alterações genéticas e epigenéticas de netrina-1 receptores no câncer gástrico com cromossômica instability

alterações genéticas e epigenéticas de receptores netrina-1 no cancro gástrico com instabilidade cromossômica da arte abstracta
Fundo
As expressões de genes de receptores de dependência netrina-1 , DCC Comprar e UNC5C
, são frequentemente regulados negativamente em muitos tipos de câncer. Nossa hipótese é que a regulação baixa de DCC e UNC5C tem uma importante função reguladora do crescimento na tumorigênese gástrico.
Resultados
No presente estudo, uma série de genética e análise epigenética para DCC Comprar e UNC5C
foram realizados em uma coorte japonesa de 98 cânceres gástricos esporádicos e amostras da mucosa gástrica normal correspondente. Perda de heterozigosidade (LOH) analisa e análise de instabilidade de microssatélites (MSI) foi aplicado para determinar instabilidade cromossômica (CIN) e fenótipos MSI, respectivamente. Mais do que 5% de metilação na
DCC e UNC5C
promotores foram encontrados em 45% (44/98) e 32% (31/98) cancros gástricos, respectivamente, e em 9% (9/105) e 5% (5/105) mucosa gástrica normal, respectivamente. No geral, 70% (58 de 83 casos informativos) e 51% (40 de 79 casos informativos) dos cancros gástricos abrigavam quer LOH ou metilação aberrante na
DCC e UNC5C
genes, respectivamente. No total, 77% (51 de 66 casos informativos) dos cancros gástricos apresentaram defeitos cumulativos nesses dois receptores de dependência e foram significativamente associados com instabilidade cromossômica. Ambos DCC e UNC5C foram inativadas em 97% dos cancros gástricos CIN-positivos e em 55% dos cancros gástricos CIN-negativos.
Conclusões
Defeito em receptores netrina é uma característica comum em cancros gástricos. DCC
alterações são aparentes nos primeiros estágios, e UNC5C
alterações escalar com a progressão da doença, sugerindo que as alterações cumulativas de receptores netrina-1 foi um evento tardio na progressão do cancro gástrico e enfatizando a importância desta crescimento via reguladora na carcinogênese gástrica. instabilidade
Palavras-chave
gástrica câncer de metilação cromossômica DCC
UNC5C
Netrin-1 receptores fundo
estimativas globais de câncer gástrico incidência de câncer de classificar como a quarta neoplasia maligna mais comum e a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. O câncer gástrico é uma doença heterogênea, com múltiplas etiologias ambientais e com as vias alternativas de carcinogênese [2, 3]. Um dos principais fatores de risco etiológicos para o câncer gástrico é pylori
(pylori
H.) infecção por Helicobacter. Relatórios anteriores indicaram uma taxa de infecção 93,1-100% para H. pylori
em pacientes com câncer gástrico, enquanto apenas 1,2-2,8% dos indivíduos infectados com H. pylori
desenvolver câncer gástrico [4-7].
