Genetiske og epigenetiske endringer av netrin-1 reseptorer i magekreft med kromosom instability

genetiske og epigenetiske endringer av netrin-1 reseptorer i magekreft med kromosom ustabilitet
Abstract
Bakgrunn Bedrifter Den genekspresjon av netrin-1 avhengighet reseptorer , DCC Hotell og UNC5C
, er ofte nedregulert i mange kreftformer. Vi antok at nedregulering av DCC og UNC5C har en viktig regulerende funksjon vekst i mage tumorigenesis.
Resultater
I denne studien, en serie av genetisk og epigenetisk analyser for DCC Hotell og UNC5C
ble utført i en japansk kohort av 98 sporadiske mage kreft og tilsvarende normale mageslimhinnen prøver. Tap av heterozygositet (LOH) analyser og mikro ustabilitet (MSI) analyse ble brukt for å bestemme kromosomal instabilitet (CIN) og MSI fenotyper, henholdsvis. Mer enn 5% metylering i DCC
og UNC5C
promotere ble funnet i 45% (44/98) og 32% (31/98) gastriske cancere, henholdsvis, og i 9% (9/105) og 5% (5/105) normal gastrisk mucosa, respektivt. Overall, 70% (58 av 83 informative tilfeller) og 51% (40 av 79 informative tilfeller) av magekreft næret enten LOH eller avvikende metylering i DCC Hotell og UNC5C
gener, henholdsvis. Totalt 77% (51 av 66 informative tilfeller) av magekreft viste kumulative feil i disse to avhengighet reseptorer og var signifikant assosiert med kromosom ustabilitet. Både DCC og UNC5C ble inaktivert i 97% av CIN-positive mage kreft og hos 55% av CIN-negative mage kreft.
Konklusjoner
Defekt i netrin reseptorer er en vanlig funksjon i mage kreft. DCC
endringer er tydelig i de tidlige stadiene, og UNC5C
endringer eskalere med progresjon av sykdommen, noe som tyder på at den kumulative endringer av netrin-1 reseptorer var en sen hendelse i magekreft progresjon og understreker viktigheten av dette vekst regulatoriske sti i magekreftutvikling.
nøkkelord
mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP Metylering kromosom ustabilitet DCC
UNC5C
Netrin-1-reseptorer Bakgrunn
Global estimater av kreftforekomst rang magekreft som den fjerde vanligste kreftformen og den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden [1]. Magekreft er en heterogen sykdom med flere miljømessige årsaker og med alternative veier for kreftutvikling [2, 3]. En av de viktigste etiologiske risikofaktorer for magekreft er Helicobacter pylori
(H. pylori
) infeksjon. Tidligere rapporter indikerte en 93,1 til 100% infeksjon rate for H. pylori
hos pasienter med magekreft, mens bare 1/2 til 2/8% av individer infisert med H. pylori
utvikle magekreft [4-7].
Nåværende kunnskap om de molekylære mekanismene bak magekreftutvikling indikerer en stor epigenetisk ustabilitet sti og to store genetisk ustabilitet trasé [8]. Den store epigenetisk ustabilitet reaksjonsvei er definert som CpG øya methylator fenotypen (CIMP), som opprinnelig ble beskrevet i kolorektal kreft, og også observert i et delsett av mage cancer og som huser en kritisk grad av avvikende promotor hypermethylation forbundet med transcriptional stanse av multiple tumor suppressor-gener [9, 10]. De to store genetisk ustabilitet veier inkluderer mikro ustabilitet (MSI) og kromosom ustabilitet (CIN) [8]. MSI er definert som tilstedeværelse av replikering feil i enkle repetitive mikro sekvenser som følge av mismatch reparasjon (MMR) mangler. En er Lynch syndrom forårsaket av germline mutasjoner i MMR gener og en annen er sporadisk MSI skyldes hovedsakelig promoter hypermethylation i MLH1
genet [10, 11]. På den annen side, CIN, som er karakterisert ved kromosomale endringer-enten kvalitativ eller kvantitativ-er en mer vanlig bane som kan omfatte clinicopathologically og molekylært heterogene tumorer [8].
