Las alteraciones genéticas y epigenéticas de netrina-1 receptores en el cáncer gástrico con cromosómica instability

alteraciones genéticas y epigenéticas de los receptores netrina-1 en el cáncer gástrico con inestabilidad cromosómica
Resumen Antecedentes
México La expresión de los genes de los receptores 1 netrina dependencia , DCC Opiniones y UNC5C
, con frecuencia son regulados a la baja en muchos tipos de cáncer. La hipótesis de que la regulación negativa de DCC y UNC5C tiene una función reguladora importante crecimiento en la tumorigénesis gástrico.
: Resultados de la En el presente estudio, una serie de genética y epigenética análisis para DCC Opiniones y UNC5C
se realizaron en una cohorte japonesa de 98 cánceres gástricos esporádicos y las muestras de mucosa gástrica normal correspondiente. La pérdida de heterocigosidad (LOH) analiza y se aplicó el análisis de la inestabilidad de microsatélites (MSI) para determinar la inestabilidad cromosómica (CIN) y fenotipos de MSI, respectivamente. Más de 5% de metilación en el DCC
y UNC5C
promotores se encontraron en 45% (44/98) y 32% (31/98) cánceres gástricos, respectivamente, y en 9% (9/105) y 5% (5/105) mucosa gástrica normal, respectivamente. En general, el 70% (58 de 83 casos informativos) y 51% (40 de 79 casos informativos) de los cánceres gástricos albergadas ya sea LOH o metilación aberrante en el DCC Opiniones y UNC5C
genes, respectivamente. En total, el 77% (51 de 66 casos informativos) de los cánceres gástricos mostró defectos acumulados en estos dos receptores de dependencia y se asociaron significativamente con la inestabilidad cromosómica. Tanto DCC y UNC5C fueron inactivadas en el 97% de los cánceres gástricos CIN-positivos y en el 55% de los cánceres gástricos CIN-negativos.
Conclusiones
defecto en los receptores netrina es una característica común en los cánceres gástricos. DCC
alteraciones son evidentes en las primeras etapas, y UNC5C
alteraciones aumentan con la progresión de la enfermedad, lo que sugiere que las alteraciones acumulativas de los receptores netrina-1 fue un evento tardío en la progresión del cáncer gástrico y haciendo hincapié en la importancia de este el crecimiento vía de reglamentación en la carcinogénesis gástrica. inestabilidad
Palabras clave
cáncer gástrico metilación cromosómico DCC
UNC5C
Netrina-1 receptores Antecedentes
las estimaciones globales de cáncer gástrico rango de incidencia de cáncer como el cuarto cáncer más común y la segunda causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. El cáncer gástrico es una enfermedad heterogénea con múltiples etiologías ambientales y con vías alternativas de la carcinogénesis [2, 3]. Uno de los principales factores de riesgo etiológicos para el cáncer gástrico es pylori gratis (
pylori H.) la infección por Helicobacter. Informes anteriores indicaron una tasa de infección de 93,1 a 100% para H. pylori Hoteles en pacientes con cáncer gástrico, mientras que sólo el 1.2 a 2.8% de los individuos infectados con H. pylori
desarrollar cáncer gástrico [4-7].
