptose, og omvendt at KCNE2 nedregulering eller genetisk forstyrrelse kan favorisere mage celleproliferasjon ved å øke hERG strømtetthet}

GCP og TFF2-uttrykke metaplasi (SPEM) i Kcne2 ^{-. /-
mus}

GCP kan presentere i mennesker med intermitterende smerter i epigastriet, oppblåsthet, mage obstruksjon eller øvre gastrointestinal blødning, og er mest sett hos pasienter med en historie med enten gastrektomi eller gastrostomi [34]. Imidlertid har noen få tilfeller er rapportert uten tilknytning til før gastrisk kirurgi [35], [36]. Patogenesen av human GCP er antatt å oppstå fra en skade muscularis slimhinner, noe som kan føre til ektopisk innfanging av gastriske kjertler i submucosa, muscularis mucosa eller serosa, eller av kronisk betennelse. GCP er ofte betraktet som en godartet klinisk enhet, selv om tilknytning til magekreft har blitt rapportert [14], [37], [38].

I forsøksdyr, GCP sekundært til Helicobacter sp
. infeksjon har blitt beskrevet som en forgjenger av intramucosal dysplasi og neoplasi [39], og i forbindelse med utvikling av magekreft. GCP ble ofte funnet i H. pylori
-infected mongolske ørkenrotte som også utviklet adenokarsinom i ventrikkel og lymfoid hyperplasi [40]. I en tidligere murine genetisk modell av GCP, TGF beta 1 <sup>+/- musene kjertelhyperplastic lesjoner som delte morfologiske funksjoner med menneskelig GCP, med blandet inflammatorisk infiltrasjon av omkringliggende slimhinner og kronisk vaskulitt i vevet i tilknytning til disse lesjonene [ ,,,0],41]. Her, i Kcne2
- /- mus, oppstår GCP i fravær av en primær inflammatorisk lesjon, og uavhengig av vaskulær utslettelse. I stedet foreslår vi at den primære feilen er tap av KCNE2 β-subenheten fra kanal komplekser med KCNQ1, og dermed svekke en viktig apikal K + resirkulering sti i parietalceller og forebygge mage forsuring av parietalcellen HKA. Selv om dette representerer en funksjonell atrofi 'i parietal cellepopulasjon i tidligere studier av intestinal metaplasi en faktisk tap av parietal-celler, kalt "oxyntic atrofi', ble ansett som en viktig prosess i etiologien av intestinal metaplasi, assosiert med syre reflux sykdom eller H. pylori
infeksjon, og er den vanligste prosess metaplastiske observert i den øvre mage-tarmkanalen [42].</sup>

Oxyntic atrofi i fravær av sterk inflammasjon kan induseres ved DMP-777, en nøytrofil elastase inhibitor hvilken også rettet mot parietalceller på grunn av sin handling som en protonophore [43]. Oxyntic atrofi i mage-manglende mus, etter behandling med DMP-777, fører raskt til TFF2-uttrykk metaplasia, også referert til som spasmolytisk peptid uttrykker metaplasi (SPEM) [44]. SPEM er bemerkelsesverdig på grunn av sin sterke tilknytning til menneskelig adenokarsinom i ventrikkel, og det er observert i de fleste fundic kjertel biopsier fra menneske H. pylori
-infected gastritt pasienter [45]. Utseendet til SPEM i Kcne2
<sup>- /- mus i fravær av enten H. pylori
eller klassisk oxyntic atrofi tyder på at "funksjonelle atrofi" forårsaket av Kcne2
sletting kan være nok til å utløse SPEM. En stor forskjell mellom Kcne2
- /- mus og de i Nozaki studien er at Kcne2
- /- mus er hypergastrinemic, ikke gastrin-mangelfull. En annen forskjell er at DMP-777 forstyrrer en gastrisk tubulovesicle proton gradient uten å svekke H + K + - ATPase-funksjon, mens målrettet Kcne2
forstyrrelser forhindrer H + /K + -ATPase funksjon ved å fjerne sin luminal substrat, K + ioner [7], [44]. Kanskje dette sistnevnte mekanismen kan i fremtiden avsløre ledetråder om de kritiske hendelser i oxyntic atrofi som resulterer i SPEM: det er i dag foreslått at SPEM induksjons resultater fra en mangel i parietalcellen-utskilt regulatorer av normal mage mucosal fornyelse, som inkluderer Sonic pinnsvin og TGF-α [46], [47] på grunn av tap av parietal-celler. Videre studier av Kcne2
- /- parietalceller - som fortsatt er til stede, men feil - kan avsløre regulatorer som de fortsatt kan utsondre, og de som de ikke kan</sup>

