Genetiske og epigenetiske ændringer af netrin-1-receptorer i gastrisk cancer med kromosomal ustabilitet

Genetiske og epigenetiske ændringer af netrin-1-receptorer i mavekræft med kromosomal ustabilitet
Abstract
Baggrund
Den gen udtryk for netrin-1 afhængighed receptorer, DCC
og UNC5C
, ofte nedreguleres i mange cancertyper. Vi antager, at nedregulering af DCC og UNC5C har en vigtig vækst regulerende funktion i gastrisk tumorigenese.
Resultater
I den foreliggende undersøgelse, en række genetiske og epigenetiske analyser for DCC
UNC5C
blev udført i en japansk kohorte af 98 sporadiske gastriske cancere og tilsvarende normale gastriske mucosa-prøver. Tab af heterozygositet (LOH) analyser og mikrosatellit instabilitet (MSI) analyse blev anvendt til at bestemme kromosomal instabilitet (CIN) og MSI fænotyper hhv. Mere end 5% methylering i DCC
og UNC5C
promotorer blev fundet i 45% (44/98) og 32% (31/98) gastriske cancere, henholdsvis og i 9% (9/105) og 5% (5/105) normal gastrisk mucosa, hhv. Samlet set 70% (58 af 83 informative tilfælde) og 51% (40 af 79 informative tilfælde) af gastrisk kræft nærede enten LOH eller afvigende methylering i DCC
og UNC5C
gener hhv. I alt 77% (51 ud af 66 informative tilfælde) af gastriske cancere viste kumulative defekter i disse to afhængighed receptorer og var signifikant associeret med kromosomale ustabilitet. Både DCC og UNC5C blev inaktiveret i 97% af CIN-positive gastriske cancere og i 55% af CIN-negative gastriske cancere.
Konklusioner Salg Fejl i netrin receptorer er et fælles træk i gastriske cancere. DCC
ændringer er synlige i de tidlige stadier, og UNC5C
ændringer eskalere med progression af sygdommen, hvilket tyder på, at de kumulative ændringer i netrin-1-receptorer var en sen begivenhed i mavekræft progression og understreger vigtigheden af ​​dette vækst regulatoriske vej i gastrisk carcinogenese.
Nøgleord
mavekræft Methylering Kromosomal ustabilitet DCC
UNC5C
netrin-1-receptorer Baggrund
Globale estimater af kræfttilfælde rang mavekræft som den fjerde mest almindelige malignitet og den næsthyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Gastrisk cancer er en heterogen sygdom med flere miljømæssige ætiologier og alternative veje af carcinogenese [2, 3]. En af de store ætiologiske risikofaktorer for mavekræft er Helicobacter pylori
(H. pylori
) infektion. Tidligere rapporter indikerede en infektion sats 93,1-100% for H. pylori
hos patienter med mavekræft, mens kun 1,2-2,8% af personer inficeret med H. pylori
udvikle mavekræft [4-7].
Aktuel viden om de molekylære mekanismer, der ligger gastrisk carcinogenese indikerer en større epigenetisk ustabilitet vej og to store genetiske ustabilitet veje [8]. Den største epigenetisk ustabilitet pathway defineres som CpG island methylator fænotype (CIMP), som oprindeligt blev beskrevet i kolorektal cancer og også observeret i en delmængde af gastriske cancere og som huser et kritisk grad af afvigende promotor hypermethylering forbundet med transkriptionel inaktivering af multipel tumor suppressorgenerne [9, 10]. De to store genetisk ustabilitet veje indbefatter mikrosatellit instabilitet (MSI) og kromosomal ustabilitet (CIN) [8]. MSI defineres som tilstedeværelse af replikering fejl i simple repetitive mikrosatellit-sekvenser som følge af mismatch reparation (MMR) mangler. Den ene er Lynch syndrom forårsaget af germlinie mutationer i MMR-gener og en anden er sporadisk MSI primært forårsaget af promotor hypermethylering i MLH1
genet [10, 11]. På den anden side, CIN, der er kendetegnet ved kromosomale ændringer-enten kvalitativ eller kvantitativ-er en mere almindelig vej, der kan omfatte clinicopathologically og molekylært heterogene tumorer [8].