el conocimiento actual sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la carcinogénesis gástrica indica una importante vía de la inestabilidad epigenética y dos vías principales de inestabilidad genética [8]. La vía de la inestabilidad epigenética principal se define como la isla CpG methylator fenotipo (CIMP), que fue descrita inicialmente en el cáncer colorrectal y también observó en un subconjunto de cánceres gástricos y que alberga un grado crítico de aberrante promotor hipermetilación asociada con el silenciamiento transcripcional de tumor múltiple genes supresores de [9, 10]. Las dos vías principales de inestabilidad genética incluyen la inestabilidad de microsatélites (MSI) y la inestabilidad cromosómica (CIN) [8]. MSI se define como la presencia de errores de replicación de secuencias microsatélites simples repetitivas causadas por el desajuste de reparación de deficiencias (MMR). Una de ellas es el síndrome de Lynch causada por mutaciones germinales en los genes MMR y el otro es esporádica MSI causada principalmente por la hipermetilación del promotor en el gen MLH1
[10, 11]. Por otro lado, CIN, que se caracteriza por alteraciones cromosómicas, ya sea cualitativo o cuantitativo-es una vía más común que puede comprender clínicopatológicamente y tumores heterogéneos molecularmente [8]. Ver la Red de Investigación Atlas del Genoma del Cáncer divide recientemente cánceres gástricos en cuatro subtipos [12]. Los tumores se clasifican por primera vez por el virus de Epstein-Barr (VEB) -positivity (9%), y luego por MSI-alto estatus, de aquí en adelante llamados MSI-positivos (22%) y los tumores restantes se clasificaron según el grado de aneuploidía en los denominados genómicamente estable (20%) o los CIN exhibiendo (50%). cánceres EBV positivo, así como cánceres MSI-positivos eran conocidos a agruparse cada uno por su cuenta, que exhibe extrema CIMP. Las diferencias entre los perfiles de metilación gástrica-CIMP-MSI asociadas EBV-CIMP y se ejemplifican por el hecho de que todos los tumores EBV positivas ensayadas muestran CDKN2A gratis (p16INK4A
) hipermetilación del promotor, pero carecían de la MLH1
característica de hipermetilación MSI-CIMP asociada. Vaya con respecto al CIN se caracteriza por cambios de número de copias en los cromosomas, Deng et al. El análisis genómico usado de alta resolución al perfil alteraciones del número de copias somáticas en un panel de 233 cánceres gástricos (tumores primarios y líneas celulares) y 98 emparejados tejidos no malignos gástricos. En cuanto a las regiones cromosómicas generales, la región con mayor frecuencia amplificada incluye los cromosomas 1q, 5p, 6p, 7p, 7q, 8q, 13q, 19p, 20p y 20q, y las regiones más frecuentemente eliminada incluyó cromosomas 3p, 4p, 4q, 5q, 6q , 9p, 14q, 18q, 21q y [13].
regiones cromosómicas eliminados frecuentes se caracterizan por la pérdida de heterocigosidad (LOH) y sugieren la presencia de genes supresores de tumores [14, 15]. LOH en el cromosoma 18q21 se encuentra en 30-71% de los cánceres gástricos [13, 16-18], y DPC4 gratis (Smad4
) /DCC
se han postulado para ser los objetivos principales. DPC4 gratis (Smad4
), un gen supresor de tumores, presenta mutaciones frecuentes acompañadas de LOH en aproximadamente el 20% de los cánceres de páncreas [19], pero no hay mutaciones se han reportado en el cáncer gástrico [20]. Por el contrario, pocos estudios se han centrado en DCC
alteraciones de los genes, y su estado genético /epigenético aún permanece prácticamente sin explorar en el cáncer gástrico, en parte debido a la longitud y la complejidad de este gen [21]. Curiosamente, los estudios recientes han demostrado que DCC, así como UNC5C sirven como receptores de dependencia de netrina-1, por lo tanto, reforzando su papel potencial como supresores de tumores en los cánceres humanos [22-25].
Receptores DCC se distribuyen a lo largo de la longitud del epitelio en el intestino, mientras que netrina-1 se expresa diferencialmente, formando un gradiente dentro del tracto gastrointestinal [24]. Una alta concentración de netrina-1 está presente en la base cripta donde las células madre y las células de amplificación transitorias residen. Por el contrario, una baja concentración de netrina-1 existe en la punta de las vellosidades, donde muchas células están experimentando apoptosis y la muda de piel. Este gradiente de netrina-1 se examinó utilizando ratones transgénicos para determinar si netrina-1 es responsable de regular la apoptosis inducida por DCC en el epitelio intestinal [24]. El estudio realizado por Mazelin et al. indicó que netrina-1 sobreexpresión causó una disminución en la muerte celular epitelial intestinal, mientras que no se observó aumento en la proliferación y diferenciación de células. Por el contrario, los ratones recién nacidos netrina-1-mutante exhiben una mayor muerte celular. Tomados en conjunto, estos datos apoyan el concepto de que netrina-1 regula la apoptosis a través del receptor DCC-dependencia en el intestino. Sin embargo, netrina-1 es poco probable que sea un regulador directo de la homeostasis intestinal, dado que la organización epitelial normal no se ve perturbado por netrina-1 sobreexpresión [24].
