Генетические и эпигенетические изменения от Netrin-1 рецепторов при раке желудка с хромосомной нестабильности

Генетические и эпигенетические изменения от Netrin-1 рецепторов при раке желудка с хромосомной нестабильности
Аннотация
фоне
гена выражения Netrin-1 зависимость рецепторов, DCC и UNC5C

, часто подавляются в многие виды рака. Мы предположили, что деактивация ДКК и UNC5C играет важную регуляторную функцию роста в желудочном онкогенеза.
Результаты
В настоящем исследовании, ряд генетических и эпигенетических анализы для DCC
и UNC5C
были выполнены в японский когорты из 98 спорадических рака желудка и соответствующих нормальных желудочных образцов слизистой оболочки. Потеря гетерозиготности (LOH) анализирует и микросателлитная нестабильность (MSI) анализ был применен для определения хромосомной нестабильности (CIN) и MSI фенотипы, соответственно. Более 5% метилирование в Справочнике DCC и UNC5C
промоторов были обнаружены в 45% (44/98) и 32% (31/98) рака желудка, соответственно, а в 9% (9/105) и 5% (5/105) нормальная слизистая оболочка желудка, соответственно. В целом, 70% (58 из 83 информативных случаев) и 51% (40 из 79 информативных случаев) от рака желудка укрывал либо LOH или аномальным метилирование в Справочнике DCC и UNC5C
генов, соответственно. В общей сложности, 77% (51 из 66 информативных случаев) от рака желудка показало кумулятивные дефекты в этих двух зависимость рецепторов и были связаны с хромосомной нестабильности. И DCC и UNC5C инактивируются в 97% CIN-положительных рака желудка и в 55% CIN-отрицательных рака желудка.
Выводы
Дефект в Netrin рецепторов является общей чертой рака желудка. ДКК
изменения проявляются на ранних стадиях, и UNC5C
изменения эскалации с прогрессированием заболевания, предполагая, что кумулятивные переделки Netrin-1 рецепторов был поздним событием в прогрессии рака желудка и подчеркивая важность этого рост регуляторным путем в желудочном канцерогенезе.
Ключевые слова
рак желудка метилирования хромосомной нестабильности DCC
UNC5C
Netrin-1 рецепторы Фон
Глобальные оценки заболеваемости раком ранга рака желудка в качестве четвертого наиболее распространенных злокачественных новообразований и второй наиболее распространенной причиной смертности от онкологических заболеваний во всем мире [1]. Рак желудка является гетерогенным заболеванием с несколькими экологическими этиологией и с альтернативными путями канцерогенеза [2, 3]. Одним из основных этиологических факторов риска развития рака желудка является хеликобактер пилори
(H. Pylori
) инфекции. Предыдущие отчеты показали скорость инфекции 93.1-100% для H. Pylori
у пациентов с раком желудка, в то время как только 1.2-2.8% лиц, инфицированных H. Pylori
развивается рак желудка [4-7].
Современные знания о молекулярных механизмах, лежащих в основе канцерогенеза желудка указывает на одну основную эпигенетическую неустойчивости пути и два основных пути генетической нестабильности [8]. Основная эпигенетическое неустойчивость путь определяется как CpG острова methylator фенотипу (CIMP), который первоначально был описан в колоректального рака, а также наблюдается в подгруппе рака желудка и который таит в критическую степень отклоняющегося гиперметилированием промотора, связанного с транскрипционным молчанием множественной опухоли гены-супрессоры [9, 10]. Два основных пути генетической нестабильности включают микроспутников нестабильности (MSI) и хромосомной нестабильности (CIN) [8]. MSI определяется как наличие ошибок репликации в простых повторяющихся последовательностей микросателлитных вызванных несоответствие ремонт (MMR) недостатков. Одним из них является синдром Линча, вызванное зародышевых мутаций в генах MMR, а другой является спорадическим MSI вызвано главным промоутером гиперметилированием в MLH1
гена [10, 11]. С другой стороны, CIN, которая характеризуется хромосомными изменениями-либо качественным или количественным, является более распространенным путь, который может включать в себя clinicopathologically и молекулярно гетерогенных опухолей [8].
Атлас генома сеть исследований рака в последнее время рак желудка делится на четыре подтипа [12]. Опухоли были впервые классифицированы по вирусом Эпштейна-Барр (ЭБВ) -positivity (9%), а затем с помощью MSI-высокий статус, в дальнейшем называется MSI-положительные (22%), а остальные опухоли были классифицированы по степени анеуплоидии в те называют genomically стабильным (20%), или те, экспонирование КИН (50%). EBV-позитивных видов рака, а также от MSI-позитивных видов рака, как известно, кластер каждый сам по себе, проявляя крайний CIMP. Различия между EBV-CIMP и MSI-ассоциированных профилей метилирования желудочный-CIMP иллюстрируются тем фактом, что все EBV-позитивных опухолей исследованные отображается CDKN2A