o conhecimento atual sobre os mecanismos moleculares subjacentes à carcinogênese gástrica indica uma importante via instabilidade epigenética e duas vias principais de instabilidade genética [8]. A principal via de instabilidade epigenética é definido como o CpG island methylator fenótipo (CIMP), que foi inicialmente descrita em cancro colo-rectal e também observado num subconjunto de cancros gástricos e que abriga um grau crítico de hipermetilação do promotor aberrante associada com o silenciamento transcricional de tumor múltiplo genes supressores de [9, 10]. As duas principais vias de instabilidade genética incluem instabilidade de microssatélites (MSI) e instabilidade cromossômica (CIN) [8]. MSI é definida como a presença de erros de replicação em sequências repetitivas microssatélites simples causadas por deficiências de reparação de incompatibilidade (MMR). Uma delas é a síndrome de Lynch causada por mutações germinativas em genes MMR e outro é esporádica MSI causada principalmente por hipermetilação promotor no MLH1
gene [10, 11]. Por outro lado, CIN, que é caracterizada por alterações cromossómicas-qualitativa ou quantitativa-é uma via mais comum que pode compreender clinicopathologically e tumores heterogéneos molecularmente [8]. O
Genome Atlas Research Cancer Network recentemente dividido em cancros gástricos quatro subtipos [12]. Os tumores foram classificados primeiro por vírus de Epstein-Barr (EBV) -positivity (9%), seguida pela MSI-elevado estatuto, daqui em diante chamado MSI-positivas (22%), e os tumores remanescentes foram classificados pelo grau de aneuploidia em aqueles denominado genomicamente estável (20%) ou aqueles exibindo CIN (50%). cancros EBV positivos, bem como cancros MSI-positivos eram conhecidos por agrupar cada um em sua própria, exibindo extrema CIMP. As diferenças entre os perfis de metilação gástrica-CIMP EBV-CIMP e MSI-associados são exemplificados pelo fato de que todos os tumores EBV positivos ensaiadas exibido CDKN2A
(p16INK4a
) hipermetilação do promotor, mas faltava a MLH1
característica hipermetilação do MSI-associado CIMP.
com relação à CIN caracterizada por alterações no número de cópias nos cromossomos, Deng et al. análise genômica de alta resolução utilizada ao perfil alterações no número de cópias somáticas em um painel de 233 cancros gástricos (tumores primários e linhas celulares) e 98 tecidos não malignos gástricas combinados. Em relação regiões cromossômicas gerais, a região mais frequentemente amplificados incluídos cromossomos 1T, 5p, 6p, 7p, 7q, 8q, 13q, 19p, 20p e 20q, e as regiões mais frequentemente excluído incluiu cromossomos 3p, 4p, 4T, 5q, 6q , 9p, 14q, 18q e 21q [13].
regiões cromossômicas excluídos frequentes são normalmente caracterizados por perda de heterozigosidade (LOH) e sugerem a presença de genes supressores de tumor [14, 15]. LOH no cromossoma 18q21 é encontrado em 30-71% dos cancros gástricos [13, 16-18], e DPC4
(Smad4
) /DCC
foram postulados como sendo os principais alvos. DPC4
(Smad4
), um gene supressor de tumor, apresenta mutações frequentes acompanhados por LOH em aproximadamente 20% dos cancros pancreáticos [19], mas não há mutações têm sido relatados em cancros gástricos [20]. Em contraste, poucos estudos têm-se centrado na DCC
alterações genéticas, e seu status genético /epigenética ainda permanece praticamente inexplorada no câncer gástrico, em parte devido à extensão e complexidade deste gene [21]. Interessantemente, os estudos recentes têm demonstrado que o DCC, bem como UNC5C servem como receptores para dependência netrina-1, e reforça assim o seu papel potencial como supressores de tumores em cancros humanos [22-25].
DCC receptores são distribuídos ao longo do comprimento do epitélio do intestino, enquanto que a netrina-1 é expresso diferencialmente, formando um gradiente dentro do tracto gastrointestinal [24]. Uma alta concentração de netrina-1 está presente na base da cripta em que as células estaminais e células transientes amplificadoras residem. Por contraste, uma baixa concentração de netrina-1 existe na ponta da vilosidade, onde muitas células estão a sofrer apoptose e descamação-off. Este gradiente de netrina-1 foi examinada ainda mais utilizando ratinhos transgénicos para determinar se a netrina-1 é responsável por regular a apoptose induzida por DCC no epitélio intestinal [24]. O estudo de Mazelin et al. indicou que a netrina-1 sobre-expressão causou uma diminuição na morte de células epiteliais intestinais, ao passo que não se observou qualquer aumento na proliferação e diferenciação de células. Em contraste, ratinhos recém-nascido netrina-1-mutante exibiram aumento da morte celular. Tomados em conjunto, estes dados apoiam o conceito de que a netrina-1 regula a apoptose através do receptor de DCC-dependência no intestino. No entanto, netrina-1 é improvável que seja um regulador directo da homeostase intestinal, dado que a organização epitelial normal não é perturbada pela netrina-1 sobre-expressão [24].