Similares a los receptores de DCC, otros receptores de netrina-1, incluyendo UNC5A, Unc5B, y UNC5C, también se descubrieron como genes supresores de tumor putativo en varios tumores, incluyendo el cáncer gástrico [26, 27]. En particular, se observó una doble regulación a la baja de la expresión UNC5C en comparación con los tejidos normales correspondientes en aproximadamente el 70% de los casos de cáncer gástrico [26]. Esta región se encuentra en 4q21-23, que es a menudo un sitio de deleción en el cáncer gástrico y está asociado con la inactivación de genes epigenéticos, como la metilación del promotor [26-28].
En este estudio, la hipótesis de que la regulación por disminución de DCC y UNC5C desempeña una importante función reguladora del crecimiento en la tumorigénesis gástrico, que hemos abordado mediante la investigación de un panel de líneas celulares de cáncer gástrico y muestras clínicas de pacientes con cáncer gástrico. Aquí, nos informan que la mayoría de los cánceres gástricos muestran la pérdida de ambos receptores netrina-1. También proporcionamos datos que sugieren que la inactivación de estos receptores es mediada a través de ambos mecanismos genéticos y epigenéticos. defectos acumulados en estos dos receptores de dependencia se asociaron significativamente con el fenotipo CIN, haciendo hincapié en la importancia de estos nuevos hallazgos y esta vía de regulación del crecimiento en la carcinogénesis gástrica.
Resultados
Características de los pacientes con cáncer gástrico 98 Red de cáncer gástrico pacientes, 34 pacientes eran mujeres (35%), y 48 tumores fueron diagnosticados patológicamente como diferenciado (49%) (Tabla 1). En relación con el estadio TNM, 18, 29, 37, y 14 pacientes con cáncer gástrico fueron clasificados como estadio I, II, III, y IV, respectivamente. Por análisis genéticos tumorales, 13 cánceres gástricos se clasifican como mostrar inestabilidad de microsatélites (MSI; 13%). La relación media LOH de los 98 tumores fue de 0,24 (desviación estándar (SD), ± 0,3) .Tabla 1 Características de los pacientes con cáncer gástrico
Característica
Porcentaje (No.)
Edad
La edad media (SD)
65,1 (11,8)
Sexo Femenino

35 (34)
Hombre
65 (64)
Histología
Dif
49 (48)
undiff
51 (50)
Etapa
IA /IB
18 (18)
IIA /IIB
30 (29)
IIIA /IIIB /IIIC
38 (37)
IV página 14 (14)
T
T1a /1b página 14 (14)
T2 página 14 (14 )
T3
28 (27)
T4a /4b
44 (43)
N
N0
27 (26)
N1
35 (34 )
N2
24 (24)
N3 página 14 (14)
metástasis a distancia
negativo
86 (84)
positiva página 14 (14)
MSI MSI
página 13 (13)
no MSI
87 (85) Relación de
LOH
media razón (SD)
0,24 (0,3 )
CIN
positiva
51 (50)
negativo
47 (46)
No informativa página 2 (2)
KRAS
mutante página 5 (5) sobre Wild
95 (93)
BRAF mutante

0 (0) sobre Wild
100 (98)
PIK3CA
mutante página 4 (3) sobre Wild
96 (94)
H.pyroli
positiva
71 (70)
negativo
29 (28)
CIN fenotipo se clasifica por el cálculo de la relación de LOH de los marcadores informativos de las siete secuencias microsatélites polimórficos, independientemente del 4q y 18q loci. Cuando un tumor mostró una relación LOH mayor que 0, el tumor se clasifica como CIN-positivo. Según este criterio, 50/98 tumores (51%) fueron clasificados como CIN-positivo.
