PLoS ONE: Målrettet Sletning af Kcne2 Årsager Gastritis cystica Profunda og Gastric Neoplasia

Abstrakt

mavekræft er den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan. Disponerende faktorer omfatter aklorhydri, Helicobacter pylori
infektion, oxyntic atrofi og TFF2 udtrykker metaplasi. I parietalcellerne, apikale kaliumkanaler omfattende KCNQ1 α underenheden og KCNE2 β underenheden give en K <sup>+ efflux strøm at lette mavesyresekretion ved den apikale H + K + ATPase. Derfor genetisk sletning af murine KCNQ1
eller Kcne2
svækker mavesyre sekretion. Andre beviser har foreslået en rolle for KCNE2 i human gastrisk cancer celleproliferation, uafhængig af dens rolle i gastrisk forsuring. Her viser vi, at en-årige Kcne2
- /- mus i et patogen miljø uden alle udviser en alvorlig gastrisk præneoplastiske fænotype omfattende gastritis cystica profunda, 6 gange øget mave masse, øget Ki67 og nuklear cyclin D1 udtryk, og TFF2- og cytokeratin 7-udtrykkende metaplasi. Nogle Kcne2
- /- mus også udstillet pylorus polypagtige adenomer strækker sig ind i duodenum, og neoplastisk invasion af tyndvæggede fartøjer i sub-slimhinden. Endelig analyse af human mavekræft væv angivet reduceret parietalcellerne KCNE2 udtryk. Sammen med tidligere fund, tyder resultaterne KCNE2 forstyrrelser som en mulig risikofaktor for gastrisk neoplasi</sup>

Henvisning:. Roepke TK, Purtell K, kong EF, La Perle KMD, Lerner DJ, Abbott GW (2010) Målrettet Sletning af Kcne2
Årsager Gastritis cystica Profunda og Gastric neoplasi. PLoS ONE 5 (7): e11451. doi: 10,1371 /journal.pone.0011451

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: May 3, 2010; Accepteret: Juni 13, 2010; Udgivet: Juli 6, 2010

Copyright: © 2010 Roepke et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. G.W.A. er støttet af National Heart, Lung og Blood Institute, National Institutes of Health (R01 HL079275), American Heart Association (Grant-In-Aid 0855756D), og en Irma T. Hirschl Career Scientist Award. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er fortsat en af ​​de vigtigste årsager til dødelighed, og den anden hyppigste årsag til kræft død, i hele verden. Gastrisk carcinogenese er en proces, udvikler sig gennem flere trin, herunder oxyntic atrofi, ulcusdannelse, foveolar hyperplasi, hypo- og achlorhydri og slim celle metaplasi [1]. Trods fremskridt i behandling af gastrisk kræft, er relativt lidt om de molekylære mekanismer involveret i gastrisk carcinogenese, udvikling af normale maveslimhinden i præneoplastiske gastriske læsioner, eller den potentielle rolle for ionkanaler i disse processer.

Parietale celler opnår gastrisk forsuring i kraft af en apikal H ^{+ K + ATPase (HKA), der pumper protoner i maven lumen i bytte for K + ioner. For at opretholde denne aktivitet, K + -ioner skal rejse fra parietalcellerne i maven lumen via den apikale membran, for at sikre fortsat substrat for HKA [2]. Dette K + ion udstrømning sker gennem en eller flere typer af apikal, K + - selektive kanaler. Adskillige indad ensretter (Kir) kanaler er impliceret i denne proces baseret på parietalcellens udtryk og farmakologisk beviser [3], [4], men hidtil er der genetisk bevis for bare en kanal opfylde denne rolle: KCNE2-KCNQ1 [5] - [7]. KCNQ1 er en seks-transmembrane domæne α subunit fra S4 superfamilien, som danner funktionel, spændingsstyrede, homotetramere K + - selektive kanaler i heterolog ekspression undersøgelser [8], [9]. KCNQ1 kan også danne heteromere kanal komplekser med accessoriske subunits fra KCNE genfamilien, og alle fem kendte KCNE genprodukter er blevet vist at regulere KCNQ1 funktion i heterolog ekspression undersøgelser [10]. One, KCNE2, konverterer KCNQ1 til en spænding-uafhængig, konstitutivt aktiv kanal, hvis strømmen øges med lav pH. KCNE2 og KCNQ1 er begge udtrykt ved eller nær parietalcellerne apikale membran og målgenet deletion af enten subunit resulterer i aklorhydri grundet nedsat mavesyresekretion [5] - [7]. KCNE2-KCNQ1 kanaler er således betragtes som afgørende for mavesyre sekretion og menes at give luminale K + ioner som substrat for den gastriske HKA}