Cancer Genome Atlas Research Network nylig opdelt gastriske cancere i fire undertyper [12]. Tumorer blev først kategoriseret efter Epstein-Barr virus (EBV) -positivity (9%), derefter ved MSI-høj status, herefter kaldet MSI-positive (22%), og de resterende tumorer blev klassificeret af graden af ​​aneuploidi i dem betegnet genomisk stabil (20%) eller patienter, der udviser CIN (50%). EBV-positive kræftformer samt MSI-positive kræftformer var kendt for at klynge hver på sin egen, udstiller ekstreme CIMP. Forskelle mellem EBV-CIMP og MSI-associerede gastriske-CIMP methylering profiler er eksemplificeret ved den kendsgerning, at alle EBV-positive tumorer analyseret vises CDKN2A
(p16INK4a
) promoter hypermethylering men manglede MLH1
hypermethylering karakteristisk for MSI-associerede CIMP.
med hensyn til CIN præget af kopi nummer ændringer i kromosomer, Deng et al. brugte høj opløsning genomisk analyse til profil somatiske kopital ændringer i et panel af 233 gastriske cancere (primære tumorer og cellelinier) og 98 matchede gastriske ikke-maligne væv. Med hensyn til brede kromosomale regioner, de oftest forstærket region inkluderet kromosomer 1q, 5p, 6p, 7p, 7q, 8Q, 13q, 19p, 20p og 20Q, og de hyppigst slettet regioner inkluderet kromosomer 3p, 4p, 4q, 5q, 6Q , 9p, 14q, 18q, og 21q [13].
Ofte slettede kromosomale regioner er sædvanligvis kendetegnet ved tab af heterozygositet (LOH) og foreslå tilstedeværelsen af ​​tumorsuppressorgener [14, 15]. LOH på kromosom 18q21 er fundet i 30-71% af gastrisk kræft [13, 16-18], og DPC4
(Smad4
) /DCC
er blevet postuleret at være de store mål. DPC4
(Smad4
), et tumorsuppressorgen, udviser hyppige mutationer ledsaget af LOH hos ca. 20% af pancreascancer [19], men ingen mutationer er blevet rapporteret i gastriske cancere [20]. I modsætning hertil har få studier fokuseret på DCC
genændringer, og dens genetiske /epigenetisk status stadig stort set uudforsket gastrisk kræft, dels på grund af længden og kompleksiteten af ​​dette gen [21]. Interessant nok har nylige undersøgelser vist, at DCC samt UNC5C tjene som afhængighed receptorer for netrin-1, således, styrke deres potentielle rolle som tumor-undertrykkere i humane cancere [22-25].
DCC-receptorer er fordelt langs længden af epitelet i tarmen, hvorimod netrin-1 udtrykkes differentielt, danner en gradient i mave-tarmkanalen [24]. En høj koncentration af netrin-1 er til stede ved krypt basen hvor stamceller og forbigående forstærkende celler bor. Derimod kan en lav koncentration af netrin-1 findes på spidsen af ​​villi, hvor mange celler undergår apoptose og hamskifte-off. Denne netrin-1-gradient blev undersøgt yderligere under anvendelse af transgene mus for at bestemme om netrin-1 er ansvarlig for at regulere DCC-induceret apoptose i tarmepitelet [24]. Undersøgelsen fra Mazelin et al. indikerede, at netrin-1 overekspression forårsagede en reduktion i den intestinale epitelcelle død, mens der ikke blev observeret nogen stigning i proliferation og differentiering af celler. Derimod udviste netrin-1-mutant nyfødte mus forøget celledød. Tilsammen disse data understøtter det koncept, at netrin-1 regulerer apoptose via DCC-afhængighed receptor i tarmen. Imidlertid netrin-1 vil sandsynligvis ikke være en direkte regulator af intestinal homeostase, eftersom normale epitel organisation ikke bliver afbrudt af netrin-1 overekspression [24].