La secuenciación directa de los especímenes de cáncer gástrico reveló que la proporción de KRAS
, BRAF
, y PIK3CA
mutaciones (Tabla 1). Las mutaciones se detectaron en el KRAS
codón 12 (5%, N
= 5/98) y el codón 13 (1%, N
= 1/98); BRAF
codón 600 (0%, N =
0/98); PIK3CA
codón 545 (1%, N =
1/98); y el codón 1047 (3%, N =
3/98). KRAS
codón 12 mutaciones consistieron en G12D (35G a A, N
= 4) y G12R (34G a C, N
= 1), y codón 13 mutaciones incluyen G13D (38G a A, N
= 1). Curiosamente, uno de tumores KRAS está representada tanto
codón 12 y 13 mutaciones (archivo adicional 1: Figura S1A). PIK3CA
exón 9 mutaciones E545K compuesto (1633G a A, N
= 1), mientras que el exón 20 mutaciones comprendían H1047R (3140A a G, N
= 3). Por otra parte, se determinó el estado de infección de H. pylori fotos: por recuperar el genotipo cagA
(archivo adicional 1: Figura S1B). A través de este análisis, podríamos recuperar el cagA
secuencia a partir de 70 tejidos de cáncer gástrico (71%).
Estado de metilación de DCC Hoteles en muestras de cáncer gástrico y de asociación con las características clínico-patológicas
investigamos DCC
estado de metilación en 98 cánceres gástricos y 105 muestras de mucosa gástrica normal. Ubicación de la DCC
gen y los resultados de un panel de restricción bisulfito combinado representante análisis (COBRA) se representan en la Fig. 1a-b; estos resultados se analizaron como variables continuas (Fig. 1C). Se encontró que los cánceres gástricos 56/98 (57%) y 31/105 muestras de mucosa gástrica normal (29,5%) que aparecen más de 1,0% de metilación en el DCC
promotor. La media del nivel de metilación fue del 18,3% [intervalo de confianza del 95% (IC), 14,5-22,2%] entre los tejidos de cáncer gástrico que aparecen por encima de 1,0% de metilación en el DCC
promotor y el 4,9% (IC del 95%, 3.3 a 6.5% ) en las muestras de mucosa gástrica normal correspondientes que muestran más de 1,0% de metilación (P
< 0,0001, Wilcoxon /Kruskal-Wallis prueba; Fig. 1C-d). Por lo tanto, definimos un DCC
metilación de 5% o más como una variable continua (es decir, > 5,0% de metilación se define como la metilación positivo (metilado) y < 5,0% de metilación como metilación-negativo (no metilado)) . Con este criterio, se observó DCC
casos metilados en los cánceres gástricos 44/98 (45%) y en 9/105 mucosa gástrica normal (9%). Higo. 1 analiza DCC
la metilación del promotor y 18q LOH. (A) Representación esquemática de la localización de las tres sondas LOH y DCC
regiones promotoras de genes en el cromosoma 18. La línea roja indica la
DCC
gen. Gray Opiniones y cuadrados negros
representan las regiones no traducidas 1 y el exón de codificación, respectivamente; flechas en las plazas
indican los sitios de inicio de la transcripción; líneas verticales indican
sitios CpG;
diamantes blancos representan los sitios de restricción para HhaI; líneas horizontales gruesas
representan las ubicaciones de los productos COBRA; flechas en las líneas gruesas horizontales
denotar cebadores COBRA. (B) Los resultados representativos de COBRA de DCC. Las flechas indican
alelos metilados; M denota
metilación; T denota
no metilación; Mc
denota el control de metilado; SM
denota el marcador de tamaño. (c) Resultados de DCC
metilación como una variable continua. En los diagramas de caja de la trama, la línea horizontal
dentro de cada caja representa la mediana, los límites
de cada caja representan los rangos intercuartil, y los bigotes ¿Cuáles son los valores máximo y mínimo. Cada barra verde
representa la media. NM
denota la mucosa normal. T denota
tumor. (D) la frecuencia de metilación-positividad de cáncer y tejidos normales de acuerdo a diferentes umbrales. (E) DCC
niveles de expresión de mRNA y el estado de metilación en 10 líneas celulares de cáncer gástrico y una línea celular de fibroblastos de pulmón humano. DCC
expresión de ARNm se observa (Ct inferior) en líneas celulares y GCIY NHLH. DW marca de agua destilada
continuación, se investigó la asociación entre el DCC
metilación del promotor y varias características clínico-patológicas y genéticas. DCC
estado de metilación se asoció significativamente con el estado de MSI. cánceres gástricos MSI-positivos fueron significativamente más frecuentemente asociados con DCC
metilación que con DCC
no metilación (23 vs. 6%, P = 0,013
; Tabla 2). No se encontraron asociaciones significativas entre DCC
estado de metilación y cualquier otra asociación entre 2 variables.Table alteraciones epigenéticas /genéticas del gen DCC y las características clínico-patológicas de los cánceres gástricos
DCC
metilación Status-% ( No.)