KCNQ1
<sup>-. /- mus og Kcne2
- /- mus viser lignende gastrisk fænotyper, karakteriseret ved aklorhydri, hypergastrinæmi og gastrisk glandulær hyperplasi [5] - [7]. Parietalcellerne fra enten null show ~ 10 gange reduceret kapacitet til at inddrive fra proton lastning, hvilket tyder på en primær defekt i mavesyre sekretion. KCNQ1
- /- mus også udvikle metaplasi, dysplasi og præmaligne adenomatøs hyperplasi i maven uafhængig af infektion [11]. Dette antyder, at KCNQ1 dysfunktion kan føre til gastriske neoplasi uafhængige af H. pylori
grund af alvorlige aklorhydri, eller udgør en yderligere risikofaktor, der i forbindelse med H. pylori
kunne disponere for mavekræft</sup>

aklorhydri og gastrisk hyperplasi vi tidligere observeret i Kcne2
<sup>-. /- mus var slående, da pore-dannende subunit af komplekse, KCNQ1, stadig var til stede, og faktisk det var stærkt til udtryk i det dobbelte antal celler pr gastrisk kirtel i Kcne2
- /- mus i forhold til Kcne2
+ /+ mus [7]. I en nylig undersøgelse blev KCNE2 udtryk fundet at blive udtrykt på et relativt lavt niveau i humane gastriske tumorer og i gastrisk cancer cellelinjer; endvidere tvunget over-ekspression af KCNE2 undertrykkes væksten af ​​humane gastriske cancerceller i vævskultur, og i nøgne mus [12]. Disse resultater rejste den interessante mulighed at KCNE2 kan være involveret i gastrisk carcinogenese, og potentielt uafhængigt af enten H. pylori
infektion eller achlorhydri. Her yderligere at definere potentielle rolle KCNE2 i reguleringen af ​​normal gastrisk cellevækst, vi gennemgået gastrisk patologi Kcne2
- /-. Mus op til 15 måneders alderen</sup>

Resultater

Kcne2 ^{- /- iBooked.dk mus udviser progressiv gastrisk hyperplasi}

Vi har tidligere vist, at Kcne2 er nødvendig for normal regulering af gastrisk vækst slimhinde celle: 3- måneder gamle Kcne2
<sup>- /- mus har gastrisk hyperplasi, aklorhydri og unormal parietalcellens morfologi [7]. Her sammenlignes vi maven masse på 3-ugers, 3-måned-og 12-15 måneder gamle Kcne2
- /- mus. Massen af ​​maver på 3 ugers alderen var ens for Kcne2 + /+
Kcne2
- /- mus, hvorimod ved 3 måneder var der betydelig gastrisk hyperplasi i Kcne2
- /- mus. Denne forskel var steget med 12-15 måneder i det omfang, Kcne2
- /- mus havde maver 6 gange større end Kcne2 + /+
mus på samme alder (Figur 1 A)</sup>

Kcne2 ^{-. /-
mus udviser gastritis cystisk profunda}

Selv ved 3 ugers alderen, trods lignende mave masse som i Kcne2 <sup>+ /+
mus, maveslimhinden af ​​ Kcne2
- /- mus allerede viste vacuolations tæt på basolaterale side (figur 1 B; forstørret i D). For at undersøge udviklingen af ​​gastrisk hyperplasi og dens konsekvenser, alt elleve 12-15 måneder gamle Kcne2
- /- mus og fem Kcne2 + /+
mus blev histologisk undersøgt. Maveslimhinden i alle Kcne2
- /- mus udviste kirtel hypertrofi og diffus hyperplasi med øgede antal af mukøse celler og parietalceller der lejlighedsvis blev vakuoliserede (Figur 1 C). Slående, mavekatar cystica profunda (GCP) blev observeret i 11/11 Kcne2
- /- mus, men 0/5 af Kcne2
+ /+ mus ( χ 2 s
= 0,002) (forstørrelse af cyste i figur 1 E). Udvidede kirtler indeholdt celle debris og, i nogle, men ikke alle Kcne2
- /- mus, neutrofiler. Der var også gastrisk epitel Hyalinosis med lejlighedsvise intraluminale krystaller, og lymfoplasmacytisk aggregater i slimhinden, submucosa og muscularis. I nogle 12-15 måneder gamle Kcne2
- /- mus maver, fremtrædende lamina proprial fibrose blev noteret, især i de overfladiske lag. GCP, også tidligere kaldet godartet gastrisk pseudotumor generelt præsenterer som et spektrum af hyperplastiske og metaplastiske ændringer efter skader på maveslimhinden. Mens GCP demonstrerer histologiske træk forbundet med malignitet, er det i sig selv generelt betragtes funktionelt godartet - selv om det er blevet foreslået som en mulig risikofaktor for mavekræft [13], [14]</sup>