(p16INK4A
) промотор гиперметилирование, но не хватало MLH1
гиперметилирование характеристика MSI-ассоциированной CIMP.
Что касается CIN характеризуется изменением числа копий в хромосомах, Дэн и др. б высокого разрешения геномный анализ в профиль соматические изменения в количестве копий в панели 233 рака желудка (первичных опухолей и клеточных линий) и 98 подобранных желудочных доброкачественных тканей. Что касается широких участков хромосом, наиболее часто усиливается область входит хромосомами 1Q, 5p, 6P, 7P, 7Q, 8Q, 13q, 19p, 20p и 20q, и наиболее часто удаленные регионы включали хромосомы 3p, 4p, 4q, 5q, 6Q , 9P, 14Q, 18q и 21q [13].
Часто удаленные регионы хромосомные, как правило, характеризуется потерей гетерозиготности (LOH) и предполагают наличие генов-супрессоров опухолей [14, 15]. LOH на хромосоме 18q21 встречается в 30-71% от рака желудка [13, 16-18], и DPC4
(Smad4
) /DCC
было высказано предположение, что основными целями. DPC4
(Smad4
), ген-супрессор опухоли, проявляет частые мутации сопровождаются LOH в примерно 20% от рака поджелудочной железы [19], но никаких мутаций не было зарегистрировано в рака желудка [20]. В отличие от этого, несколько исследований были сосредоточены на ДКК
генных изменений, и его генетический /эпигенетическое статус до сих пор остается практически неизученной при раке желудка, отчасти из-за длины и сложности этого гена [21]. Интересно отметить, что недавние исследования показали, что ДКК, а также UNC5C служить зависимость рецепторов для Netrin-1, тем самым, усиливая их потенциальную роль как опухолевые супрессоры в злокачественных опухолях человека [22-25].
Рецепторы DCC распределены по длине эпителия в кишечнике, в то время как Нетрин-1 дифференциально экспрессируется, образуя градиент в желудочно-кишечном тракте [24]. Высокая концентрация Netrin-1 присутствует у раки основания, где стволовые клетки и переходные усилительных клетки находятся. В отличие от этого, низкая концентрация Нетрин-1 существует в наконечнике ворсинок, где многие клетки апоптозу и осыпание-офф. Этот градиент Нетрин-1 исследовали с использованием далее трансгенных мышей, чтобы определить, является ли Нетрин-1 отвечает за регулирование DCC-индуцированный апоптоз в эпителии кишечника [24]. В исследовании, проведенном Mazelin и соавт. показали, что Нетрин-1 избыточная экспрессия вызывает уменьшение кишечной эпителиальной гибели клеток, в то время как не наблюдалось усиление пролиферации и дифференцировки клеток. В противоположность этому, Нетрин-1-мутант новорожденных мышей обнаруживалось увеличилась гибель клеток. В совокупности эти данные подтверждают концепцию, что Нетрин-1 регулирует апоптоз посредством рецептора DCC-зависимость в кишечнике. Тем не менее, Netrin-1 вряд ли будет прямым регулятором гомеостаза кишечника, при условии, что нормальная эпителиальной организация не нарушена Netrin-1 сверхэкспрессии [24].
Подобно рецепторам DCC, другие Netrin-1 рецепторов, в том числе UNC5A, UNC5B и UNC5C, были также обнаружены в качестве предполагаемых генов-супрессоров опухолей в различных опухолей, включая рак желудка [26, 27]. В частности, наблюдалось двукратное подавление экспрессии UNC5C по сравнению с соответствующими нормальными тканями приблизительно 70% случаев рака желудка [26]. Этот регион расположен в 4q21-23, которая часто является местом удаления рака желудка и связана с эпигенетической инактивации генов, таких как метилирования промотора [26-28].
В этом исследовании мы предположили, что деактивация ДКК и UNC5C играет важную роста регуляторную функцию в желудочном онкогенеза, который мы обратились, исследуя панель желудочных линий раковых клеток и клинических образцов, взятых у больных раком желудка. При этом авторы сообщают, что большинство рака желудка показывают потерю обоих Нетрин-1 рецепторов. Мы также данные, свидетельствующие о том, что инактивацию этих рецепторов опосредован как генетических и эпигенетических механизмов. Совокупные дефекты в этих двух зависимость рецепторов в значительной степени связано с фенотипом CIN, подчеркивая важность этих новых выводов и этот рост регуляторной путь в желудочном канцерогенезе.