Cancer Genome Research Network Atlas nylig delt inn i mage cancer fire undertyper [12]. Tumorer ble først kategorisert av Epstein-Barr-virus (EBV) -positivity (9%), og deretter ved MSI-høy status, heretter kalt MSI-positive (22%), og de resterende tumorer ble klassifisert ved graden av Aneuploidy inn i de betegnes genomisk stabil (20%) eller som har CIN (50%). EBV-positive cancere, så vel som MSI-positive cancere var kjent å klynge hver på sin egen, som oppviser ekstrem CIMP. Forskjeller mellom EBV-CIMP og MSI-tilknyttede mage-CIMP metylering profiler er eksemplifisert ved det faktum at alle EBV-positive svulster analysert vises CDKN2A plakater (p16INK4a
) promoter hypermethylation men manglet MLH1
hypermethylation karakteristisk for MSI-forbundet CIMP.
med hensyn til CIN preget av eksemplar nummer endringer i kromosomene, Deng et al. brukte høy oppløsning genomisk analyse for å profilere somatiske eksemplar nummer endringer i et panel av 233 mage kreft (primære svulster og cellelinjer) og 98 matchet mage ikke-maligne vev. Angå brede kromosomale regioner, de hyppigst forsterkes regionen inkludert kromosomer 1q, 5p, 6p, 7p, 7q, 8q, 13q, 19p, 20p, og 20Q, og de hyppigst slettet regioner inkludert kromosomer 3p, 4p, 4Q, 5q, 6Q , 9p, 14q, 18q og 21q [13].
Ofte slettet kromosomale regioner er vanligvis preget av tap av heterozygositet (LOH) og foreslå tilstedeværelse av tumor suppressor gener [14, 15]. LOH på kromosom 18q21 er funnet i 30-71% av magekreft [13, 16-18], og DPC4 plakater (Smad4
) /DCC
har blitt postulert å være de viktigste målene. DPC4 product: (Smad4
), en tumor suppressor gen, viser hyppige mutasjoner ledsaget av LOH i ca 20% av bukspyttkjertel kreft [19], men ingen mutasjoner er blitt rapportert i mage kreft [20]. I motsetning til dette, er det få studier rettet mot DCC
genet endringer, og dens genetiske /epigenetisk fortsatt er til stede praktisk talt uutforsket i magekreft, delvis på grunn av lengden og kompleksiteten av dette genet [21]. Interessant nok har nylige studier vist at DCC samt UNC5C tjene som avhengighets reseptorer for netrin-1, og dermed forsterke deres potensielle rolle som tumor-suppressorer i humane cancere [22-25].
DCC-reseptorer er fordelt langs lengden av epitelet i tarmen, mens netrin-1 blir uttrykt forskjellig, danner en gradient innenfor gastrointestinaltrakten [24]. En høy konsentrasjon av netrin-1 er tilstede på krypten base hvor stamceller og forbigående forsterknings celler bor. I motsetning til dette eksisterer det en lav konsentrasjon av netrin-en ved spissen av villi, hvor mange celler som gjennomgår apoptose og sloughing-off. Dette netrin-en gradient ble undersøkt ytterligere ved hjelp av transgene mus for å bestemme om netrin-1 er ansvarlig for å regulere DCC-indusert apoptose i tarmepitelet [24]. Studien av Mazelin et al. indikerte at netrin-1 overekspresjon forårsaket en reduksjon i intestinal epithelial cell death, mens det ble observert noen økning i proliferasjon og differensiering av celler. I motsetning til dette oppviste netrin-1-mutant nyfødte mus øket celledød. Til sammen utgjør disse data støtter konseptet at netrin-1 regulerer apoptose via DCC-avhengighet reseptoren i tarmen. Imidlertid er netrin-en lite sannsynlig å være en direkte regulator av intestinal homeostase, gitt at normal epitelial organisasjon ikke blir forstyrret av netrin-1 overekspresjon [24].