Similares aos receptores de DCC, outros receptores de netrina-1, incluindo UNC5A, UNC5B, e UNC5C, também foram descobertos como genes supressores de tumor putativos em vários tumores, incluindo cancro gástrico [26, 27]. Em particular, foi observada uma dupla regulação negativa da expressão UNC5C em comparação com os tecidos normais correspondentes em aproximadamente 70% dos casos de cancro gástrico [26]. Esta região situa-se no 4q21-23, que é frequentemente um local de eliminação no cancro gástrico e está associada com a inactivação do gene epigenético, tais como a metilação do promotor [26-28].
Neste estudo, a hipótese de que a regulação negativa de DCC e UNC5C desempenha uma importante função reguladora do crescimento na tumorigênese gástrico, que abordámos investigando um painel de linhas celulares de cancro gástrico e amostras clínicas de pacientes com câncer gástrico. Relata-se que a maioria dos cancros gástricos mostram perda de receptores de ambos os netrin-1. Nós também fornecem dados que sugerem que a inactivação destes receptores é mediada através de ambos os mecanismos genéticos e ambientais. defeitos cumulativos nesses dois receptores de dependência são significativamente associados com o fenótipo CIN, enfatizando a importância dessas novas descobertas e este crescimento via reguladora na carcinogênese gástrica.

Resultados Características dos pacientes com câncer gástrico
de câncer gástrico 98 pacientes, 34 pacientes eram do sexo feminino (35%), e 48 tumores foram diagnosticados como patologicamente diferenciado (49%) (Tabela 1). Com relação ao estágio TNM, 18, 29, 37, e 14 pacientes com câncer gástrico foram classificados como estágio I, II, III e IV, respectivamente. Por análises genéticas de tumores, 13 cânceres gástricos foram categorizadas como a indicação de instabilidade de microssatélites (MSI; 13%). A razão média LOH dos 98 tumores foi de 0,24 (desvio padrão (SD), ± 0,3) .table 1 Características dos pacientes com câncer gástrico
Característica
Percentagem (N.º)
Idade
A média de idade (DP)
65,1 (11,8)
Sexo Feminino

35 (34)
Masculino
65 (64)
Histologia
Diff
49 (48)
undiff
51 (50)
Stage
IA /IB
18 (18)
IIA /IIB
30 (29)
IIIA /IIIB /IIIC
38 (37)
IV
14 (14)
T
T1a /1b
14 (14)
T2
14 (14 )
T3
28 (27)
T4a /4b
44 (43)
N
N0
27 (26)
N1
35 (34 )
N2
24 (24)
N3
14 (14)
metástases à distância
negativo
86 (84)
positiva
14 (14)
MSI
MSI
13 (13)
não-MSI
87 (85) Rácio
LOH
A relação média (SD)
0,24 (0,3 )
CIN
positiva
51 (50)
negativo
47 (46)
Não informativo Página 2 (2)
KRAS
Mutant
5 (5)
selvagem
95 (93)
BRAF
Mutant
0 (0)
selvagem
100 (98)
PIK3CA
Mutant página 4 (3)
selvagem
96 (94)
H.pyroli
positiva
71 (70)
negativo
29 (28) CIN
fenótipo foi categorizada por cálculo da razão de LOH dos marcadores informativos das sete sequências microssatélite polimórficos, de forma independente a partir do 4q e 18Q loci. Quando um tumor mostrou uma proporção LOH superior a 0, o tumor foi classificada como CIN-positiva. Por esse critério, 50/98 tumores (51%) foram classificados como CIN-positivo.