Øget proliferative markører i gastrisk. slimhinden i Kcne2 ^{- /-
mus}

Det er vigtigt, udtryk af etablerede præneoplastiske markører blev forøget i Kcne2
<sup>- /- mus sammenlignet med Kcne2
+ /+ mus. Ki67 antigen er et cellecyklus relateret kerneprotein almindeligt anvendt som en proliferationsmarkør i prolifererende og neoplastiske væv, herunder mave [15]. Ki67 farvning i afsnit fra Kcne2
+ /+ mus maver (3 måneder) viste en lille gruppe af Ki67 positive celler inden for isthmus regioner gastriske kirtler, mens denne proliferative rum blev udvidet betydeligt i alders- matchede Kcne2
- /- mus (Figur 2 A-C). Epitel foring cystisk områder af GCP i 12-måneder gamle Kcne2
- /-. Mus viste også fremtrædende farvning af kerner med Ki67, indikerer en høj spredning sats (Figur 2 B)</sup>

Cytokeratin (CK) -7 er et 54 kDa polypeptid udtrykkes i en lang række epitelvæv, herunder lunge-, bryst-, og føtal menneskelige mave; er det imidlertid ikke udtrykkes i normale voksne gastrointestinal epitel [16]. Opregulering af CK-7, indikerer dedifferentiering, var tydelig i Kcne2
<sup>- /- maveslimhinden på 12 måneder; i alder-matchede Kcne2
+ /+ mus, maveslimhinden positive epitelceller var langt sjældnere (Figur 2 D). CK-7 var også fremtrædende omkring cyster (Figur 2 E)</sup>

TFF2-udtrykkende metaplasi i maveslimhinden af ​​ Kcne2 ^{-. /- IBooked.dk mus}

Trefoil- faktor familien (TFF) 2-udtrykkende metaplasi er forbundet med progression til gastrisk cancer hos mennesker, og i mongolske hoppemus inficeret med H. pylori
[17]. Maveslimhinden af ​​ Kcne2
^{- /- mus udviste områder af metaplasi med fremtrædende TFF2 ekspression, herunder i epitelceller foring cyster (figur 3 A-C). TFF2-udtrykkende metaplasi er typisk forbundet med oxyntic atrofi, karakteriseret som et tab af parietalcellerne [1]. Her har vi analyseret maveslimhinden fra 12-måneder gamle mus med TFF2 udtrykker metaplasi for ekspression af HKA β underenhed (HKA β), en parietalcellens markør. Slående, var der ingen tegn på oxyntic atrofi udtrykt i antallet af parietalcellerne (figur 4 A). Endvidere blev hka β udtrykt i celler foring cyster (figur 4 B)}

Øget gastrisk slimhinde cyclin D1 udtryk og gastrisk neoplasi i Kcne2 ^{-. /-
Mus}

Reduceret KCNE2 ekspression er tidligere blevet foreslået at forbedre proliferation i gastrisk cancercellelinie SGC7901 via forøget ekspression af cyclin D1 [12]. Her foreslog western blots at Kcne2
gendeletion øget total cyclin D1 udtryk i maveslimhinden af ​​12-måneder gamle mus (figur 5 A). Cyclin D1 viste svag og overvejende cytoplasmatisk ekspression ved foden af ​​ Kcne2
<sup>+ /+ oxyntic kirtler (Figur 5 B, C, venstre paneler), som tidligere beskrevet for normale, prolifererende celler i muse maven [ ,,,0],18]. I modsætning hertil Kcne2
- /- mus viste Cyclin D1 mere udbredt og nuklear farvning i nakken isthmus region gastriske kirtler, og glandulær pit (Figur 5 B, C, højre paneler). I to af elleve 1-årige Kcne2
- /- blev observeret mus analyseret, pylorus polypagtige adenomer, strækker sig ind i duodenum (figur 5 D). De samme to Kcne2
- /- mus udviste også neoplastisk vækst i form af tromber sammensat af fibrin og kirtelepitel, i tyndvæggede fartøjer (identificeret ved anvendelse endothelial markør CD34) inden for gastrisk submucosa ( Figur 5 E-H).</sup>