mageslimhinnen. av Kcne2
<sup>- /- mus viser også øket ekspresjon av den etablerte spredning Ki67 manifestert som en økning i bredden på slimhinne proliferative båndet, og som Ki67-positive celler som kler cyster i regioner av GCP. Tilsvarende de-differensiering markør CK7, ikke uttrykt i en-åringen Kcne2
+ /+ mageslimhinnen ble allment uttrykt i at av Kcne2
- /- mus. Tar disse og markører som er beskrevet ovenfor sammen, Kcne2
- /- mageslimhinnen utstillinger metaplasi med flere funksjoner i preneoplasia, og i noen tilfeller neoplasi, særlig i en bestemt patogen-fritt miljø med ingen bevis av mage Helicobacter
infeksjon eller oxyntic atrofi, og i fravær av kjemiske hemmere av mage forsuring. Sammen med det funn her at parietalcellen KCNE2 ekspresjon synes å være redusert i human magekreft vev (figur 4), og den tidligere rapport som KCNE2 inhiberer gastrisk cancer celleproliferasjon [12], tyder dataene på KCNE2 forstyrrelse er assosiert med magekreft progresjon. Fremtidige studier vil innebære å undersøke om Kcne2
avbrudd øker predisposisjon for magekreft innen patogen og kreftfremkallende baserte protokoller, mekanismene bak disse mulige forskjeller, og de potensielle mekanistiske sammenhenger mellom Kcne2
, Cyclin D1 og cellesyklus forstyrrelse utenfor riket av aklorhydri-assosiert sykdom etiologi. Videre, som KCNQ1 og KCNE2 er også co-uttrykt i skjoldbrusk epitelceller, hvor de er viktige for skjoldkjertelhormon biosyntesen [48], vil det være av interesse å undersøke en potensiell rolle for KCNE2 i unormal thyrocyte spredning.</sup>

Materialer og metoder

Produksjon og bruk av genet målrettet mus

Alle mus som er beskrevet i denne studien ble plassert, utnyttet og avlives i henhold til NIH og Cornell University Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer. Alle mus som er beskrevet i denne studien ble plassert, utnyttet og avlives i henhold til NIH og Weill Medical College Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer. Etisk godkjenning til å avle og høste vev fra villtype og Kcne2
<sup>- /- mus for biomedisinsk forskning ble godkjent av Weill Medical College Institutional Animal Care og bruk Committee (protokoll 0704-610A). Kcne2
- /- mus ble generert som tidligere beskrevet fra C57BL /6 Kcne2 + /
- x Kcne2 +/-
kors [7]. Numeriske data ble analysert med Excel-programvare (Microsoft) med enveis variansanalyse (ANOVA) med statistisk signifikans satt til P
. ≪ 0,05</sup>

Histologi

For histologi og mage masse kvantifisering, Kcne2 <sup>+ /+ Hotell og Kcne2
- /- mus i 3 uker, 3 måneder og 12-15 måneder ble avlivet ved hjelp av CO _{2 kvelning (5-10 per genotype). Magene ble fjernet post-mortem, mage masse bestemt, så magen vev ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin, behandlet av rutinemessige metoder og innebygd i parafinvoks. Gastric slimhinne snitt ble kuttet på 5 mikrometer intervaller, plassert på positivt ladde Superfrost lysbilder, farget med hematoxylin og eosin (H & E)., Og evaluert med et Olympus BX45 mikroskop}</sup>