Sequenciação directa de amostras de cancro gástrico revelou a proporção de KRAS
, BRAF
, e PIK3CA
mutações (Tabela 1). As mutações foram detectadas no KRAS
codão 12 (5%, N
= 5/98) e o codão 13 (1%, N
= 1/98); BRAF
códon 600 (0%, N
= 0/98); PIK3CA
códon 545 (1%, N
= 1/98); e codão 1047 (3%, N
= 3/98). KRAS
codão 12 mutações consistiu de G12D (35G a A, N
= 4) e G12R (34G a C, N
= 1), e o codão 13 mutações incluídos G13D (38G a A, n
= 1). Curiosamente, um tumor exibidos tanto KRAS
códon 12 e 13 mutações (arquivo adicional 1: Figura S1A). PIK3CA
exão 9 mutações E545K composto (1633G a A, N
= 1), enquanto que 20 mutações exão composto H1047R (3140A a G, N
= 3). Além disso, determinou-se o estado da infecção do H. pylori
pela recuperação do cagA
genótipo (arquivo adicionais 1: Figura S1B). Através desta análise, podemos recuperar o cagA
sequência de 70 tecidos de câncer gástrico (71%). Estatuto
metilação de DCC
em amostras de câncer gástrico e de associação com características clinicopatológicas
Nós investigados DCC
estado de metilação em 98 cancros gástricos e 105 amostras de mucosa gástrica normais. Localização do gene DCC
e os resultados de um painel de restrição bissulfito combinada representativa análises (COBRA) estão representados na fig. 1a-b; Estes resultados foram analisados ​​como variáveis ​​contínuas (Fig. 1C). Descobrimos que 56/98 cancros gástricos (57%) e 31/105 amostras de mucosa gástrica normais (29,5%) exibido mais de 1,0% de metilação no DCC
promotor. O nível médio de metilação foi de 18,3% [intervalo de confiança de 95% (CI), 14,5-22,2%] entre os tecidos com câncer gástrico que apresentavam mais de 1,0% de metilação no DCC
promotor e 4,9% (95% CI, 3,3-6,5% ) nas amostras de mucosa gástrica correspondentes normais que apresentavam mais de 1,0% de metilação (P
< 0,0001, Wilcoxon /teste de Kruskal-Wallis; a Fig. 1c-d). Por conseguinte, definiu-se um DCC
metilação de 5% ou mais como uma variável contínua (ou seja, > 5,0% de metilação foi definida como a metilação-positivo (desnaturado) e < 5,0% de metilação como metilação-negativa (não metilado)) . Usando este critério, observou-se DCC
casos metilados em 44/98 cancros gástricos (45%) e em 9/105 mucosa gástrica normal (9%). FIG. 1 analisa DCC
metilação do promotor e 18q LOH. (A) Representação esquemática da localização das três sondas LOH e DCC
regiões promotoras do gene no cromossoma 18. A linha de vermelho e indica o gene DCC
. Cinza Comprar e quadrados pretos
representam as regiões não traduzidas eo exão de codificação 1, respectivamente; setas nas praças
indicam locais de partida da transcrição; linhas verticais
indicam locais CpG; diamantes brancos
representam os sítios de restrição para HhaI; linhas horizontais grossas
retratam os locais de produtos COBRA; setas nas linhas horizontais grossas
denotam primers COBRA. (B) Os resultados representativos de COBRA de DCC. Setas
indicam alelos metilados; M
denota metilação; U
denota unmethylation; Mc
indica o controlo metilado; SM
indica o marcador de tamanho. (c) Os resultados de DCC
metilação como uma variável contínua. Nos diagramas caixa de enredo, a linha horizontal
dentro de cada caixa representa a mediana, os limites
de cada caixa representam os intervalos interquartil, e os bigodes Quais são os valores máximos e mínimos. Cada barra
verde representa a média. NM
denota mucosa normal. T
denota tumor. (D) A frequência de metilação-positividade de câncer e tecidos normais de acordo com limiares diferentes. (E) de DCC
níveis de expressão de ARNm e estado de metilação em 10 linhas celulares de cancro gástrico e uma linha celular de fibroblastos de pulmão humano. DCC
expressão de ARNm é observada (ΔCT inferior) em linhas celulares e GCIY NHLH. DW denota água destilada
Em seguida, foi investigada a associação entre DCC
metilação do promotor e várias características clínicas e genéticas. DCC
estado de metilação foi significativamente associada com o status MSI. cancros gástricos MSI-positivas foram significativamente mais frequentemente associada com DCC
metilação do que com DCC
unmethylation (23 vs. 6%, P = 0,013
; Tabela 2). Não houve associação significativa entre a DCC
estado de metilação e qualquer outro variables.Table Association 2 entre alterações epigenéticas /genéticas do gene DCC e características clínico-patológicas em cancros gástricos
DCC
metilação Status-% ( No.)