reduceret parietalcellerne KCNE2 udtryk i human gastrisk cancer væv

Da reduceret KCNE2 udtryk i en tidligere undersøgelse fandtes at forbedre mavekræft cellelinje spredning, og KCNE2 ekspression viste sig at blive reduceret i human gastrisk cancer [12], undersøgte vi KCNE2 ekspression i normal human gastrisk mucosa, og gastrisk cancer væv. Immunfluorescens undersøgelser viste slående forskelle med hensyn til KCNE2 og KCNQ1 co-lokalisering, mellem normal og malign human gastrisk mucosa. Som forventet, KCNQ1 og KCNE2 co-lokaliseret kraftigt i parietalcellerne i normal human gastrisk mucosa (figur 6 A), som gjorde KCNQ1 og hka β (figur 6 B). I modsætning hertil i humane gastriske carcinomer, KCNQ1 og KCNE2 ekspression sjældent overlappet (Figur 6 C, D), selvom KCNQ1 bevaret sin stærke co-lokalisering med hka β (figur 6 E). Således blev KCNE2 udtryk i parietalceller sjældent observeret i gastrisk karcinom. Manglen på KCNE2-KCNQ1 co-lokalisering var endnu mere udtalt i human gastrisk adenocarcinom (figur 6 F), som igen bibeholdt co-lokalisering af KCNQ1 og hka β (figur 6 G).

Diskussion

Kalium kanaler i proliferative lidelser

Kaliumkanaler er dukket op som et potentielt mål for anti-cancer behandlinger [19], herunder KCNQ1, hERG og Kv2.1, som alle er a subunit partnere KCNE2. Forstyrret prægning forårsaget af mutationer i KCNQ1 genet årsagen Beckwith-Wiedemann syndromet (BWS), som disponerer til cancer [20] - [22], og KCNQ1 knockout prædisponerer gastrisk metaplasi [11]. The hERG kaliumkanal α underenhed, som danner komplekser med KCNE2 accessorisk underenhed i menneskehjerte [23], er overudtrykt i nogle tumorer, og er blevet identificeret som en tumor overlevelsesfaktor [24] - [27] som har Kv2. 1 [28].

KCNE2 blev tidligere fundet at blive udtrykt 2 gange lavere i human gastrisk cancer væv end i nabolandene normale gastriske celler, og tvunget opregulering af KCNE2 havde anti-proliferative virkninger på gastriske kræftceller in vitro
og injiceret i nøgne mus [12]. Den formodede mekanisme for denne antiproliferativ virkning er nedregulering af cyklin D1, forsinke progression gennem cellecyklussen [12] svarer til, hvad der blev observeret med den hERG blocker cisaprid [29]. Forhøjet udtryk for cyclin D1 i humane gastriske tumorer korrelerer med en særlig dårlig prognose [30], derfor forstå faktorer, der øger cyclin D1 udtryk kan føre til terapeutiske muligheder for dette og andre former for kræft. Overekspression af cyklin D1 er blevet foreslået at bidrage til onkogenese ved at forstyrre cellecyklussen, og er blevet rapporteret at være en vigtig onkogen faktor i esophageal carcinoma [31], og i forbindelse med nuklear akkumulering af β-catenin i æggestokkene endometrioide adenocarcinomer [32]; nukleare cyclin D1 overekspression i galdeblæren karcinomer er en kritisk begivenhed [33].