18q LOH Status-% (N) guía empresas DCC
Alteración Status-% (N) guía empresas no metilación
metilación
P
No informativa
negativo positivo

P
No informativa
negativo positivo

positiva
P
total
metilación sola

LOH sola
Tanto gratis (n = 54
) gratis (n = 44
) gratis (n
= 15) gratis (n = 47
) gratis (n = 36
) gratis (n = 15
)

(n = 25
) gratis (n = 58
) gratis (n = 22
) gratis (n = 19
) gratis (n = 17
) guía empresas
edad La edad media (SD)
63,6 (12,5)
67,0 (10,7)
0.48a
68,9 (11,4)
64,8 (11,4)
63,9 (12,4)
0.76a
68,9 (11,4)
63,5 (12,9)
64,8 (11,3) 66,3
(9.5)
60,7 (12,7)
67,4 (11,4)
0.98a
Sexo Femenino

39 (21): perfil 30 (13)
0.33b
40 (6)
38 (18)
28 (10)
0.32b
40 (6)
44 (11)
29 (17) 32
(7)
32 (6)
24 (4)
0.19b
Hombre
61 (23)
70 (31)
60 (9)
62 (29)
72 (26)
60 (9)
56 (14)
71 (41)
68 (15)
68 (13) 76
(13)
Histología
Dif
41 (22)
59 (26)
0.071b
47 (7)
55 (26)
42 (15 ): perfil 0.22b
47 (7): perfil 52 (13)
48 (28)
59 (13)
32 (6)
53 (9)
076b
undiff
59 (32)
41 (18)
53 (8)
45 (21)
58 (21)
53 (8)
48 (12)
52 (30)
41 (9)
68 (13)
47 (8)
Etapa
IA /IB
20 (11)
16 (7)
0.83b página 13 (2): perfil 19 (9): perfil 19 (7)
0.15b página 13 (2): perfil 24 ( 6)
17 (10) página 14 (3)
21 (4): perfil 18 (3)
0.70b
IIA /IIB
26 (14)
34 (15)
27 (4)
30 (14)
31 (11)
27 (4)
24 (6)
33 (19)
36 (8)
32 (6)
29 (5)
IIIA /IIIB /CII
39 (21)
36 (16)
53 (8)
43 (20)
25 (9)
53 (8)
40 (10)
33 (19)
45 (10)
26 (5): perfil 24 (4)
IV
15 (8) página 14 (6) página 7 (1) página 9 (4)
25 (9) página 7 (1)
12 (3)
17 (10) página 5 (1)
21 (4)
29 (5)
T
T1a /1b
15 (8 ) página 14 (6)
0.24b página 7 (1): perfil 17 (8) página 14 (5)
0.94b página 7 (1): perfil 16 (4)
16 (9)
18 (4)
21 (4) página 6 (1)
0.54b
T2 página 13 (7)
16 (7) página 13 (2)
15 (7) página 14 (5) página 13 (2): perfil 16 (4): perfil 14 (8): perfil 14 (3) página 11 (2)
18 (3)
T3
20 (11)
36 (16)
33 (5)
28 (13)
25 (9)
33 (5)
16 (4)
31 (18)
41 (9)
16 (3)
35 (6)
T4a /b
52 (28)
34 (15)
47 (7)
40 (19)
47 (17)
47 (7): perfil 52 (13)
40 (23)
27 (6)
53 (10)
41 (7)
N
N0
30 (16) 23
(10)
0.66b
20 (3): perfil 28 (13)
28 (10)
0.29b
20 (3): perfil 32 (8)
26 (15)
23 (5)
32 (6)
24 (4)
0.19b
N1
37 (20)
32 (14)
47 (7)
38 (18)
25 (9)
47 (7)
44 (11)
28 (16)
32 (7)
26 (5)
24 (4)
N2
20 (11)
30 (13)
20 (3)
26 (12)
25 (9 ): perfil 20 (3)
20 (5)
28 (16)
32 (7): perfil 21 (4): perfil 29 (5)
N3
13 (7)
16 (7) página 13 (2) página 9 (4)
22 (8) página 13 (2) página 4 (1) página 19 (11) página 14 (3)
21 (4)
24 (4)
metástasis a distancia
negativo
85 (46)
86 (38)
0.87b
93 (14)
91 (43)
75 (27)
0.041b
93 (14)
88 (22)
83 (48)
95 (21)