Svarende til DCC-receptorer, andre netrin-1-receptorer, herunder UNC5A, UNC5B, og UNC5C, blev også opdaget som formodede tumorsuppressorgener i forskellige tumorer, herunder gastrisk cancer [26, 27]. Især blev en dobbelt nedregulering af UNC5C ekspression sammenlignet med de tilsvarende normale væv observeret hos ca. 70% af gastriske cancertilfælde [26]. Denne region er placeret på 4q21-23, hvilket ofte er en lokalitet af deletion i gastrisk cancer og er forbundet med epigenetisk gen inaktivering, såsom promotor methylering [26-28].
I denne undersøgelse har vi den hypotese, at nedregulering af DCC og UNC5C spiller en vigtig vækst regulerende funktion i gastrisk tumorigenese, som vi rettet ved at undersøge et panel af gastrisk kræft cellelinjer og kliniske prøver fra patienter med mavekræft. Heri rapporterer vi, at størstedelen af ​​gastriske cancere viser tab af begge netrin-1-receptorer. Vi giver også data tyder på, at inaktivering af disse receptorer medieres gennem både genetiske og epigenetiske mekanismer. Kumulative defekter i disse to afhængighed receptorer er væsentligt forbundet med CIN fænotype, understreger vigtigheden af ​​disse nye fund, og denne vækst regulatoriske vej i gastrisk carcinogenese.
Resultater
Karakteristik af mavecancerpatienter
af 98 mavekræft patienter, 34 patienter var kvinder (35%), og 48 tumorer blev patologisk diagnosticeret som differentierede (49%) (tabel 1). Med hensyn til TNM stadie, 18, 29, 37, og 14 kræftpatienter gastrisk blev klassificeret som fase I, II, III og IV, hhv. Ved tumor genetiske analyser blev 13 gastrisk kræft kategoriseret som viser mikrosatellit instabilitet (MSI, 13%). Den gennemsnitlige LOH forholdet mellem de 98 tumorer var 0,24 (standardafvigelse (SD), ± 0,3) .table 1 Karakteristik af gastrisk kræftpatienter
Karakteristisk
Procent (nr)
Age
Mean alder (SD)
65,1 (11,8)
Køn
Kvindelige
35 (34)
Male
65 (64)
Histologi
Diff
49 (48)
Undiff
51 (50)
Stage
IA /IB
18 (18)
IIA /IIB
30 (29)
IIIA /IIIB /IIIC
38 (37)
IV
14 (14)
T
T1A /1b
14 (14)
T2
14 (14 )
T3
28 (27)
T4A /4b
44 (43)
N
n0
27 (26)
N1
35 (34 )
N2
24 (24)
N3
14 (14)
Distant metastaser
Negativ
86 (84)
Positiv
14 (14)
MSI
MSI
13 (13)
Non-MSI
87 (85)
LOH Ratio
Mean Ratio (SD)
0,24 (0,3 )
CIN
Positiv
51 (50)
Negativ
47 (46)
Not informativ
2 (2)
KRAS
Mutant
5 (5)
Wild
95 (93)
BRAF
Mutant
0 (0)
Wild
100 (98)
PIK3CA
Mutant
4 (3)
Wild
96 (94)
H.pyroli
Positiv
71 (70)
Negativ
29 (28)
CIN fænotypen blev kategoriseret ved at beregne LOH forholdet mellem informative markører for de syv polymorfe mikrosatellit sekvenser, uafhængigt af 4q og 18q loci. Når en tumor viste et LOH forhold højere end 0, blev tumoren kategoriseret som CIN-positive. Ved dette kriterium blev 50/98 tumorer (51%), der er klassificeret som CIN-positive.