Результаты Характеристики больных раком желудка Каталог 98 рака желудка пациенты, у 34 больных были женского пола (35%), и 48 опухолей патологически диагностированы как дифференцированное (49%) (таблица 1). Что касается стадии TNM, 18, 29, 37 и 14 больных раком желудка были классифицированы как стадии I, II, III и IV, соответственно. Опухолевыми генетических анализов, 13 рака желудка были отнесены к категории отображения микросателлитный нестабильность (MSI; 13%). Отношение среднего LOH из 98 опухолей составила 0,24 (стандартное отклонение (SD), ± 0,3) .table 1 Характеристики больных раком желудка
Характеристика

Процент (№) завод
Возраст
Средний возраст (SD)
65,1 (11,8)
Гендер
Женский
35 (34)
Мужчина
65 (64)
гистологии
Diff
49 (48)
Undiff
51 (50)
Этап
IA /IB
18 (18)
IIA /IIB
30 (29)
IIIA /IIIB /IIIC
38 (37)
IV
14 (14)
T
Т1а /1b
14 (14)
T2
14 (14 )
T3
28 (27)
T4a /4b
44 (43)
N
N0
27 (26)
N1
35 (34 )
N2
24 (24)
N3
14 (14)
Отдаленные метастазы
Отрицательные
86 (84) Положительный

14 (14)
MSI
MSI
13 (13)
Non-MSI
87 (85)
LOH Ratio

среднее соотношение (SD)
0,24 (0,3 )
CIN
позитиве
51 (50)
Отрицательный
47 (46)
не информативен
2 (2)
KRAS