18q LOH Status-% (n.º)
DCC
Alteração Status-% (n.º)
Unmethylation
metilação
P
Não informativo
negativo
positiva
P
Não informativo
negativo
positiva
positiva
P
total
metilação sozinha

LOH sozinho
Ambos
(n
= 54)
(n
= 44)
(n
= 15)
(n
= 47)
(n
= 36)
(n
= 15)

(n
= 25)
(n
= 58)
(n
= 22)
(n = 19
)
(n
= 17)
idade
A idade média (SD)
63,6 (12,5)
67,0 (10,7)
0.48a
68,9 (11,4)
64,8 (11,4)
63,9 (12,4)
0.76a
68,9 (11,4)
63,5 (12,9)
64,8 (11,3)
66,3 (9,5)
60,7 (12,7)
67,4 (11,4)
0.98a
Sexo Feminino

39 (21)
30 (13)
0.33b
40 (6)
38 (18)
28 (10)
0.32b
40 (6)
44 (11)
29 (17)
32 (7)
32 (6)
24 (4)
0.19b
Masculino
61 (23)
70 (31)
60 (9)
62 (29)
72 (26)
60 (9)
56 (14)
71 (41)
68 (15)
68 (13)
76 (13)
Histologia
Diff
41 (22)
59 (26)
0.071b
47 (7)
55 (26)
42 (15 )
0.22b
47 (7)
52 (13)
48 (28)
59 (13)
32 (6)
53 (9)
076b
undiff
59 (32)
41 (18)
53 (8)
45 (21)
58 (21)
53 (8)
48 (12)
52 (30)
41 (9)
68 (13)
47 (8)
Stage
IA /IB
20 (11)
16 (7)
0.83b
13 (2)
19 (9)
19 (7)
0.15b
13 (2)
24 ( 6)
17 (10)
14 (3)
21 (4)
18 (3)
0.70b
IIA /IIB
26 (14)
34 (15)
27 (4)
30 (14)
31 (11)
27 (4)
24 (6)
33 (19)
36 (8)
32 (6)
29 (5)
IIIA /IIIB /IIC
39 (21)
36 (16)
53 (8)
43 (20)
25 (9)
53 (8)
40 (10)
33 (19)
45 (10)
26 (5)
24 (4)
IV
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
T
T1a /1b
15 (8 )
14 (6)
0.24b
7 (1)
17 (8)
14 (5)
0.94b
7 (1)
16 (4)
16 (9)
18 (4)
21 (4)
6 (1)
0.54b
T2
13 (7)
16 (7)
13 (2)
15 (7)
14 (5)
13 (2)
16 (4)
14 (8)
14 (3)
11 (2)
18 (3)
T3
20 (11)
36 (16)
33 (5)
28 (13)
25 (9)
33 (5)
16 (4)
31 (18)
41 (9)
16 (3)
35 (6)
T4a /b
52 (28)
34 (15)
47 (7)
40 (19)
47 (17)
47 (7)
52 (13)
40 (23)
27 (6)
53 (10)
41 (7)
N
N0
30 (16)
23 (10)
0.66b
20 (3)
28 (13)
28 (10)
0.29b
20 (3)
32 (8)
26 (15)
23 (5)
32 (6)
24 (4)
0.19b
N1
37 (20)
32 (14)
47 (7)
38 (18)
25 (9)
47 (7)
44 (11)
28 (16)
32 (7)
26 (5)
24 (4)
N2
20 (11)
30 (13)
20 (3)
26 (12)
25 (9 )
20 (3)
20 (5)
28 (16)
32 (7)
21 (4)
29 (5)
N3
13 (7)
16 (7)
13 (2)
9 (4)
22 (8)
13 (2) página 4 (1)
19 (11)
14 (3)
21 (4)
24 (4)
metástases à distância
negativo
85 (46)
86 (38)
0.87b
93 (14)
91 (43)
75 (27)
0.041b
93 (14)
88 (22)
83 (48)
95 (21)
79 (15)
71 (12)
0.55b
positiva
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
estatuto MSI
MSI
6 (3)
23 (10)
0.013b ​​
33 (5)
9 (4)
11 (4)
0.69b
33 (5) página 4 (1)
12 (7)
14 (3)
0 (0)
24 ( 4)
0.25b
não-MSI
94 (51)
77 (34)
67 (10)
91 (43)
89 (32)
67 (10)
96 (24)
88 (51)
86 (19)
100 (19)
76 rácio de LOH (13)