79 (15)
71 (12)
0.55b
positiva
15 (8) página 14 (6) página 7 (1) página 9 (4)
25 (9) página 7 (1): perfil 12 (3): perfil 17 (10) página 5 (1): perfil 21 (4)
29 (5)
estado de MSI MSI
página 6 (3)
23 (10)
0.013b ​​
33 (5) página 9 (4)
11 (4)
0.69b
33 (5) página 4 (1): perfil 12 (7) página 14 (3)
0 (0)
24 ( 4)
0.25b
no MSI
94 (51)
77 (34)
67 (10)
91 (43)
89 (32)
67 (10)
96 (24)
88 (51)
86 (19)
100 (19) 76
relación LOH (13)
media razón (SD)
0,23 (0,30)
0,26 (0,31)
0.55A
0,22 (0,29)
0,10 (0,15)
0,44 (0,36) Hotel < 0.0001a
0,22 (0,29)
0,05 (0,10)
0,33 (0,33)
0,16 (0,18)
0,44 (0,34)
0,44 (0,39) Hotel < 0.0001a
CIN *
positiva
46 (25)
57 (25)
0.39b
47 (7)
38 (18)
74 (25)
0.0017b
47 (7)
24 (6)
66 (37)
55 (12)
76 (13)
71 (12)
0.0005b
negativo
54 (27)
43 (19)
53 (8)
62 (29)
26 (9)
53 (8): perfil 76 (19)
34 (19)
45 (10)
24 (4)
29 (5)
KRAS
/BRAF
/PIK3CA

Mutant página 6 (3) página 11 (5)
0.30b
27 (4) página 6 (3) página 3 (1)
0.45b
27 (4) página 4 (1) página 5 (3) página 9 (2) página 5 (1)
0 (0)
0.82b sobre Wild
94 (51)
89 (38)
73 (11)
94 (44)
97 (35)
73 (11)
96 (24)
95 (55)
91 (20)
95 (18)
100 (17)
H.pyroli
positiva
72 (39)
70 (31)
0.85b
80 (12)
66 (31)
75 (27)
0.37b
80 (12)
60 (15)
74 (43 )
73 (16)
79 (15)
71 (12)
0.20b
negativo
28 (15)
30 (13)
20 ( 3)
34 (16)
25 (9)
20 (3)
40 (10)
26 (15)
27 (6)
21 (4 ): perfil 29 (5)
* Dos casos no son informativos del estado CIN
se calcula un valor de p entre
no metilación y la metilación, 18qLOH negativo y positivo, y DCC alteración negativa y positiva (total) por Wilcoxon /Kruskal-Wallis pruebas sobre B P valores se calcularon entre
no metilación y la metilación, alteración negativa y positiva, y DCC 18qLOH negativo y positivo (total) mediante la prueba de chi-cuadrado de Piason
PDH de 18q locus fenotipo asociado con la NIC en el cáncer gástrico Estar entre casos informativos, las frecuencias de 18q LOH en cada marcador microsatélite fueron 14/41 (24%) a D18S35, 17/55 (31%) a D18S69, y 21/58 (36 %) a D18S58 (la ubicación de cada fabricante se muestra en la Fig. 1a). Los tumores que muestran LOH en los tres, dos, y sólo uno de los tres marcadores de microsatélites fueron 4 (4,8%), 9 (11%), y 23 (28%) de 83 casos informativos entre 98 cánceres gástricos primarios, respectivamente. Los tumores que muestran LOH en al menos uno de los tres marcadores de microsatélites para 18q LOH se clasificaron como 18q LOH-positivo. Según este criterio, se detectaron cánceres LOH 18q-positivos en 36 (43%) de 83 casos informativos entre los 98 cánceres gástricos primarios (Tabla 2).