Mutant
5 (5)
Wild
95 (93)
BRAF

Mutant
0 (0)
Wild
100 (98)
PIK3CA

Mutant
4 (3)
Wild
96 (94)
H.pyroli
позитиве
71 (70)
Негативный
29 (28)
CIN фенотип был отнесен к категории путем вычисления коэффициента LOH информативных маркеров семи полиморфных последовательностей микросателлитных, независимо от 4К и 18q локусов. Когда опухоль показала отношение LOH выше 0, опухоль классифицируется как CIN-положительным. По этому критерию, 50/98 опухоли (51%) были классифицированы как CIN-положительным.
Прямое секвенирование образцов рака желудка показало, доля KRAS
, BRAF
и PIK3CA
мутаций (табл 1). Мутации были обнаружены в KRAS
кодон 12 (5%, N
= 5/98) и кодон 13 (1%, N
= 1/98); BRAF
кодон 600 (0%, N
= 0/98); PIK3CA
кодон 545 (1%, N
= 1/98); и кодоном 1047 (3%, N
= 3/98). KRAS
кодон 12 мутации состояли из G12D (35G А, N
= 4) и G12R (34G на C, N
= 1), и кодон 13 мутации включали G13D (38G к A, N
= 1). Интересно, что одна опухоль отображается как KRAS
кодонов 12 и 13 мутаций (дополнительный файл 1: Рисунок S1a). PIK3CA
экзон 9 мутации составили E545K (1633G А, N
= 1), в то время как экзон 20 мутаций составила H1047R (3140A к G, N
= 3). Кроме того, мы определили статус инфекции H.pylori,
путем восстановления CaGa
генотип (дополнительный файл 1: Рисунок s1b). С помощью этого анализа, мы могли бы восстановить в CaGa
последовательность из 70 раковых тканей желудка (71%).
Статус метилирования DCC
в желудочном образцов рака и ассоциации с клинико-патологическими особенностями
Мы исследовали DCC <бр> статус метилирования в 98 рака желудка и 105 нормальных желудка образцов слизистой оболочки. Местонахождение ДКК
гена и результаты панели представительного комбинированного бисульфита ограничения анализа (COBRA) изображены на рис. 1а-б; Эти результаты были проанализированы в качестве непрерывных переменных (рис. 1в). Мы обнаружили, что 56/98 рака желудка (57%) и 31/105 нормальные желудка образцы слизистой оболочки (29,5%) отображается более 1,0% метилирование в ДКК
промотора. Средний уровень метилирования составила 18,3% [95% доверительный интервал (ДИ), 14.5-22.2%] среди желудочных раковых тканей, которые отображали более 1,0% метилирования в ДКК
промотором и 4,9% (95% ДИ, 3.3-6.5% ) в соответствующих нормальных желудочных образцах слизистой оболочки, которые отображали более 1,0% метилирования (P &
л; 0,0001, Вилкоксона /Крускала-Уоллиса;. рис 1c-D). Таким образом, мы определили КЦЦС
метилирование 5% или более в качестве непрерывной переменной (т.е. > 5,0% метилирования определяли как метилирование-положительным (метилированный) и &ЛТ; 5,0% метилирования как метилирование-отрицательных (неметилированным)) , Используя этот критерий, мы наблюдали ДКК
метилированных случаи 44/98 рака желудка (45%) и в 9/105 нормальной слизистой оболочки желудка (9%). Инжир. 1 DCC
промотор метилирование и 18q LOH анализ. (А) Схематическое представление о местонахождении трех лох зондов и ДСС
промотора гена в хромосоме областей 18. красная линия
обозначает КСД
ген. Серый
и черные квадраты
представляют непереведённые и экзона кодирование 1 областей, соответственно; Стрелки на площадях
указывают на транскрипционных стартовых площадок; вертикальные линии
указывают на сайты CpG; белые бриллианты
представляют сайты рестрикции для HhaI; толстые горизонтальные линии
изображающие места кобры продукции; Стрелки на толстых горизонтальных линий изображения обозначают COBRA праймеров. (Б) Представитель результаты COBRA ДКК. Стрелки указывают
метилированных аллели; M
обозначает метилирование; U
обозначает unmethylation; Mc
обозначает денатурат контроль; SM
обозначает маркер размера. (с) Результаты ДКК
метилирования в качестве непрерывной переменной. В поле участка диаграммы, горизонтальная линия изображения внутри каждой коробки представляет собой медиану, пределы
каждой коробки представляют собой диапазоны межквартильный и усов
являются максимальными и минимальными значениями. Каждая зеленая полоса
представляет собой среднее значение. NM
обозначает нормальную слизистую оболочку. T
обозначает опухоль. (D) Частота метилирования-позитивности рака и нормальных тканей в соответствии с различными порогами. (Е) ДКК
уровни экспрессии мРНК и статус метилирования в 10 желудка линий раковых клеток и человеческой клеточной линией фибробластов легких. DCC
экспрессия мРНК наблюдается (нижняя) Δ CТ в клеточных линиях GCIY и NHLH. DW обозначает дистиллированная вода
Далее, мы исследовали связь между ДКК
метилирования промоторов и различных клинико-патологическими и генетических особенностей. ДКК
статус метилирования был в значительной степени связано со статусом MSI. MSI-позитивных видов рака желудка значительно чаще ассоциируется с ДКК
метилирования, чем с ДКК
unmethylation (23 против 6%, P = 0,013
; таблица 2). Там не было никаких существенных ассоциаций между ДКК
статуса метилирования и любой другой variables.Table 2 ассоциации между эпигенетических /генетических изменений гена DCC и клинико-патологическими особенностями рака желудка в