A relação média (SD)
0,23 (0,30)
0,26 (0,31)
0.55a
0,22 (0,29)
0,10 (0,15)
0,44 (0,36) Art < 0.0001a
0,22 (0,29)
0,05 (0,10)
0,33 (0,33)
0,16 (0,18)
0,44 (0,34)
0,44 (0,39) Art < 0.0001a
CIN *
positiva
46 (25)
57 (25)
0.39b
47 (7)
38 (18)
74 (25)
0.0017b
47 (7)
24 (6)
66 (37)
55 (12)
76 (13)
71 (12)
0.0005b
negativo
54 (27)
43 (19)
53 (8)
62 (29)
26 (9)
53 (8)
76 (19)
34 (19)
45 (10)
24 (4)
29 (5)
KRAS
/BRAF
/PIK3CA

Mutant
6 (3)
11 (5)
0.30b
27 (4)
6 (3) Sims 3 (1)
0.45b
27 (4) página 4 (1)
5 (3)
9 (2)
5 (1)
0 (0)
0.82b
selvagem
94 (51)
89 (38)
73 (11)
94 (44)
97 (35)
73 (11)
96 (24)
95 (55)
91 (20)
95 (18)
100 (17)
H.pyroli
positiva
72 (39)
70 (31)
0.85b
80 (12)
66 (31)
75 (27)
0.37b
80 (12)
60 (15)
74 (43 )
73 (16)
79 (15)
71 (12)
0.20b
negativo
28 (15)
30 (13)
20 ( 3)
34 (16)
25 (9)
20 (3)
40 (10)
26 (15)
27 (6)
21 (4 )
29 (5)
* Dois casos não são informativas do estado CIN
um valor P
foram calculadas entre unmethylation e metilação, 18qLOH negativo e positivo, e DCC alteração negativa e positiva (total) por Wilcoxon /Kruskal-Wallis
valores
b P foram calculados entre unmethylation e metilação, 18qLOH alteração negativa e positiva, e DCC negativo e positivo (total) pelo teste do qui-quadrado de Piason
LOH de 18q lócus associada a CIN fenótipo em câncer gástrico
Entre os casos informativos, as frequências de 18q LOH em cada marcador microssatélite foram 14/41 (24%) em D18S35, 17/55 (31%) em D18S69, e 21/58 (36 %) em D18S58 (a localização de cada máquina é mostrado na Fig. 1a). Os tumores que mostram LOH em todos os três, dois, e apenas um dos três marcadores microssatélites foram 4 (4,8%), 9 (11%), e 23 (28%) de 83 casos informativos entre os 98 cancros gástricos primárias, respectivamente. Os tumores que mostram LOH em pelo menos um dos três marcadores microssatélite para 18q LOH foram categorizados como 18q LOH-positiva. Por este critério, cancros 18q LOH-positivas foram detectadas em 36 (43%) de 83 casos informativos entre os 98 cancros gástricos primárias (Tabela 2). De modo semelhante ao
DCC
estado de metilação, nós investigamos associações entre 18q LOH status e várias características clínicas e genéticas. Entre os casos informativos, a frequência de câncer gástrico com metástases à distância foi maior no 18Q cancros gástricos LOH-positivos em comparação com 18Q cancros LOH-negativos (25 vs. 9%, P = 0,041