Likhet med DCC-reseptorene, andre netrin-1-reseptorer, inkludert UNC5A, UNC5B, og UNC5C, ble også oppdaget som mulige tumorsuppressorgener i ulike tumorer, inkludert magekreft [26, 27]. Spesielt ble en todelt nedregulering av UNC5C uttrykk sammenlignet med tilsvarende normale vev observert hos ca. 70% av magekreft [26]. Denne regionen er lokalisert på 4q21-23, som ofte er en setet til delesjon i magekreft og er forbundet med epigenetisk geninaktivering, slik som promotor metylering [26-28].
I denne studien vi hypotese at nedregulering av DCC og UNC5C spiller en viktig regulerende funksjon vekst i mage tumorigenesis, som vi løst ved å undersøke et panel av magekreft cellelinjer og kliniske prøver fra pasienter med magekreft. Heri, rapporterer vi at flertallet av magekreft viser tap av både netrin-1-reseptorer. Vi har også data som tyder på at inaktiveringen av disse reseptorene er mediert gjennom både genetiske og epigenetiske mekanismer. Kumulative feil i disse to avhengighets reseptorer er vesentlig knyttet til CIN fenotype, understreker viktigheten av disse nye funnene og denne veksten regulatoriske veien i magekreftutvikling.
Resultater
Kjennetegn på mage kreftpasienter
Av 98 magekreft pasienter, 34 pasienter var kvinner (35%), og 48 tumorer ble patologisk diagnostisert som differensiert (49%) (tabell 1). Med hensyn til TNM stadium, 18, 29, 37, og 14 magekreftpasienter ble klassifisert som trinn I, II, III og IV, respektivt. Ved tumor genetiske analyser ble 13 mage kreft kategorisert som viser mikro ustabilitet (MSI, 13%). Gjennomsnittlig LOH Forholdet mellom de 98 svulster var 0,24 (standardavvik (SD), ± 0,3) .table 1 Kjennetegn på mage kreftpasienter
Karakteristisk
Andel (No.)
Age
Middelalder (SD)
65,1 (11,8)
Kjønn
Kvinne
35 (34)
Mann fra 65 (64)
Histologi
Diff
49 (48)
Undiff
51 (50)
Stage
IA /IB
18 (18)
IIA /IIB
30 (29)
IIIA /IIIB /IIIC
38 (37)
IV
14 (14)
T
T1a /1b
14 (14)
T2
14 (14 )
T3
28 (27)
T4a /4b
44 (43)
N
N0
27 (26)
N1
35 (34 )
N2
24 (24)
N3
14 (14)
Fjernmetastaser
Negativ
86 (84)
Positive
14 (14)
MSI
MSI
13 (13)
Non-MSI
87 (85)
LOH Ratio
Mean Ratio (SD)
0,24 (0,3 )
CIN
Positive
51 (50)
Negativ
47 (46)
Ikke informativ
to (2)
KRAS
Mutant
fem (5)
Wild
95 (93)
BRAF
Mutant
0 (0)
Wild
100 (98)
PIK3CA
Mutant
4 (3)
Wild
96 (94)
H.pyroli
Positive
71 (70)
Negativ
29 (28)
CIN fenotype ble kategorisert ved å beregne LOH forholdet mellom informative markører for de syv polymorfe mikro sekvenser, uavhengig av 4Q og 18q loci. Når en svulst viste en LOH forhold høyere enn 0, ble tumoren kategorisert som CIN-positive. Ved dette kriteriet, ble tumorer 50/98 (51%) klassifisert som CIN-positiv.