Her beskriver vi omfattende metaplastiske ændringer i den gastriske muscosa skyldes genetiske forstyrrelse af Kcne2
. Dette er forbundet med øget nukleare cyclin D1 udtryk i maveslimhinden, der minder om resultater fra tidligere in vitro
undersøgelser af KCNE2 [12]. Hverken den aktuelle rapport eller den tidligere undersøgelse, dog afgrænse mekanismen for cyclin D1 opregulering i Kcne2
^{- /- slimhinde - er det en konsekvens af metaplastiske ændringer sekundært til aklorhydri i disse mus, eller er der en mere direkte sammenhæng mellem Kcne2
og cyclin D1? Undersøgelsen fra Yanglin og kolleger argumenterer for sidstnævnte i det mindste delvis, fordi der i deres undersøgelse forekom cyclin D1 ændringer i isolerede celler uden indflydelse af aklorhydri [12]. Vi mener, at ændringer sekundært til aklorhydri er de mest sandsynlige dominerende faktor, men en direkte sammenhæng kan ikke udelukkes. Interessant, hERG, en anden partner i KCNE2, udtrykkes i mavekræft celler, men ikke normal gastrisk epitel, og hERG kanal blokker cisaprid blev tidligere fundet at undertrykke gastrisk vækst kræftcelle ved at hæmme indtræden i S-fasen fra G (1) fase i cellecyklus, stigende apoptose [29]. Fordi KCNE2 delvist undertrykker hERG strømme ved at reducere enhedsstat ledningsevne og fremskynde deaktivering [23], er det en spændende mulighed, at de observerede anti-proliferative virkninger af KCNE2 overekspression in vitro
[12] skyldes hERG nuværende undertrykkelse fremme apoptose, og omvendt, at KCNE2 nedregulering eller genetisk forstyrrelse kan begunstige gastrisk celleproliferation ved at øge hERG strømtæthed}

GCP og TFF2-udtrykkende metaplasi (SPEM) i Kcne2 ^{-. /-
mus}

GCP kan præsentere menneskehandel med intermitterende epigastriske smerter, oppustethed, gastrisk obstruktion eller øvre gastrointestinal blødning, og er mest almindeligt ses hos patienter med tidligere enten gastrektomi eller gastrostomi [34]. Imidlertid har nogle få tilfælde er rapporteret ingen sammenhæng til forudgående gastrisk kirurgi [35], [36]. Patogenesen af ​​human GCP menes at opstå fra en skade af muscularis slimhinden, hvilket kan føre til ektopisk indeslutte af gastriske kirtler i submucosa, muscularis slimhinder eller serøse hinder, og kronisk inflammation. GCP er almindeligt betragtes som en godartet klinisk enhed, selv om association med mavekræft er blevet rapporteret [14], [37], [38].

I laboratoriedyr, GCP sekundært til Helicobacter sp
. infektion er blevet beskrevet som en forgænger intramucosal dysplasi og neoplasi [39], og i forbindelse med udviklingen af ​​gastrisk karcinom. GCP blev hyppigt fundet i H. pylori
inficerede mongolske ørkenrotter, der også udviklede gastrisk adenocarcinom og lymfoid hyperplasi [40]. I en tidligere murine genetisk model af GCP, TGF beta udviklet en <sup>+/- mus glandulær hyperplastiske læsioner, delte morfologiske træk med human GCP, med blandet inflammatorisk infiltration af de omkringliggende slimhinde og kronisk vaskulitis i vævene støder op til disse læsioner [ ,,,0],41]. Her, i Kcne2
- /- mus, GCP forekommer i fravær af en primær inflammatorisk læsion, og uafhængig af vaskulær udslettelse. I stedet foreslås det, at den primære defekt er tab af KCNE2 β-underenheden fra kanal komplekser med KCNQ1 og derved svække en vigtig apikal K + genanvendelse vej hos parietalcellerne og forebyggelse gastrisk forsuring af parietalcellen HKA. Mens dette er en "funktionel atrofi" i parietalcellerne befolkning, i tidligere studier af tarm metaplasi et faktisk tab af parietalcellerne, kaldet 'oxyntic atrofi ", blev betragtet som en vigtig proces i ætiologien af ​​intestinal metaplasi, der er forbundet med syre refluks sygdom eller H. pylori
infektion, og er den mest almindelige metaplastisk proces observeret i den øvre mavetarmkanal [42].</sup>