Immunohistochemistry

immunhistokjemisk påvisning av Ki67, CK-7 og TFF2 (også kjent som spasmolytic peptid) ble utført ved hjelp av en Discovery XT-prosessor (Ventana Medical Systems). De primære antistoffkonsentrasjoner som ble brukt var: 0,05 mikrogram /ml (kanin polyklonale anti-Ki67, Vector Labs); 1 ug /ml (mus monoklonalt anti-CK-7; Abcam); 1 mikrogram /ml (monoklonalt anti-TFF2; Abcam). Foregående primære antistoff inkubering ble vevssnitt blokkert i 30 minutter i 10% normal geiteserum, 2% BSA i PBS (anti-Ki67); 30 minutter i 10% normal geiteserum, 2% BSA i PBS og avidin /biotin i 8 minutter (anti-CK-7); 30 min i 10% normalt geiteserum, 2% BSA i PBS og avidin /biotin i 4 minutter (anti-TFF2). Primære antistoff inkubasjonstidene var: 3-t (Ki67 og CK-7); 5 timer (anti-TFF2). Sekundære antistoff inkubasjoner var: 32 min i 1:200 biotinylated geit anti-kanin IgG (Vector Labs) for Ki67; 60 min i 1:200 biotinylert heste anti-mus IgG (Vector Labs) for CK-7 og TFF2. For Ki67 sekundært antistoff inkubasjon ble Blocker D, streptavidin-HRP og DAB deteksjon kit (Ventana Medical Systems) som brukes i henhold til produsentens instruksjoner. For CK-7 og TFF2, mus IgG1 (5 mikrogram /ml) ble brukt som en isotype negativ kontroll, og Blocker D, streptavidin-HRP og DAB deteksjon kit (Ventana Medical Systems) ble brukt.

For Cyclin D1-påvisning ble mageobjektglass ble oppvarmet ved 58-60 ° C i 30 minutter og deretter deparaffinized. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering av delene i en% hydrogenperoksid i PBS i 15 min (8,3 ml 30% H _{2o 2 /241,7 ml PBS) fulgt av avmaskering av det antigene epitop av mikrobølger i 10 mM sitrat buffer ved høy effekt i 15 min. Objektglass ble avkjølt i 20 min, vasket i destillert vann i 5 min, overført til PBS og inkubert i 10% normalt hesteserum (i 2% BSA-PBS fortynningsmiddel) i 30 minutter i et fuktig kammer. Mus monoklonalt anti-cyklin D1-antistoff (Cell Signaling) ble tilsatt ved 1:1000 med 2% BSA i PBS og inkubert over natten ved 4 ° C i et fuktig kammer. Platene ble skylt i PBS og den sekundære biotinylert heste anti-muse-IgG-antistoff (Vector Labs) ble applisert ved 1:500 i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Lysbilder ble vasket og en Avidin-Biotin Complex (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Labs) utvannet 1:25 i PBS ble søkt om 30 min. Det signal som ble påvist ved inkubasjon i 3,3-Diaminobenzidin (Sigma, Batch No. 026K3767) inntil den ønskede fargeintensiteten ble nådd. Etter siste vask i vann, ble lysbilder lett kontra i hematoxylin. KCNQ1 og HKA β enkelt merking og påvisning ble utført som beskrevet tidligere [7]. CD34 deteksjon var med 01:50 anti-CD34 antistoff (Abcam). Lysbilder ble sett på med et Nikon Eclipse E600 mikroskop og fotografert ved hjelp av en RT Farge kamera og SPOT programvare (Diagnostic Instruments, Inc.).}