Direkte sekvensering av magekreft prøvene avslørte andelen av KRAS
, BRAF
, og PIK3CA
mutasjoner (tabell 1). Mutasjoner ble påvist i KRAS
kodon 12 (5%, N
= 5/98) og kodon 13 (1%, N
= 1/98); BRAF
kodon 600 (0%, N
= 0/98); PIK3CA
kodon 545 (1%, N
= 1/98); og kodon 1047 (3%, N
= 3/98). KRAS
kodon 12 mutasjoner besto av G12D (35G til A, N
= 4) og G12R (34g til C, N
= 1), og kodon 13 mutasjoner inkludert G13D (38G til A, N
= 1). Interessant, vises en svulst både KRAS
kodon 12 og 13 mutasjoner (Tilleggs fil 1: Figur S1 A). PIK3CA
ekson 9 mutasjoner består E545K (1633G til A, N
= 1), mens ekson 20 mutasjoner består H1047R (3140A til G, N
= 3). Videre bestemmes vi smittestatus i H. pylori
av utvinne CagA
genotype (tilleggsfiler 1: Figur S1B). Gjennom denne analysen, kan vi gjenopprette CagA
sekvens fra 70 mage kreft vev (71%).
Metylering status for DCC
i magekreft prøver og tilknytning til clinicopathological funksjoner
Vi undersøkte DCC
metylering status i 98 mage kreft og 105 vanlige mageslimhinnen prøver. Plassering av DCC
genet og resultatene av et panel med representativ kombinert bisulfitt restriksjonsanalyser (Cobra) er vist på fig. 1a-b; disse resultatene ble analysert som kontinuerlige variabler (Fig. 1c). Vi fant at 56/98 mage kreft (57%) og 31/105 normale gastriske slimhinne prøver (29,5%) viste mer enn 1,0% metylering i DCC
promoteren. Gjennomsnittlig metylering nivå var 18,3% [95% konfidensintervall (CI), 14,5 til 22,2%] blant mage kreft vev som vises over 1,0% metylering i DCC
arrangøren og 4,9% (95% CI, 3.3 til 6.5% ) i de tilsvarende normale mageslimhinnen prøver som vist over 1,0% metylering (P
< 0,0001, Wilcoxon /Kruskal-Wallis test, fig. 1c-d). Derfor har vi definert en DCC
metylering av 5% eller mer som en kontinuerlig variabel (dvs. > 5,0% metylering ble definert som metylering-positive (metylert) og < 5,0% metylering som metylering-negative (unmethylated)) . Ved hjelp av dette kriteriet, vi observerte DCC
denaturert tilfeller 44/98 mage kreft (45%) og i 9/105 normal mageslimhinnen (9%). Fig. 1 DCC
promoter metylering og 18q LOH analyser. (A) Skjematisk fremstilling av plasseringen av de tre LOH sonder og DCC
gen promotorområdene i kromosom 18. Den røde linje
betegner DCC
genet. Gray Hotell og svarte firkantene
representerer uoversatt og koding ekson 1 regioner, henholdsvis; piler på rutene
indikerer transkripsjonsstartsider; vertikale linjer
indikerer CpG områder; hvite diamanter
representerer restriksjonsseter for HhaI; tykke horisontale linjer
skildrer plasseringen av COBRA produkter; piler på de tykke horisontale linjer
betegne COBRA primere. (B) Representative resultatene av COBRA av DCC. Piler
indikerer denaturert lene; M
betegner metylering; U
betegner unmethylation; Mc
betegner metylert kontroll; SM
betegner størrelsen markør. (c) Resultater av DCC
metylering som en kontinuerlig variabel. I boksen diagrammer,
den horisontale linjen innenfor hver boks representerer medianen, grensene
i hver boks representerer interkvartilt områder, og værhårene
er maksimums- og minimumsverdiene. Hver grønne linjen
representerer gjennomsnittet. NM
betegner normal slimhinne. T
betegner svulst. (D) Hyppigheten av metylering-positivitet av kreft og normale vev i henhold til forskjellige terskler. (E) DCC
mRNA ekspresjonsnivåer og metylering status i 10 magecancercellelinjer og en human lunge fibroblast cellelinje. DCC
mRNA uttrykket er observert (lavere ΔCT) i GCIY og NHLH cellelinjer. DW betegner destillert vann
Deretter undersøkte vi sammenhengen mellom DCC
promoter metylering og ulike clinicopathological og genetiske egenskaper. DCC
metylering status ble signifikant assosiert med MSI status. MSI-positive gastriske cancere var signifikant mer ofte forbundet med DCC
metylering enn med DCC
unmethylation (23 vs. 6%, P
= 0,013, tabell 2). Det var ingen signifikant sammenheng mellom DCC
metylering status og eventuelle andre variables.Table 2 Sammenheng mellom epigenetiske /genetiske forandringer av DCC genet og clinicopathological funksjoner i mage kreft
DCC
Metylering Status% ( No.)