Oxyntic atrofi i fravær af betydelig inflammation kan induceres af DMP-777, en neutrofil elastase inhibitor, som også henvender parietalcellerne grundet sin indsats som protonophore [43]. Oxyntic atrofi i gastriske-deficiente mus efter behandling med DMP-777, fører hurtigt til TFF2-udtrykkende metaplasi, også omtalt som spasmolytisk udtrykkende metaplasi (SPEM) [44]. SPEM er bemærkelsesværdig på grund af sin stærke tilknytning til menneskelig gastrisk adenocarcinom, og det er observeret i de fleste fundiske kirtel biopsier fra humant H. pylori
inficerede gastritis patienter [45]. Fremkomsten af ​​SPEM i Kcne2
<sup>- /- mus i fravær af enten H. pylori
eller klassisk oxyntic atrofi tyder på, at "funktionelle atrofi" forårsaget af Kcne2
sletning kan være nok til at udløse SPEM. En væsentlig forskel mellem Kcne2
- /- mus og dem i den Nozaki undersøgelsen er, at Kcne2
- /- mus er hypergastrinæmiske, ikke gastrin-mangelfuld. En anden forskel er, at DMP-777 forstyrrer en gastrisk tubulovesicle proton gradient uden at forringe H + K + - ATPase-funktion, mens målrettet Kcne2
forstyrrelser forhindrer H + /K + -ATPase funktion ved at fjerne dens luminal substrat, K + -ioner [7], [44]. Måske sidstnævnte mekanisme kan i fremtiden afsløre fingerpeg om de kritiske begivenheder i oxyntic atrofi, der resulterer i SPEM: Det er i øjeblikket foreslået, at Spem induktion skyldes en mangel i parietale celle-udskilte regulatorer af normal maveslimhinden fornyelse, som omfatter sonisk pindsvin og TGF-α [46], [47] på grund af tab af parietalcellerne. Yderligere undersøgelser af Kcne2
- /- parietalcellerne - som stadig er til stede, men funktionsfejl - kan afsløre regulatorer, som de stadig kan udskiller, og dem, som de ikke kan</sup>

maveslimhinden. af Kcne2
<sup>- /- mus viser også forøget ekspression af det etablerede proliferationsmarkør Ki67, manifesteret som en stigning i bredden af ​​det mucosale proliferative band, og som Ki67-positive celler, der beklæder cyster i regioner af GCP. Tilsvarende de-differentiering markør CK7, ikke er udtrykt i en-årige Kcne2
+ /+ maveslimhinden, blev udbredt til udtryk i den af ​​ Kcne2
- /- mus. Tager disse og markørerne er beskrevet ovenfor sammen, Kcne2
- /- gastrisk mucosa udstiller metaplasi med flere funktioner i preneoplasia, og i nogle tilfælde neoplasi, især i en SPF-frit miljø uden tegn af gastrisk Helicobacter
infektion eller oxyntic atrofi, og i mangel af kemiske inhibitorer af gastrisk forsuring. Sammen med konstateringen her at parietalcellen KCNE2 udtryk synes at blive reduceret i human gastrisk cancer væv (figur 4), og den forrige rapport, at KCNE2 hæmmer mavekræft celledeling [12], de data tyder KCNE2 forstyrrelser er forbundet med mavekræft progression. Fremtidige undersøgelser vil involvere undersøge, om Kcne2
forstyrrelser øger disposition til mavekræft inden patogene og kræftfremkaldende-baserede protokoller, mekanismerne bag disse mulige forskelle, og de potentielle mekanistiske forbindelser mellem Kcne2
, cyclin D1 og cellecyklus forstyrrelse uden for rammerne af aklorhydri-associeret sygdom ætiologi. Som KCNQ1 og KCNE2 også co-udtrykkes i skjoldbruskkirtlen epitelceller, hvor de er vigtige for thyreoideahormon biosyntese [48], vil det være af interesse at undersøge en potentiel rolle for KCNE2 i unormal thyrocyte spredning.</sup>

Materialer og metoder

Generation og brug af gen-målrettede mus

Alle mus, der er beskrevet i denne undersøgelse blev opstaldet, udnyttet og aflives i henhold til NIH og Cornell University Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer. Alle mus, der er beskrevet i denne undersøgelse blev opstaldet, udnyttet og aflives i henhold til NIH og Weill Medical College Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer. Etisk godkendelse til at avle og høst væv fra vildtype og Kcne2
<sup>- /- mus for biomedicinsk forskning blev godkendt af Weill Medical College Institutional Animal Care og brug Udvalg (protokol 0704-610A). Kcne2
- /- mus blev genereret som tidligere beskrevet fra C57BL /6 Kcne2 + /
- x Kcne2 +/-
kors [7]. Numeriske data blev analyseret med Excel software (Microsoft) ved hjælp af envejs variansanalyse (ANOVA) med statistisk signifikans sat til P
. ≪ 0,05</sup>