Direkte sekventering af mavekræft prøver afslørede andelen af ​​KRAS
, BRAF
, og PIK3CA
mutationer (tabel 1). Mutationer blev påvist i KRAS
codon 12 (5%, N
= 5/98) og codon 13 (1%, N
= 1/98); BRAF
codon 600 (0%, N
= 0/98); PIK3CA
codon 545 (1%, N
= 1/98); og codon 1047 (3%, N
= 3/98). KRAS
codon 12 mutationer bestod af G12D (35G til A, N
= 4) og G12R (34G til C, N
= 1), og kodon 13 mutationer inkluderet G13D (38G til A, N
= 1). Interessant, en tumor viste både KRAS
codon 12 og 13 mutationer (Yderligere fil 1: Figur S1A). PIK3CA
exon 9 mutationer omfattede E545K (1633G til A, N
= 1), mens exon 20 mutationer omfattede H1047R (3140A til G, N
= 3). Desuden har vi bestemt infektionen status af H. pylori
ved at genvinde den CagA
genotype (Yderligere fil 1: Figur S1B). Gennem denne analyse, kan vi inddrive CagA
sekvens fra 70 mavekræft væv (71%).
Methylering status DCC
i mavekræft prøver og samarbejde med klinisk-patologiske træk
Vi undersøgte DCC
status for methylering i 98 gastriske cancere og 105 normale gastriske mucosa-prøver. Placering af DCC
genet, og resultaterne af et panel af repræsentativt kombineret bisulfit begrænsning analyser (COBRA) er afbildet i fig. 1a-b; disse resultater blev analyseret som kontinuerlige variable (Fig. 1c). Vi fandt, at 56/98 gastriske cancere (57%) og 31/105 normale maveslimhinden prøver (29,5%) fremvist mere end 1,0% methylering i DCC
promotoren. Den gennemsnitlige methylering niveau var 18,3% [95% konfidensinterval (CI), 14,5-22,2%] blandt mavekræft væv, der vises i løbet af 1,0% methylering i DCC
promotoren og 4,9% (95% CI, 3,3-6,5% ) i de tilsvarende normale maveslimhinden enheder, der vises i løbet af 1,0% methylering (P
< 0,0001, Wilcoxon /Kruskal-Wallis test. figur 1c-d). Derfor har vi defineret en DCC
methylering på 5% eller mere som en kontinuerlig variabel (dvs. > 5,0% methylering blev defineret som methylering-positive (methylerede) og < 5,0% methylering som methylering-negative (methyleret)) . Ved hjælp af dette kriterium, vi observerede DCC
denatureret sager 44/98 gastrisk kræft (45%) og i 9/105 normal gastrisk mucosa (9%). Fig. 1 DCC
promotor methylering og 18q LOH analyser. (A) Skematisk afbildning af placeringen af ​​de tre LOH prober og DCC
gen promotorregioner i kromosom 18. Den røde linje
betegner DCC
genet. Grå
sorte firkanter
repræsenterer de uoversatte og kodning exon 1-regioner, henholdsvis; pile på torve
indikerer transkriptionelle start sites; lodrette linjer
angiver CpG sites; hvide diamanter
repræsenterer restriktionssteder for Hhal; tykke vandrette linjer
skildrer placeringen af ​​COBRA produkter; pile på de tykke vandrette linjer
betegne COBRA primere. (B) Repræsentative resultater af COBRA DCC. Pile
angiver denatureret alleler; M
betegner methylering; U
betegner unmethylation; Mc
betegner den methylerede kontrol; SM
betegner størrelsen markør. (c) Resultater af DCC
methylering som en kontinuerlig variabel. I boksen plot diagrammer, den vandrette linje
inden for hver kasse repræsenterer medianen, grænserne
af hver kasse repræsenterer interkvartile intervaller, og knurhår
er den maksimale og minimale værdier. Hver grønne bar
repræsenterer middelværdien. NM
betegner normal slimhinde. T
betegner tumor. (D) Hyppigheden af ​​methylering-positivitet af kræft og normale væv efter forskellige tærskler. (E) DCC
mRNA ekspressionsniveauer og status for methylering i 10 gastriske cancercellelinier og en human lunge fibroblastcellelinie. DCC
mRNA-ekspression observeres (lavere ACt) i GCIY og NHLH cellelinier. DW betegner destilleret vand
Dernæst undersøgte vi sammenhængen mellem DCC
promotor methylering og forskellige klinisk-patologiske og genetiske anlæg. DCC
status methylering var signifikant associeret med MSI-status. MSI-positive gastriske cancere blev signifikant hyppigere forbundet med DCC
methylering end med DCC
unmethylation (23 vs. 6%, P
= 0,013; tabel 2). Der var ingen signifikante sammenhænge mellem DCC
methylering status og alle andre variables.Table 2 associering mellem epigenetiske /genetiske ændringer af DCC-genet og klinisk-patologiske funktioner i gastrisk kræft
DCC
Methylering Status-% ( Nej.)