18q LOH Status% (No.)
DCC
Endring Status% (No.)
Unmethylation
Metylering
P
Ikke informativ
Negativ
Positiv
P
Ikke informativ
Negativ
Positiv
Positiv
P
Total
Metylering alene

LOH alene
Både product: (n
= 54) product: (n
= 44) product: (n
= 15) product: (n
= 47) product: (n
= 36) product: (n
= 15)

(n
= 25) product: (n
= 58) product: (n
= 22) product: (n
= 19 ) product: (n
= 17)
Age
Gjennomsnittlig alder (SD)
63,6 (12,5)
67,0 (10,7)
0.48a
68,9 (11,4)
64,8 (11,4)
63,9 (12,4)
0.76a
68,9 (11,4)
63,5 (12,9)
64,8 (11,3)
66.3 (9.5)
60,7 (12,7)
67,4 (11,4)
0.98a
Kjønn
Kvinne
39 (21)
30 (13)
0.33b
40 (6)
38 (18)
28 (10)
0.32b
40 (6)
44 (11)
29 (17)
32 (7)
32 (6)
24 (4)
0.19b
Mann fra 61 (23)
70 (31)
60 (9)
62 (29)
72 (26)
60 (9)
56 (14)
71 (41)
68 (15)
68 (13)
76 (13)
Histologi
Diff
41 (22)
59 (26)
0.071b
47 (7)
55 (26)
42 (15 )
0.22b
47 (7)
52 (13)
48 (28)
59 (13)
32 (6)
53 (9)
076b
Undiff
59 (32)
41 (18)
53 (8)
45 (21)
58 (21)
53 (8)
48 (12)
52 (30)
41 (9)
68 (13)
47 (8)
Stage
IA /IB
20 (11)
16 (7)
0.83b
13 (2)
19 (9)
19 (7)
0.15b
13 (2)
24 ( 6)
17 (10)
14 (3)
21 (4)
18 (3)
0.70b
IIA /IIB
26 (14)
34 (15)
27 (4)
30 (14)
31 (11)
27 (4)
24 (6)
33 (19)
36 (8)
32 (6)
29 (5)
IIIA /IIIB /IIC
39 (21)
36 (16)
53 (8)
43 (20)
25 (9)
53 (8)
40 (10)
33 (19)
45 (10)
26 (5)
24 (4)
IV
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
T
T1a /1b
15 (8 )
14 (6)
0.24b
7 (1)
17 (8)
14 (5)
0.94b
7 (1)
16 (4)
16 (9)
18 (4)
21 (4)
6 (1)
0.54b
T2
13 (7)
16 (7)
13 (2)
15 (7)
14 (5)
13 (2)
16 (4)
14 (8)
14 (3)
11 (2)
18 (3)
T3
20 (11)
36 (16)
33 (5)
28 (13)
25 (9)
33 (5)
16 (4)
31 (18)
41 (9)
16 (3)
35 (6)
T4a /b
52 (28)
34 (15)
47 (7)
40 (19)
47 (17)
47 (7)
52 (13)
40 (23)
27 (6)
53 (10)
41 (7)
N
N0
30 (16)
23 (10)
0.66b
20 (3)
28 (13)
28 (10)
0.29b
20 (3)
32 (8)
26 (15)
23 (5)
32 (6)
24 (4)
0.19b
N1
37 (20)
32 (14)
47 (7)
38 (18)
25 (9)
47 (7)
44 (11)
28 (16)
32 (7)
26 (5)
24 (4)
N2
20 (11)
30 (13)
20 (3)
26 (12)
25 (9 )
20 (3)
20 (5)
28 (16)
32 (7)
21 (4)
29 (5)
N3
13 (7)
16 (7)
13 (2)
9 (4)
22 (8)
13 (2)
4 (1)
19 (11)
14 (3)
21 (4)
24 (4)
Fjernmetastaser
Negativ
85 (46)
86 (38)
0.87b
93 (14)
91 (43)
75 (27)
0.041b
93 (14)
88 (22)
83 (48)
95 (21)
79 (15)
71 (12)
0.55b
Positive