Histologi

For histologi og mave masse kvantificering, Kcne2 <sup>+ /+
Kcne2
- /- mus ved 3 uger, 3 måneder og 12-15 måneder blev ofret ved hjælp af CO _{2 kvælning (5-10 pr genotype). Maver blev fjernet post mortem, mave massen, så maven væv blev fikseret i 10% neutral bufferet formalin, behandles af rutinemæssige metoder og indlejret i paraffinvoks. Maveslimhinden sektioner blev skåret ved 5 um intervaller, placeret på positivt ladede SuperFrost dias, farvet med hematoxylin og eosin (H &E)., Og evalueres med et Olympus BX45 mikroskop}</sup>

Immunhistokemi

immunohistokemisk detektion af Ki67, CK-7 og TFF2 (også kendt som spasmolytisk peptid) blev udført under anvendelse af en Discovery XT processor (Ventana Medical Systems). Det primære antistof anvendte koncentrationer var: 0,05 mg /ml (kanin polyklonale anti-Ki67, Vector Labs); 1 ug /ml (monoklonalt muse-anti-CK-7; Abcam); 1 ug /ml (monoklonalt muse-anti-TFF2; Abcam). Foregående primære antistof inkubation blev vævssnit blokeret i 30 minutter i 10% normalt gedeserum, 2% BSA i PBS (anti-Ki67); 30 minutter i 10% normalt gedeserum, 2% BSA i PBS og avidin /biotin i 8 minutter (anti-CK-7); 30 minutter i 10% normalt gedeserum, 2% BSA i PBS og avidin /biotin i 4 min (anti-TFF2). Primært antistof inkubationstider var: 3 timer (Ki67 og CK-7); 5 timer (anti-TFF2). Sekundære antistofinkubationer var: 32 min i 1:200 biotinyleret gede anti-kanin IgG (Vector Labs) for Ki67; 60 min i 1:200 biotinyleret heste-anti-muse-IgG (Vector Labs) for CK-7 og TFF2. For Ki67 sekundært antistof inkubation blev Blocker D, Streptavidin-HRP og DAB detektion kit (Ventana Medical Systems) anvendt ifølge producentens anvisninger. Til CK-7 og TFF2, muse IgG1 (5 ug /ml) blev anvendt som en isotype negativ kontrol, og Blocker D, Streptavidin-HRP og DAB detektion kit (Ventana Medical Systems) blev anvendt.

I cyklin D1 detektion blev mave slides opvarmet ved 58-60 ° C i 30 minutter og derefter afparaffineres. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved at inkubere sektioner i 1% hydrogenperoxid i PBS i 15 minutter (8,3 ml 30% H _{2O 2 /241,7 ml PBS) efterfulgt af demaskering af den antigene epitop ved mikrobølgeopvarmning i 10 mM citrat buffer ved høj effekt i 15 min. Objektglas blev afkølet i 20 min, vasket i destilleret vand i 5 minutter, overført til PBS og inkuberet i 10% normalt hesteserum (i 2% BSA-PBS fortyndingsmiddel) i 30 minutter i et fugtigt kammer. Muse monoklonalt anti-cyclin D1-antistof (Cell Signaling) blev tilsat ved 1:1000 med 2% BSA i PBS og inkuberet natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Objektglas blev skyllet i PBS, og sekundært biotinyleret heste-anti-muse-IgG-antistof (Vector Labs) blev påført ved 1:500 i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev vasket og et avidin-biotin kompleks (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Labs) fortyndet ved 1:25 i PBS blev påført i 30 min. Signalet blev detekteret ved inkubation i 3,3-diaminobenzidin (Sigma, batch nr 026K3767), indtil den ønskede farveintensitet blev nået. Efter afsluttende vaske i vand, blev slides let modfarvet i hematoxylin. KCNQ1 og HKA β enkelt mærkning og påvisning blev udført som tidligere beskrevet [7]. CD34-påvisning skete med 1:50 anti-CD34-antistof (ABCAM). Slides blev set med et Nikon Eclipse E600 mikroskop og fotograferet ved hjælp af en RT Farve Kamera og SPOT-software (Diagnostiske Instrumenter, Inc.).}