18q LOH Status-% (No.)
DCC
Ændring Status-% (No.)
Unmethylation
Methylering
P
Ikke informativ
Negativ
Positiv
P
Ikke informativ
Negativ
Positiv
Positiv
P
Total
Methylering alene

LOH alene
Både
(n
= 54)
(n
= 44)
(n
= 15)
(n
= 47)
(n
= 36)
(n
= 15)

(n
= 25)
(n
= 58)
(n
= 22)
(n
= 19 )
(n
= 17)
alder
Mean alder (SD)
63,6 (12,5)
67,0 (10,7)
0.48a
68,9 (11,4)
64,8 (11,4)
63,9 (12,4)
0.76a
68,9 (11,4)
63,5 (12,9)
64,8 (11,3)
66,3 (9.5)
60,7 (12,7)
67,4 (11,4)
0.98a
Køn
Kvindelige
39 (21)
30 (13)
0.33b
40 (6)
38 (18)
28 (10)
0.32b
40 (6)
44 (11)
29 (17)
32 (7)
32 (6)
24 (4)
0.19b
Mand
61 (23)
70 (31)
60 (9)
62 (29)
72 (26)
60 (9)
56 (14)
71 (41)
68 (15)
68 (13)
76 (13) Histologi
Diff
41 (22)
59 (26)
0.071b
47 (7)
55 (26)
42 (15 )
0.22b
47 (7)
52 (13)
48 (28)
59 (13)
32 (6)
53 (9)
076b
Undiff
59 (32)
41 (18)
53 (8)
45 (21)
58 (21)
53 (8)
48 (12)
52 (30)
41 (9)
68 (13)
47 (8)
Stage
IA /IB
20 (11)
16 (7)
0.83b
13 (2)
19 (9)
19 (7)
0.15b
13 (2)
24 ( 6)
17 (10)
14 (3)
21 (4)
18 (3)
0.70b
IIA /IIB
26 (14)
34 (15)
27 (4)
30 (14)
31 (11)
27 (4)
24 (6)
33 (19)
36 (8)
32 (6)
29 (5)
IIIA /IIIB /IIC
39 (21)
36 (16)
53 (8)
43 (20)
25 (9)
53 (8)
40 (10)
33 (19)
45 (10)
26 (5)
24 (4)
IV
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
T
T1A /1b
15 (8 )
14 (6)
0.24b
7 (1)
17 (8)
14 (5)
0.94b
7 (1)
16 (4)
16 (9)
18 (4)
21 (4)
6 (1)
0.54b
T2
13 (7)
16 (7)
13 (2)
15 (7)
14 (5)
13 (2)
16 (4)
14 (8)
14 (3)
11 (2)
18 (3)
T3
20 (11)
36 (16)
33 (5)
28 (13)
25 (9)
33 (5)
16 (4)
31 (18)
41 (9)
16 (3)
35 (6)
T4A /b
52 (28)
34 (15)
47 (7)
40 (19)
47 (17)
47 (7)
52 (13)
40 (23)
27 (6)
53 (10)
41 (7)
N
n0
30 (16)
23 (10)
0.66b
20 (3)
28 (13)
28 (10)
0.29b
20 (3)
32 (8)
26 (15)
23 (5)
32 (6)
24 (4)
0.19b
N1
37 (20)
32 (14)
47 (7)
38 (18)
25 (9)
47 (7)
44 (11)
28 (16)
32 (7)
26 (5)
24 (4)
N2
20 (11)
30 (13)
20 (3)
26 (12)
25 (9 )
20 (3)
20 (5)
28 (16)
32 (7)
21 (4)
29 (5)
N3
13 (7)
16 (7)
13 (2)
9 (4)
22 (8)
13 (2)
4 (1)
19 (11)
14 (3)
21 (4)
24 (4)
Distant metastaser
Negativ
85 (46)
86 (38)
0.87b
93 (14)
91 (43)
75 (27)
0.041b
93 (14)
88 (22)
83 (48)
95 (21)
79 (15)
71 (12)
0.55b
Positiv
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