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
MSI status
MSI
6 (3)
23 (10)
0.013b ​​
33 (5)
9 (4)
11 (4)
0.69b
33 (5)
4 (1)
12 (7)
14 (3)
0 (0)
24 ( 4)
0.25b
Non-MSI
94 (51)
77 (34)
67 (10)
91 (43)
89 (32)
67 (10)
96 (24)
88 (51)
86 (19)
100 (19)
76 (13)
LOH forholdet
Mean ratio (SD)
0,23 (0,30)
0,26 (0,31)
0.55a
0,22 (0,29)
0,10 (0,15)
0,44 (0,36)
< 0.0001a
0,22 (0,29)
0,05 (0,10)
0,33 (0,33)
0,16 (0,18)
0,44 (0,34)
0,44 (0,39)
< 0.0001a
CIN *
Positiv
46 (25)
57 (25)
0.39b
47 (7)
38 (18)
74 (25)
0.0017b
47 (7)
24 (6)
66 (37)
55 (12)
76 (13)
71 (12)
0.0005b
Negativ
54 (27)
43 (19)
53 (8)
62 (29)
26 (9)
53 (8)
76 (19)
34 (19)
45 (10)
24 (4)
29 (5)
KRAS Twitter /BRAF Twitter /PIK3CA

Mutant
6 (3)
11 (5)
0.30b
27 (4)
6 (3)
3 (1)
0.45b
27 (4)
4 (1)
5 (3)
9 (2)
5 (1)
0 (0)
0.82b
Wild
94 (51)
89 (38)
73 (11)
94 (44)
97 (35)
73 (11)
96 (24)
95 (55)
91 (20)
95 (18)
100 (17)
H.pyroli
Positive
72 (39)
70 (31)
0.85b
80 (12)
66 (31)
75 (27)
0.37b
80 (12)
60 (15)
74 (43 )
73 (16)
79 (15)
71 (12)
0.20b
Negativ
28 (15)
30 (13)
20 ( 3)
34 (16)
25 (9)
20 (3)
40 (10)
26 (15)
27 (6)
21 (4 )
29 (5) product: * To tilfeller er ikke informativ av CIN status
en P
verdi ble beregnet mellom unmethylation og metylering, 18qLOH negative og positive, og DCC endring negative og positive (total) av Wilcoxon /Kruskal-Wallis test
b P
verdiene ble beregnet mellom unmethylation og metylering, 18qLOH negative og positive, og DCC endring negative og positive (total) ved Piason sin chi-kvadrat test
LOH av 18q locus forbundet med CIN fenotype i magekreft
Blant informative tilfeller, frekvensen av 18q LOH i hver mikro markør var 14/41 (24%) ved D18S35, 17/55 (31%) ved D18S69, og 21/58 (36 %) ved D18S58 (plasseringen av hver enkelt maker er vist i fig. 1a). Svulster som viser LOH på alle tre, to, og bare en av de tre mikrosatellittmarkører var 4 (4,8%), 9 (11%), og 23 (28%) av 83 informative tilfeller mellom 98 primær gastriske cancere, respektivt. Svulster som viser LOH i det minste en av de tre mikrosatellittmarkører for 18q LOH ble kategorisert som 18q LOH-positive. Ved dette kriteriet, ble 18q LOH-positive kreft påvist i 36 (43%) av 83 informative tilfeller blant 98 primær mage kreft (tabell 2).