Immunofluorescens

Alt humant væv blev opnået fra Prosci, Poway, CA, og blev certificeret som stammende fra kvalificerede og godkendte patologi tjenester, hjælp passende tilpasset samtykke til brug i biomedicinsk forskning og med donor anonymitet beskyttelse; Derfor blev yderligere Weill Medical College Institutional Review Board etik godkendelse ikke påkrævet. Immunofluorescens påvisning af hka β, KCNQ1 og KCNE2 i humant gastrisk væv (Prosci) blev udført ved hjælp af en Discovery XT processor (Ventana Medical Systems). Følgende humane væv blev anvendt: normal mave væv fra en 50-årig kvinde (PSC-10-809-XB1); gastrisk karcinom væv, patientinformation utilgængelig (PSC-10-814-CA1); gastrisk adenocarcinom væv fra en 51-årig kvinde (PSC-10-809-XA1). Det primære antistof anvendte koncentrationer var: 0,5 mg /ml anti- hka β (mus monoklonale, Affinity bioreagenser), 1 mg /ml anti-KCNQ1 (kanin eller ged polyklonale, Chemicon), og in-house anti-KCNE2 serum blev anvendt ved en 1:500 fortynding efter kolonne-berigende IgG. Forud for den primære antistof inkubering blev vævssnittene blokeret i 30 minutter i 10% normalt gedeserum, 2% BSA i PBS efterfulgt af 8 min Avidin /biotin blok. Det primære antistof inkubering (3 timer) blev efterfulgt af 32 minutters inkubation med biotinyleret anti-mus IgG (ABC kit fra Vector Labs), 60 min inkubation med biotinyleret anti-gede-IgG (ABC kit fra Vector Labs), eller biotinyleret anti-kanin antistof ved 1:200 fortynding (Vectastain ABC kit). Den sekundære detektion blev udført med Streptavidin-HRP D (Ventana Medical Systems), efterfulgt af inkubation med Tyramide-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) eller Tyramide Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Farvede slides blev set med en Zeiss Axiovert 200 Vidvinklet mikroskop og billeder blev erhvervet ved hjælp MetaMorph software 7.1 (Molecular Devices).

Western blotting

For western blotting, gastrisk membran fraktioner blev fremstillet som beskrevet tidligere [7]. Tre maver fra 12-måneder gamle Kcne2 <sup>+ /+
Kcne2
- /- mus blev fjernet post mortem, skåret op langs curvatura ventriculi major, ryddet for ingesta og straks snap-frosset i flydende nitrogen. Maverne blev derefter homogeniseret i en buffer indeholdende 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 100 ug /ml PMSF, 1 ug /ml Nonidet P40, 0,5% SDS og 0,5% natriumorthovanadat, derefter inkuberet på is i 30 minutter og centrifugeret ved 12000 × g
i 20 min ved 4 ° C. Proteinkoncentrationen af ​​supernatanten blev målt ifølge Bradford-metoden. Totalt protein (40 ug /bane) blev fyldt i en præ-støbte tris-glycin 4-20% gel (Jule Inc, Milford, CT) og separeret ved elektroforese. Proteiner blev derefter overført til en PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA), og blokeret med 5% mælk, 0,05% Tween-20 i PBS i 12 timer ved 4 ° C på en rocker. Primær antistofinkubationer (4 timer, RT i 1% mælk, 0,05% Tween-20, PBS, 'Buffer A') var: 1:2000 anti-cyclin-D1 (Abcam); 1:5000 anti-GAPDH (Abcam). Membraner blev vasket 4 gange, 20 minutter hver med antistof inkubationsbuffer derefter inkuberet med de passende sekundære antistoffer (BioRad) fortyndet 1:10000 i Buffer A i 2 timer ved stuetemperatur derefter vasket 4 × 20 min hver med puffer A og én gang i 5 min med PBS.</sup>

• PLoS Patogener: caveolin-1 Beskytter B6129 Mus mod Helicobacter pylori Gastritis
• PLoS ONE: Epstein-Barr-virus og Helicobacter pylori-infektion er positivt forbundet med alvorlig Gastritis hos børn