DCC
Метилирование% (СТАТУС Нет.)

18q LOH% СТАТУС (№)

ДКК
Переделка% СТАТУС (№)

Unmethylation

Метилирование

P


Не информативно

Негативный

позитиве

P


Не информативно

Негативный

Позитивный

Позитивный

P


Total

метилирования в одиночку
<бр> одиночку LOH

Оба

(п
= 54)

(п
= 44)

(п
= 15)

(п
= 47)

(п
= 36)

(п
= 15)
<бр> (п
= 25)

(п
= 58)

(п
= 22)

(п = 19
)

(п
= 17)

Возраст
Средний возраст (SD)
63,6 (12.5)
67,0 (10,7)
0.48a
68,9 (11,4)
64,8 (11,4)
63,9 (12,4)
0.76a
68,9 (11,4)
63,5 (12,9)
64.8 (11.3)
66,3 (9.5)
60,7 (12,7)
67,4 (11,4)
0.98a
Гендер
Женский
39 (21) 30
(13)
0.33b
40 (6) 38
(18)
28 (10)
0.32b
40 (6)
44 (11) 29
(17) 32
(7)
32 (6)
24 (4)
0.19b
Мужчина
61 (23) 70
(31)
60 (9)
62 (29) 72
(26)
60 (9) 56
(14)
71 (41) 68
(15)
68 (13) 76
(13)
гистологии
Diff
41 (22)
59 (26)
0.071b
47 (7)
55 (26) 42
(15 )
0.22b
47 (7)
52 (13) 48
(28)
59 (13) 32
(6)
53 (9) <бр> 076b
Undiff
59 (32)
41 (18) 53
(8)
45 (21) 58
(21)
53 (8) <бр> 48 (12)
52 (30) 41
(9)
68 (13) 47
(8)
Этап
IA /IB
20 (11)
16 (7)
0.83b
13 (2)
19 (9) 19
(7)
0.15b
13 (2)
24 ( 6)
17 (10)
14 (3)
21 (4)
18 (3)
0.70b
IIA /IIB
26 (14) <бр> 34 (15) 27
(4)
30 (14)
31 (11)
27 (4)
24 (6)
33 (19)
36 (8) 32
(6)
29 (5)
IIIA /IIIB /IIC
39 (21) 36
(16)
53 (8)
43 (20) 25
(9)
53 (8) 40
(10)
33 (19) 45
(10)
26 (5) 24
(4)
IV
15 (8) 14
(6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4) 29
(5)
T
t1a /1b
15 (8 )
14 (6)
0.24b
7 (1)
17 (8)
14 (5)
0.94b
7 (1)
16 (4)
16 (9)
18 (4)
21 (4)
6 (1)
0.54b
T2
13 (7)
16 (7)
13 (2)
15 (7)
14 (5)
13 (2)
16 (4)
14 (8) 14
(3)
11 (2)
18 (3)
T3
20 (11)
36 (16) 33
(5)
28 (13)
25 (9)
33 (5)
16 (4) 31
(18)
41 (9)
16 (3)
35 (6) <бр> T4a /б
52 (28) 34
(15)
47 (7) 40
(19)
47 (17) 47
(7)
52 (13) 40
(23)
27 (6)
53 (10) 41
(7)
N
N0
30 (16) 23
(10)
0.66b
20 (3)
28 (13) 28
(10)
0.29b
20 (3)
32 (8) <бр> 26 (15)
23 (5) 32
(6)
24 (4)
0.19b
N1
37 (20) 32
(14)
47 (7) 38
(18)
25 (9)
47 (7)
44 (11)
28 (16) 32
(7) <бр> 26 (5)
24 (4)
N2
20 (11) 30
(13)
20 (3)
26 (12) 25
(9 )
20 (3) 20
(5)
28 (16) 32
(7)
21 (4)
29 (5)
N3
13 (7) 16