De manera similar a la DCC
estado de metilación, hemos investigado las asociaciones entre LOH 18q situación y diversas características clínico-patológicas y genéticas. Entre los casos informativos, la frecuencia de cáncer gástrico con metástasis a distancia fue mayor en 18q cánceres gástricos LOH-positivo en comparación con 18q cánceres LOH-negativas (25 frente a 9%, P = 0,041
; Tabla 2). Las relaciones de LOH calculadas para los otros siete loci fueron también significativamente mayor para 18q LOH-positivas que para 18q tumores LOH-negativo (0,44 frente a 0,10, P <
.0001; Tabla 2). De acuerdo con estos resultados, cuando un tumor mostró una relación LOH mayor que 0, el tumor se clasifica como CIN-positivo. Además, los cánceres gástricos CIN-positivas que también eran 18q LOH-positivos fueron significativamente más abundantes que los que estaban 18q LOH-negativo (74 vs. 38%, P = 0,0017
; Tabla 2). Estudios anteriores han demostrado que la pérdida de 18q se observa con frecuencia en los cánceres colorrectales, y su frecuencia está correlacionada con CIN fenotipo pero inversamente correlacionado con MSI fenotipo [29, 30]. Como nuestro estudio y otro estudio demostraron, este fenómeno también fue reproducido para el cáncer gástrico [18].
Estado de la expresión y la metilación de DCC Hoteles en líneas celulares de cáncer gástrico
a evaluar las asociaciones entre DCC
estado de expresión y alteraciones epigenéticas en el DCC
gen, se analizó el ARN mensajero (ARNm) los niveles de la reacción de transcripción inversa de la polimerasa cuantitativa en cadena (RT-qPCR) usando un conjunto de cebadores descritos anteriormente [31] y se examinaron las asociaciones entre DCC
expresión y estado de metilación de CpG en la región promotora DCC
en 10 líneas celulares de cáncer gástrico (MKN7, N87, MKN74, MKN45, NUGC-2, NUGC-3, NUGC-4, GCIY, Ogum-1, y MKN1) y una normal de línea celular de fibroblastos de pulmón (NHLF). Todas las líneas celulares, a excepción de MKN74, GCIY, OGUM-1, MKN1 y células NHLF, mostraron una disminución de la expresión de genes de DCC
transcripciones, y sus promotores se metilado (Fig. 1e). Por otro lado, aunque tres líneas celulares, N87, Ogum-1, y MKN1 mostraron disminución de la expresión de DCC
transcripciones de genes, DCC
promotores en las células no se metilado por COBRA. Entre las 10 líneas celulares de cáncer gástrico, sólo la línea celular GCIY expresó DCC
transcripciones al mismo nivel que las células NHLF, pero su promotor fue metilado. Cuando se categorizaron una línea celular que muestra aΔC T de más de 15,0 como DCC
expresión negativa y una línea celular con aΔC T de 15,0 o menos como DCC
expresión positiva, sólo el GCIY línea celular podría ser categorizado como DCC
expresión positiva entre las siete líneas celulares de cáncer gástrico con DCC
metilación; este hallazgo no fue estadísticamente significativa.