; Tabela 2). Os rácios de LOH calculados para os outros sete loci também foram significativamente maiores para 18q LOH-positivas do que para 18Q tumores LOH-negativos (0,44 vs 0,10, P
< 0001; Tabela 2). De acordo com estes resultados, quando um tumor mostrou uma proporção LOH superior a 0, o tumor foi classificada como CIN-positiva. Além disso, os cancros gástricos CIN-positivos que foram também 18q LOH-positivas foram significativamente mais abundante do que aqueles que foram 18q LOH-negativas (74 versus 38%, P = 0,0017
; Tabela 2). Estudos anteriores demonstraram que 18q perda é comumente observada em cancros colo, e sua freqüência está correlacionada com a CIN fenótipo, mas inversamente correlacionada com MSI fenótipo [29, 30]. Como o nosso estudo e outro estudo demonstrou, este fenômeno também foi reproduzida para os cancros gástricos [18].
Expressão e metilação status da DCC
em linhas celulares de cancro gástrico
Para avaliar associações entre DCC
status de expressão e alterações epigenética no gene DCC
, examinámos o ARN mensageiro (ARNm) por transcrição reversa níveis de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR-RT), utilizando um conjunto de iniciadores descrito anteriormente [31], e analisou associações entre DCC e
expressão estado de metilação de CpG em DCC e região do promotor em 10 linhas celulares de cancro gástrico (MKN7, N87, MKN74, MKN45, NUGC-2, NUGC-3, 4-NUGC, GCIY, Ogum-1, e MKN1) e normal linha de células de fibroblastos de pulmão (NHLF). Todas as linhas de células, exceto para MKN74, GCIY, OGUM-1, MKN1 e células NHLF, mostrou diminuição da expressão de DCC
transcritos do gene, e os seus promotores foram metilados (Fig. 1e). Por outro lado, embora a três linhas celulares, N87, Ogum-1, e MKN1 mostrou a diminuição da expressão de transcritos de genes
DCC, DCC
promotores nessas células não foram metilados pela Cobra. Entre as 10 linhas celulares de cancro gástrico, apenas a linha celular expressa GCIY DCC
transcritos ao mesmo nível que as células NHLF, mas o seu promotor foi metilado. Quando categorizados uma linha celular que mostra aΔC T de mais de 15,0 como DCC expressão
-negativa e de uma linha celular com aΔC T de 15,0 ou menos como DCC
-expressão positiva, apenas o GCIY linha de células poderia ser categorizada como DCC
expressão positiva entre as sete linhas celulares de cancro gástrico com DCC
metilação; este achado não foi estatisticamente significativa.