(7)
13 (2)
9 (4)
22 (8)
13 (2)
4 (1) 19
(11)
14 (3)
21 (4)
24 (4)
Отдаленные метастазы
Отрицательные
85 (46) 86
(38)
0.87b
93 (14) 91
(43)
75 (27)
0.041b
93 (14) 88
(22)
83 (48)
95 (21) 79
(15)
71 (12)
0.55b
Положительный
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
MSI статус
MSI
6 (3)
23 (10)
0.013b ​​
33 (5)
9 (4) <бр> 11 (4)
0.69b
33 (5)
4 (1)
12 (7)
14 (3)
0 (0)
24 ( 4)
0.25b
Non-MSI
94 (51) 77
(34)
67 (10) 91
(43)
89 (32) <бр> 67 (10) 96
(24)
88 (51) 86
(19)
100 (19) 76
соотношение ЛОХ (13) завод
Среднее соотношение (SD)
0,23 (0,30)
0,26 (0,31)
0.55A
0,22 (0,29)
0,10 (0,15)
0,44 (0,36)
&л; 0,0001а
0,22 (0,29)
0,05 (0,10)
0,33 (0,33)
0,16 (0,18)
0,44 (0,34)
0,44 (0,39)
&л; 0,0001а
CIN *
Положительный
46 (25) 57
(25)
0.39b
47 (7) 38
(18)
74 (25) <бр> 0.0017b
47 (7)
24 (6)
66 (37) 55
(12)
76 (13) 71
(12)
0.0005b
Отрицательный
54 (27) 43
(19)
53 (8) 62
(29)
26 (9)
53 (8) 76
(19)
34 (19) 45
(10)
24 (4)
29 (5)
KRAS
/BRAF
/PIK3CA
<бр> Mutant
6 (3)
11 (5)
0.30b
27 (4)
6 (3)
3 (1)
0.45b
27 (4)
4 (1)
5 (3)
9 (2)
5 (1)
0 (0)
0.82b
Wild <бр> 94 (51) 89
(38)
73 (11) 94
(44)
97 (35) 73
(11)
96 (24)
95 (55) 91
(20)
95 (18)
100 (17)
H.pyroli
Положительный
72 (39) 70
(31)
0.85b
80 (12) 66
(31)
75 (27)
0.37b
80 (12) 60
(15)
74 (43 )
73 (16) 79
(15)
71 (12)
0.20b
Отрицательный
28 (15) 30
(13)
20 ( 3)
34 (16) 25
(9)
20 (3)
40 (10) 26
(15)
27 (6) 21
(4 )
29 (5)
* Два случая не информативны КИН статуса
значение P
рассчитывались между unmethylation и метилирования, 18qLOH негатива и позитива, и ДСС изменения отрицательного и положительного (всего) испытатель
значения
B P Вилкоксона /Крускала-Уоллиса рассчитывались между unmethylation и метилирования, 18qLOH отрицательным и положительным, и DCC изменения отрицательного и положительного (всего) с помощью критерия хи-квадрат Piason профиль

• Семейная история рака и гастроэзофагеальной расстройств и риск рака пищевода и желудка аденокарциномы: случ…
• Дважды дуга объемная модулированный терапия улучшает распределение дозы по сравнению с статической козлово…