MSI status
MSI
6 (3)
23 (10)
0.013b ​​
33 (5)
9 (4)
11 (4)
0.69b
33 (5)
4 (1)
12 (7)
14 (3)
0 (0)
24 ( 4)
0.25b
Ikke-MSI
94 (51)
77 (34)
67 (10)
91 (43)
89 (32)
67 (10)
96 (24)
88 (51)
86 (19)
100 (19)
76 (13)
LOH forholdet
Mean forholdet (SD)
0,23 (0,30)
0,26 (0,31)
0.55a
0,22 (0,29)
0,10 (0,15)
0,44 (0,36)
< 0,0001a
0,22 (0,29)
0,05 (0,10)
0,33 (0,33)
0,16 (0,18)
0,44 (0,34)
0,44 (0,39)
< 0,0001a
CIN *
Positiv
46 (25)
57 (25)
0.39b
47 (7)
38 (18)
74 (25)
0.0017b
47 (7)
24 (6)
66 (37)
55 (12)
76 (13)
71 (12)
0.0005b
Negativ
54 (27)
43 (19)
53 (8)
62 (29)
26 (9)
53 (8)
76 (19)
34 (19)
45 (10)
24 (4)
29 (5)
KRAS-service /BRAF
/PIK3CA

Mutant
6 (3)
11 (5)
0.30b
27 (4)
6 (3)
3 (1)
0.45b
27 (4)
4 (1)
5 (3)
9 (2)
5 (1)
0 (0)
0.82b
Wild
94 (51)
89 (38)
73 (11)
94 (44)
97 (35)
73 (11)
96 (24)
95 (55)
91 (20)
95 (18)
100 (17)
H.pyroli
Positiv
72 (39)
70 (31)
0.85b
80 (12)
66 (31)
75 (27)
0.37b
80 (12)
60 (15)
74 (43 )
73 (16)
79 (15)
71 (12)
0.20b
Negativ
28 (15)
30 (13)
20 ( 3)
34 (16)
25 (9)
20 (3)
40 (10)
26 (15)
27 (6)
21 (4 )
29 (5)
* To tilfælde er ikke informative af CIN status
en P Drømmeholdet værdi blev beregnet mellem unmethylation og methylering, 18qLOH negativ og positiv, og DCC ændring negativ og positiv (i alt) ved Wilcoxon /Kruskal-Wallis test
b p
værdier blev beregnet mellem unmethylation og methylering, 18qLOH negativ og positiv, og DCC ændring negativ og positiv (i alt) af Piason s chi-square test
LOH af 18q locus forbundet med CIN fænotype i mavekræft
Blandt informative tilfælde frekvenserne af 18q LOH ved hvert mikrosatellit markør var 14/41 (24%) ved D18S35, 17/55 (31%) ved D18S69, og 21/58 (36 %) ved D18S58 (placeringen af ​​hver enkelt maskine er vist i fig. 1a). Tumorer viser LOH på alle tre, to, og kun en af ​​de tre mikrosatellitmarkører var 4 (4,8%), 9 (11%), og 23 (28%) af 83 informative tilfælde blandt 98 primære gastriske cancere, hhv. Tumorer viser LOH i mindst én af de tre mikrosatellitmarkører for 18q LOH blev kategoriseret som 18q LOH-positive. Ved dette kriterium, blev 18q LOH-positive kræftformer påvist i 36 (43%) af 83 informative tilfælde blandt 98 primære gastriske cancere (tabel 2).