Redução de expressão DCC requer alterações tanto genéticas e epigenéticas
Em seguida, foi investigada a associação entre a expressão da proteína DCC e alterações genéticas e epigenéticas no gene DCC
em 86 cancro gástrico espécimes. Exemplos representativos de imuno-histoquímica resultados (IHC) de coloração são apresentados na Fig. 2a-c. Nós categorizados tumores em três grupos com base nos resultados IHC analisada como uma variável categórica: perda completa da expressão DCC (. 8 casos, 9%; Fig 2a), perda focal de expressão DCC (38 casos, 44%; Fig. 2b), e a expressão da proteína DCC positivo (40 casos, 47%; Fig. 2c). Entre 86 cancros gástricos, 46 casos (53%) mostraram reduzida expressão DCC. Um estudo anterior relatou que a expressão reduzida de DCC foi observada num total de 38% dos cancros gástricos, tumores e fase T1-T2 mantida uma expressão DCC positiva ao mesmo tempo que foi abolido em tumores T3 [32]. Este achado também foi reprodutível neste estudo (arquivo adicionais 2: Figura S2). FIG. 2 DCC
metilação do promotor de imuno-histoquímica e análise. A análise imuno-histoquímica para DCC
(a-c). Núcleos de células tumorais são completamente negativamente (a), focalmente negativamente (b), e positivamente (C) corado. (D) Associação entre alteração genética /epigenética e DCC
expressão
Em seguida, examinaram a associação entre alterações genéticas e epigenéticas e status expressão DCC. Sete dos 8 casos com perda total, 33 dos 38 casos de perda focal, e 34 de 40 casos com expressão DCC positiva foram informativos para ambos DCC
metilação do promotor e 18q LOH. Descobrimos que entre os cancros com perda total de expressão DCC, 5/7 cânceres (71%) demonstraram tanto DCC
metilação do promotor e 18q LOH. Em contraste, os cancros 8/33 (24%) apresentaram perda focal de expressão DCC e ambos metilação e LOH, cancros 5/33 (15%) mostraram LOH sozinho, e cancros 12/33 (36%) exibido sozinho metilação. Entre os cânceres que foram positivas para a expressão DCC, apenas 2/34 cancros (6%) demonstrou tanto metilação e LOH, 13/34 (38%) cancros Loh sozinho, e 8/34 cânceres (24%) de metilação sozinho (cânceres mostrando tanto DCC
metilação e 18q LOH contra os outros, P
= 0,0048, teste do qui-quadrado de Pearson; a Fig. 2d). Nossos dados sugerem que uma redução na expressão DCC pode exigir metilação densa nas CpGs promotoras e LOH do 18q lugar, de acordo com a teoria de dois hit [33].
Associação entre características clínicas e genéticas alterações epigenéticas /de DCC
em
câncer gástrico Desde alterações tanto epigenéticas e genéticos são essenciais para a supressão de DCC, foi investigada a relação entre epigenética e alterações genéticas no gene DCC
com várias características clínico-patológicas. De 98 cancros gástricos, 15 cânceres foram classificados como não-informativa, 25 cânceres foram classificados como negativos para DCC
alterações, e 58 cânceres foram classificados como positivos para DCC
alterações. Entre as características clinicopatológicas, o rácio de LOH e distribuição fenótipo CIN diferiu significativamente entre os cancros negativos e positivos para DCC
alterações (Tabela 2).
Entre os 58 cancros com DCC
alterações, 17 tumores apresentaram alterações em ambos DCC
metilação e 18q LOH, 19 tiveram 18q LOH sozinho, e 22 tipos de câncer exibiram DCC
metilação sozinha. A relação LOH calculado para os outros sete loci foi significativamente mais elevada em cancros gástricos com tanto DCC
metilação e 18q LOH (média LOH ratio, 0,44; SD ± 0,39) e em cancros com 18q LOH sozinho (média LOH ratio, 0,44; SD ± 0,34), intermediário em cancros com DCC
metilação sozinha (média LOH ratio, 0,16; SD ± 0,18) e menor nos cancros negativo para DCC
alterações (média LOH ratio, 0,05; SD ± 0,10; P
< 0,0001, Wilcoxon /teste de Kruskal-Wallis). FIG. FIG. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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