Tilsvar til DCC
metylering status, undersøkte vi assosiasjoner mellom 18q LOH status og ulike clinicopathological og genetiske egenskaper. Blant informative tilfeller hyppigheten av magekreft med fjernmetastaser var høyere i 18q LOH-positive mage kreft sammenlignet med 18q LOH-negativ kreft (25 vs. 9%, P
= 0,041; Tabell 2). De LOH forholdstall beregnet for de andre syv loci var også betydelig høyere for 18q LOH-positive enn for 18q LOH-negative tumorer (0,44 vs 0,10, P
< .0001, tabell 2). I henhold til disse resultater, når en tumor viste en LOH forhold høyere enn 0, ble tumoren kategorisert som CIN-positive. Videre CIN-positive gastrisk kreft som også var 18q LOH-positive var signifikant mer rikelig enn de som var 18q LOH-negative (74 vs. 38%, renhet
= 0,0017; tabell 2). Tidligere studier har vist at 18q tap er ofte observert i kolorektal kreft, og dens frekvens er korrelert med CIN fenotype, men omvendt korrelert med MSI fenotype [29, 30]. Som vår studie og en annen studie viste, var dette fenomenet også gjengitt for mage kreft [18].
Expression og metylering status for DCC
i mage kreft cellelinjer
Å vurdere assosiasjoner mellom DCC
uttrykk status og epigenetiske forandringer i DCC
genet, undersøkte vi budbringer-RNA (mRNA) nivåer ved kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ved hjelp av et primersett som tidligere er beskrevet [31] og undersøkt assosiasjoner mellom DCC
ekspresjon og CpG metylering status i DCC
promoter-regionen i 10 magekreftcellelinjer (MKN7, N87, MKN74, MKN45, NUGC-2, NUGC-3, NUGC-4, GCIY, Ogum-1, og MKN1) og en normal fibroblastcellelinje lunge (NHLF). Alle cellelinjer, med unntak av MKN74, GCIY, Ogum-1, MKN1 og NHLF celler, viste redusert uttrykk for DCC
genet transkripsjoner, og deres arrangører ble metylert (fig. 1e). På den annen side, selv om tre cellelinjer, N87, Ogum-1, og MKN1 viste redusert ekspresjon av DCC
gentranskriptene, ble DCC
promotorer i disse celler ikke er metylert ved Cobra. Blant de 10 gastrisk kreft-cellelinjer, uttrykt bare den GCIY cellelinjen DCC
transkripter på samme nivå som NHLF celler, men dens promoter var denaturert. Når vi kategorisert en cellelinje som viser aΔC T på mer enn 15,0 som DCC
ekspresjon-negativ og en cellelinje med aΔC T på 15,0 eller mindre som DCC
uttrykk-positiv, vil bare GCIY cellelinje kan bli kategorisert som DCC
uttrykk-positive blant de sju magekreftcellelinjer med DCC
metylering; dette funnet var statistisk ikke-signifikant.