immunfluorescens

All menneskelig vev ble hentet fra Prosci, Poway, CA, og ble sertifisert som har blitt hentet fra kvalifiserte og lisensierte patologi tjenester, ved hjelp av egnet dannet samtykke til bruk i biomedisinsk forskning og med donor anonymitet beskyttelse; Derfor var ikke nødvendig ekstra Weill Medical College Institutional Review Board etikk godkjenning. Immunfluorescens påvisning av hka β, KCNQ1 og KCNE2 i menneskets mage vev (Prosci) ble utført ved hjelp av en Discovery XT-prosessor (Ventana Medical Systems). Følgende menneskelig vev ble benyttet: normal mage vev fra en 50 år gammel kvinne (PSC-10-809-XB1); gastrisk karsinom vev, pasientinformasjon utilgjengelig (PSC-10-814-CA1); adenokarsinom i ventrikkel vev fra en 51 år gammel kvinne (PSC-10-809-XA1). De primære antistoffkonsentrasjoner som ble anvendt var: 0,5 mg /ml anti- HKA β (mus monoklonale, Affinity BioReagents), 1 mg /ml anti-KCNQ1 (kanin eller geit polyklonale, Chemicon), og in-house anti-KCNE2 serum ble benyttet i en 1:500 fortynning etter kolonne-berikende IgG. Forut for den primære antistoff inkubering ble vevssnittene blokkert i 30 minutter i 10% normal geiteserum, 2% BSA i PBS, etterfulgt av 8 min avidin /biotin-blokk. Det primære antistoff inkubasjon (3 timer), etterfulgt av 32 minutters inkubering med biotinylert anti-muse IgG (ABC kit fra Vector Labs), 60 min inkubering med biotinylert anti-geite-IgG (ABC kit fra Vector Labs), eller biotinylert anti-kanin antistoff på 1:200 fortynning (Vectastain ABC kit). Den sekundære påvisning ble utført med streptavidin-HRP D (Ventana Medical Systems), etterfulgt av inkubasjon med tyramide-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) eller tyramide Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Stained lysbilder ble sett med en Zeiss Axiovert 200 vidfelt mikroskop og bildene ble anskaffet ved hjelp MetaMorph programvare 7.1 (Molecular Devices).

Western blotting

For western blotting, mage membran fraksjoner ble fremstilt som tidligere beskrevet [7]. Tre magene fra 12-måneder gamle Kcne2 <sup>+ /+ Hotell og Kcne2
- /- mus ble fjernet post-mortem, skåret opp langs curvatura ventriculi major, ryddet av ingesta og umiddelbart snap-frosset i flytende nitrogen. Magene ble deretter homogenisert i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 pg /ml PMSF, 1 ug /ml Nonidet P40, 0,5% SDS og 0,5% natrium-ortovanadat, deretter inkubert på is i 30 minutter og sentrifugert ved 12000 × g
i 20 min ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen til supernatanten ble målt i henhold til Bradford-metoden. Totalt protein (40 ug /spor) ble fylt i en ferdigstøpte tris-glysin 4-20% gel (Jule Inc, Milford, CT) og separert ved elektroforese. Proteinene ble deretter overført på en PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA), og blokkert med 5% melk, 0,05% Tween-20 i PBS i 12 timer ved 4 ° C på en vugge. Primære antistoff inkubasjoner (4 timer, RT i 1% melk, 0,05% Tween-20, PBS, "Buffer A") var: 1:2000 anti-Cyclin D1-(Abcam); 1:5000 anti-GAPDH (Abcam). Membranene ble vasket 4 ganger, 20 minutter hver med antistoff inkuberingsbuffer deretter inkubert med de passende sekundære antistoffer (BioRad) fortynnet 1:10000 i buffer A i 2 timer ved romtemperatur og deretter vasket 4 ganger 20 minutter hver med Buffer A og en gang i 5 min med PBS.</sup>

• PLoS Pathogens: Caveolin-1 Beskytter B6129 Mus mot Helicobacter pylori gastritt
• PLoS ONE: Epstein Barr Virus og Helicobacter pylori-infeksjon er positivt forbundet med alvorlig gastritt hos barn