Lighed med DCC
status for methylering, undersøgte vi associationer mellem 18q LOH status og forskellige klinisk-patologiske og genetiske anlæg. Blandt informative tilfælde, hyppigheden af ​​gastrisk cancer med fjerne metastaser var højere i 18q LOH-positive gastriske cancere forhold til 18q LOH-negative cancere (25 vs. 9%, P
= 0,041; tabel 2). De LOH nøgletal beregnet for de øvrige syv loci var også signifikant højere for 18q LOH-positive end for 18q LOH-negative tumorer (0,44 vs. 0,10, P
< .0001; tabel 2). Ifølge disse resultater, når en tumor viste en LOH forhold højere end 0, blev tumoren kategoriseret som CIN-positive. Endvidere CIN-positive gastriske cancere, der også var 18q LOH-positive var signifikant mere rigelig end dem, der var 18q LOH-negative (74 vs. 38%, p
= 0,0017; tabel 2). Tidligere undersøgelser har vist, at 18q tab almindeligvis observeres i kolorektale cancere, og dens frekvens er korreleret med CIN fænotype men omvendt korreleret med MSI fænotype [29, 30]. Som vores undersøgelse og en anden undersøgelse viste, blev dette fænomen også gengivet for gastrisk kræft [18].
Expression og methylering status DCC
i gastrisk cancer cellelinjer
at vurdere sammenhængen mellem DCC
udtryk status og epigenetiske ændringer i DCC
genet, undersøgte vi messenger-RNA (mRNA) -niveauer ved revers transkription kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) anvendelse af en primer sæt tidligere beskrevet [31] og undersøgt sammenhænge mellem DCC
ekspression og status CpG-methylering i DCC
promotorregionen i 10 gastriske cancercellelinier (MKN7, N87, MKN74, MKN45, NUGC-2, NUGC-3, NUGC-4, GCIY, Ogum-1, og MKN1) og en normal lunge fibroblast cellelinje (NHLF). Alle cellelinjer, bortset fra MKN74, GCIY, Ogum-1, MKN1 og NHLF celler, udviste nedsat ekspression af DCC
gentranskripter, og deres promotorer blev methyleret (fig. 1e). På den anden side, selv om tre cellelinier, N87, Ogum-1, og MKN1 viste reduceret ekspression af DCC
gentranskripter, blev DCC
promotorer i de celler ikke methyleret af COBRA. Blandt de 10 gastriske cancercellelinier, kun GCIY cellelinien udtrykte DCC
transkripter på samme niveau som NHLF celler, men dets promotor var methyleret. Når vi kategoriseret en cellelinje viser aΔC T på over 15,0 DCC
ekspression-negativ og en cellelinie med aΔC T på 15,0 eller mindre som DCC
ekspression-positive, kun GCIY cellelinje kunne kategoriseres som DCC
udtryk-positive blandt de syv gastrisk kræft cellelinjer med DCC
methylering; dette fund var statistisk ikke-signifikant.