Reducción de expresión DCC requiere alteraciones genéticas y epigenéticas tanto
continuación, se investigó la asociación entre la expresión de la proteína DCC y alteraciones genéticas y epigenéticas en el DCC
de genes en el cáncer gástrico 86 especímenes. Los ejemplos representativos de inmunohistoquímica resultados (IHC) de tinción se muestran en la Fig. 2a-c. Hemos clasificado los tumores en los siguientes tres grupos basándose en los resultados de IHC analizados como una variable categórica: pérdida completa de la expresión de DCC (. 8 casos, 9%; Figura 2a), pérdida focal de expresión DCC (38 casos, 44%; fig. 2b), y la expresión positiva de proteína DCC (40 casos, 47%; Fig. 2c). Entre 86 cánceres gástricos, 46 casos (53%) que se muestra la reducción de expresión de DCC. Un estudio informó de que la reducción de la expresión de DCC se observó en un total de 38% de los cánceres gástricos y tumores en estadio T1-T2 mantuvo una expresión DCC positiva mientras que fue abolida en tumores T3 [32]. Este hallazgo también fue reproducible en este estudio (archivo adicional 2: Figura S2). Higo. 2 DCC
la metilación del promotor e inmunohistoquímica análisis. análisis de inmunohistoquímica para DCC gratis (a-c). Los núcleos de las células tumorales son completamente negativamente (a), focalmente negativamente (b), y positivamente (c) manchada. (D) Asociación entre la alteración genética /epigenética y DCC
expresión
A continuación, examinó las relaciones entre las alteraciones genéticas y epigenéticas y estado de expresión de DCC. Siete de 8 casos con pérdida total, 33 de los 38 casos con pérdida focal, y 34 de 40 casos con expresión positiva DCC fueron informativas tanto para DCC
la metilación del promotor y 18q LOH. Encontramos que entre los tipos de cáncer con pérdida completa de la expresión de DCC, 5/7 cánceres (71%) demostró tanto la metilación del promotor y 18q LOH
DCC. Por el contrario, 8/33 tipos de cáncer (24%) mostraron una pérdida focal de expresión DCC y ambos metilación y LOH, 5/33 tipos de cáncer (15%) mostraron LOH solo, y 12/33 tipos de cáncer (36%) muestran metilación solo. Entre los tipos de cáncer que fueron positivos para la expresión DCC, sólo 2/34 cánceres (6%) demostraron tanto la metilación y la LOH, 13/34 (38%) de cáncer Loh solo, y 8/34 tipos de cáncer (24%) de metilación solos (cánceres mostrando tanto DCC
metilación y 18q LOH contra los otros, p = 0,0048
, prueba de chi-cuadrado de Pearson; Fig. 2d). Nuestros datos sugieren que una reducción en la expresión de DCC puede requerir densa metilación en las GPC promotoras y LOH del locus 18q, de acuerdo con la teoría de dos hit [33].
Asociación entre las características clinicopatológicas y genéticas alteraciones /epigenéticos de DCC
en el cáncer gástrico
Desde alteraciones tanto epigenéticos y genéticos son fundamentales para la supresión DCC, se investigó la relación entre la epigenética y alteraciones genéticas en el gen DCC
con varias características clinicopatológicas. De 98 cánceres gástricos, cánceres 15 se clasificaron como no informativa, 25 cánceres fueron clasificados como negativos para DCC
alteraciones, y 58 tipos de cáncer se clasificaron como positivos para DCC
alteraciones. Entre las características clínico-patológicas, la relación de LOH y distribución fenotipo CIN difirieron significativamente entre los cánceres negativos y positivos para DCC
alteraciones (tabla 2). Estar entre los 58 tipos de cáncer con DCC
alteraciones, 17 tumores mostraron alteraciones en tanto DCC
metilación y LOH 18q, 18q LOH 19 tenía solo, y 22 tipos de cáncer exhibidos DCC
metilación solo. La relación LOH calculado para los otros siete loci fue significativamente más alta en los cánceres gástricos con tanto DCC
metilación y 18q LOH (LOH media ratio, 0,44; SD ± 0,39) y en los cánceres con LOH 18q sola (media LOH ratio, 0,44; SD ± 0,34), intermedia en los cánceres con DCC
metilación sola (media LOH ratio, 0,16; SD ± 0,18), y la más baja en los cánceres negativo para DCC
alteraciones (LOH medio de relación, 0,05; SD ± 0,10; P Hotel < 0,0001, Wilcoxon /prueba de Kruskal-Wallis). Higo. Higo. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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