Reduksjon av DCC uttrykk krever både genetiske og epigenetiske forandringer
Deretter undersøkte vi sammenhengen mellom DCC protein uttrykk og genetiske og epigenetiske forandringer i DCC
genet i 86 magekreft prøver. Representative eksempler på immunhistokjemi (IHC) fargingsresultater er vist i fig. 2a-c. Vi kategorisert svulster i følgende tre grupper basert på de IHC resultatene analysert som en kategorisk variabel: fullstendig tap av DCC uttrykk (. ​​8 tilfeller, 9%, figur 2a), fokus tap av DCC uttrykk (38 tilfeller, 44%; fig. 2b), og positiv DCC protein uttrykk (40 tilfeller, 47%, fig. 2c). Blant 86 mage kreft, 46 tilfeller (53%) som vises redusert DCC uttrykk. En tidligere studie rapporterte at redusert DCC ekspresjon ble observert i totalt 38% av gastrisk kreft, og trinn T1-T2 tumorer opprettholdes en positiv DCC uttrykk mens den ble opphevet i T3 tumorer [32]. Dette funnet var også reproduserbar i denne studien (tilleggsfiler 2: Figur S2). Fig. 2 DCC
promoter metylering og immunhistokjemi analyser. Immunhistokjemi analyse for DCC plakater (a-c). Kjerner av tumorceller er helt negativt (a), fokalt negativ (b), og positivt (c) farget. (D) Association mellom epigenetisk /genetisk forandring og DCC
uttrykk
Deretter undersøkte vi assosiasjoner mellom genetiske og epigenetiske forandringer og DCC uttrykk status. Sju av 8 tilfeller med fullstendig tap, 33 av 38 tilfeller med fokus tap, og 34 av 40 tilfeller med positiv DCC uttrykk var informativt for både DCC
promoter metylering og 18q LOH. Vi fant at blant kreft med fullstendig tap av DCC uttrykk, 5/7 kreft (71%) viste både DCC
promoter metylering og 18q LOH. I motsetning til dette, 8/33 cancere (24%) viste fokal tap av DCC ekspresjon og både metylering og LOH, 5/33 cancere (15%) viste LOH alene, og 12/33 cancere (36%) som vises metylering alene. Blant de kreftformer som var positive for DCC uttrykk, bare 2/34 kreft (6%) demonstrerte både metylering og LOH, 13/34 (38%) kreft Loh alene, og 8/34 kreft (24%) metylering alene (kreft viser både DCC
metylering og 18q LOH vs de andre, P
= 0,0048, Pearsons kji-kvadrat test, fig. 2d). Våre data antyder at en reduksjon av DCC uttrykk kan kreve tett metylering i promotor CPGs og LOH av 18q locus, i henhold til to-hit teori [33]
. Foreningen mellom clinicopathological trekk og genetiske /epigenetiske endringer av DCC
i magekreft
Siden både epigenetiske og genetiske endringer er avgjørende for DCC undertrykkelse, undersøkte vi sammenhengen mellom epigenetisk og genetiske endringer i DCC
genet med ulike clinicopathological funksjoner. Av 98 mage kreft, ble 15 kreft kategorisert som ikke-informativ, ble 25 kreft kategorisert som negative for DCC
endringer, og 58 krefttilfeller ble kategorisert som positivt for DCC
endringer. Blant clinicopathological funksjoner, LOH forhold og CIN fenotype fordeling signifikant forskjellig mellom kreft negative og positive for DCC
endringer (tabell 2).
Blant de 58 kreftformer med DCC
forandringer, 17 svulster viste endringer i både DCC
metylering og 18q LOH, 19 hadde 18q LOH alene, og 22 kreft utstilt DCC
metylering alene. Den LOH takt beregnet for de andre syv loci var signifikant høyest i mage kreft med både DCC
metylering og 18q LOH (gjennomsnitts LOH ratio, 0,44; SD ± 0,39) og i kreft med 18q LOH alene (gjennomsnitts LOH ratio, 0,44; SD ± 0,34), middels i kreft med DCC
metylering alene (gjennomsnitts LOH ratio, 0,16; SD ± 0,18), og lavest i kreft negativ for DCC
endringer (gjennomsnitt LOH ratio, 0,05; SD ± 0,10; P
< 0,0001, Wilcoxon /Kruskal-Wallis test). Fig. Fig. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Familiehistorie med kreft og gastroøsofageal lidelser og risiko for esophageal og mage adenokarsinomer: en case-control studie
• Dobbelt arc volumet modulert terapi forbedrer dosefordelingen i forhold til statisk portal IMRT og 3D konforme strålebehandling for adjuvant behandling av magekreft