Reduktion af DCC udtryk kræver både genetiske og epigenetiske ændringer
Dernæst undersøgte vi sammenhængen mellem DCC proteinekspression og genetiske og epigenetiske ændringer i DCC
gen i 86 gastrisk kræft prøver. Repræsentative eksempler på immunhistokemi (IHC) farvningsresultater er vist i fig. 2a-c. Vi kategoriseret tumorer i følgende tre grupper baseret på de IHC resultater analyseret som en kategorisk variabel: fuldstændigt tab af DCC-ekspression (. 8 tilfælde, 9%, fig 2a), fokal tab DCC udtryk (38 tilfælde, 44%, fig. 2b), og positivt DCC-proteinekspression (40 tilfælde, 47%;. figur 2c). Blandt 86 gastrisk kræft, 46 tilfælde (53%), der vises reduceret DCC udtryk. En tidligere undersøgelse rapporterede, at reduceret DCC ekspression blev observeret i alt 38% af gastrisk kræft, og scene T1-T2 tumorer opretholdt en positiv DCC udtryk, mens det blev afskaffet i T3 tumorer [32]. Dette fund var også reproducerbar i denne undersøgelse (Yderligere fil 2: Figur S2). Fig. 2 DCC
promotor methylering og immunhistokemi analyser. Immunhistokemi analyse for DCC
(a-c). Kerner af tumorceller er helt negativt (a), fokalt negativt (b), og positivt (c) farves. (D) associering mellem epigenetisk /genetisk ændring og DCC
udtryk
Dernæst undersøgte vi sammenhængen mellem genetiske og epigenetiske ændringer og DCC udtryk status. Syv af 8 tilfælde med komplet tab, 33 af 38 tilfælde med omdrejningspunkt tab, og 34 af 40 tilfælde med positiv DCC udtryk var informativt for både DCC
promotor methylering og 18q LOH. Vi fandt, at blandt de kræftformer med fuldstændigt tab af DCC-ekspression, 5/7 cancere (71%) viste begge DCC
promotor methylering og 18q LOH. I modsætning hertil 8/33 cancere (24%) viste fokal tab af DCC ekspression og både methylering og LOH, 5/33 cancere (15%) viste LOH alene og 12/33 cancere (36%) viste methylering alene. Blandt de kræftformer, der var positive for DCC-ekspression kun 2/34 cancere (6%) demonstrerede både methylering og LOH, 13/34 (38%) cancere Loh alene, og 8/34 cancere (24%) methylering alene (cancere viser både DCC
methylering og 18q LOH vs. de andre, P
= 0,0048, Pearsons chi-square test. figur 2d). Vore data tyder på, at en reduktion i DCC-ekspression kan kræve tætte methylering i promotoren CpG'er og LOH af 18q locus, ifølge to-hit teori [33].
Associering mellem klinisk-patologiske træk og genetiske /epigenetiske ændringer af DCC
i gastrisk cancer
Da både epigenetiske og genetiske ændringer er afgørende for DCC suppression, undersøgte vi forholdet mellem epigenetiske og genetiske ændringer i DCC
gen med forskellige klinisk-patologiske træk. Af 98 gastrisk kræft, var 15 kræftformer kategoriseret som ikke-informativ, blev 25 kræftformer kategoriseret som negative for DCC
ændringer, og 58 kræftformer blev kategoriseret som positive for DCC
ændringer. Blandt klinisk-patologiske træk, LOH ratio og CIN fænotype fordeling afveg betydeligt mellem kræft negative og positive for DCC
ændringer (tabel 2).
Blandt de 58 kræftformer med DCC
ændringer, viste 17 tumorer ændringer i både DCC
methylering og 18q LOH, 19 havde 18q LOH alene, og 22 kræftformer udstillet DCC
methylering alene. Den LOH-forholdet beregnet for de øvrige syv loci var signifikant højest i gastrisk kræft med både DCC
methylering og 18q LOH (middelværdi LOH ratio 0,44; SD ± 0,39), og i kræft med 18q LOH alene (middelværdi LOH ratio, 0,44; SD ± 0,34), mellemprodukt i kræft med DCC
methylering alene (middelværdi LOH ratio 0,16; SD ± 0,18), og lavest i kræft negative for DCC
ændringer (middelværdi LOH forholdet, 0,05; SD ± 0,10; P
< 0,0001, Wilcoxon /Kruskal-Wallis test). Når vi kategoriseret gastrisk kræft med LOH nøgletal højere end 0 som CIN-positive, 12/17 gastrisk kræft (71%) med både DCC
methylering og 18q LOH, 13/17 gastrisk kræft (76%) med 18q LOH alene, Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Familie historie af kræft og gastroesophagale lidelser og risikoen for esophageal og gastriske adenokarcinomer: en case-kontrol study
• Dobbelt-bue volumetrisk moduleret terapi forbedrer dosis fordeling i forhold til statisk gantry IMRT og 3D konform strålebehandling til adjuverende behandling af gastrisk cancer