Les altérations génétiques et épigénétiques de la nétrine-1 récepteurs dans le cancer gastrique avec une instabilité chromosomique

Les altérations génétiques et épigénétiques de la nétrine-1 récepteurs dans le cancer gastrique avec une instabilité chromosomique
Résumé de l'arrière-plan
Les expressions géniques des récepteurs nétrine-1 dépendance, DCC et
UNC5C, sont fréquemment downregulated dans de nombreux cancers. Résultats de Nous avons supposé que la régulation négative de DCC et UNC5C a une fonction de régulation de croissance important dans la tumorigenèse gastrique.
Dans la présente étude, une série d'analyses génétiques et épigénétiques pour DCC
et UNC5C
ont été effectuées dans une cohorte japonaise de 98 cancers gastriques sporadiques et les échantillons correspondants de la muqueuse gastrique normale. Perte d'hétérozygotie (LOH) analyse et l'instabilité des microsatellites (MSI) analyse a été appliquée pour déterminer l'instabilité chromosomique (CIN) et phénotypes MSI, respectivement. Plus de 5% méthylation dans le
DCC et UNC5C de promoteurs ont été trouvées dans 45% (44/98) et 32% (31/98) des cancers gastriques, respectivement, et 9% (9/105) et 5% (5/105) de la muqueuse gastrique normale, respectivement. Dans l'ensemble, 70% (58 sur 83 des cas d'information) et 51% (40 sur 79 des cas d'information) des cancers gastriques abrités soit LOH ou méthylation aberrante dans le
DCC et les gènes UNC5C de, respectivement. Au total, 77% (51 sur 66 des cas d'information) des cancers gastriques a montré des défauts cumulés de ces deux récepteurs à dépendance et étaient significativement associés à une instabilité chromosomique. Les deux DCC et UNC5C ont été inactivées dans 97% des cancers gastriques CIN-positifs et dans 55% des cancers gastriques CIN-négatives.
Conclusions Defect des récepteurs nétrine est une caractéristique commune dans les cancers gastriques. DCC de les modifications apparaissent dans les premiers stades, et UNC5C de les altérations dégénèrent avec la progression de la maladie, ce qui suggère que les modifications cumulées de la nétrine-1 récepteurs a été un événement retard dans la progression du cancer de l'estomac et en insistant sur l'importance de cette la croissance voie réglementaire dans la carcinogenèse gastrique.
Mots-clés
cancer gastrique méthylation chromosomiques instabilité DCC
UNC5C
nétrine-1 récepteurs Contexte
les estimations mondiales de cancer gastrique incidence du cancer du rang que le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer dans le monde [1]. le cancer gastrique est une maladie hétérogène avec des étiologies multiples avec l'environnement et d'autres voies de carcinogenèse [2, 3]. L'un des principaux facteurs de risque étiologiques pour le cancer gastrique est Helicobacter pylori
(H. pylori
) infection. Les rapports précédents ont indiqué un taux d'infection de 93,1 à 100% pour H. pylori
chez les patients atteints de cancer gastrique, tandis que seulement 01.02 à 02.08% des individus infectés par H. pylori
développer un cancer gastrique [4-7].
les connaissances actuelles sur les mécanismes moléculaires sous-jacents carcinogenèse gastrique indique une voie principale d'instabilité épigénétique et deux voies majeures d'instabilité génétique [8]. La voie d'instabilité épigénétique majeur est défini comme étant l'îlot CpG methylator phénotype (PSEC), qui a été initialement décrite dans le cancer colorectal et également observée dans un sous-ensemble des cancers gastriques et qui héberge un degré critique de aberrante hyperméthylation de promoteur associé à silençage transcriptionnel de tumeur multiples les gènes suppresseurs [9, 10]. Les deux principales voies d'instabilité génétique comprennent l'instabilité des microsatellites (MSI) et l'instabilité chromosomique (CIN) [8]. MSI est définie comme la présence d'erreurs de réplication dans de simples séquences microsatellites répétitives causées par la réparation mismatch (ROR) lacunes. L'un est le syndrome de Lynch causée par des mutations germinales dans les gènes MMR et un autre est sporadique MSI causée principalement par le promoteur hyperméthylation dans le gène de la MLH1 [10, 11]. D'autre part, CIN, qui est caractérisée par des altérations chromosomiques-qualitative ou quantitative, est une voie plus commune qui peut comprendre clinicopathologically et des tumeurs hétérogènes moléculairement [8].
Le Réseau de recherche sur le génome Atlas du cancer a récemment divisé les cancers gastriques en quatre sous-types [12]. Tumeurs ont d'abord été classés par le virus d'Epstein-Barr (EBV) -positivity (9%), puis par MSI-haut statut, ci-après appelé MSI-positive (22%), et les autres tumeurs ont été classées par degré d'aneuploïdie dans celles appelées génomiquement stable (20%) ou ceux présentant une CIN (50%). cancers EBV-positifs ainsi que les cancers MSI-positifs ont été connus pour se regrouper chacun sur son propre, présentant une extrême PSEC. Les différences entre les profils de méthylation gastrique PSEC EBV-PSEC et MSI-associés sont illustrés par le fait que toutes les tumeurs EBV positives testées affichées CDKN2A
(p16INK4a
) promoteur hypermethylation mais manquaient de MLH1 de hypermethylation la caractéristique de MSI-associé PSEC.
en ce qui concerne CIN caractérisée par des modifications du nombre de copies dans les chromosomes, Deng et al. analyse génomique à haute résolution utilisée pour le profil somatiques altérations du nombre de copies dans un panel de 233 cancers gastriques (tumeurs primaires et des lignées de cellules) et 98 tissus non malignes gastriques appariés. En ce qui concerne les régions chromosomiques larges, la région la plus fréquemment amplifié inclus chromosomes 1q, 5p, 6p, 7p, 7q, 8q, 13q, 19p, 20p et 20q, et les régions les plus fréquemment supprimés inclus chromosomes 3p, 4p, 4q, 5q, 6q , 9p, 14q, 18q et 21q [13].
régions chromosomiques fréquemment supprimés sont généralement caractérisés par une perte d'hétérozygotie (LOH) et suggèrent la présence de suppresseurs gènes de tumeur [14, 15]. LOH sur le chromosome 18q21 se trouve dans 30-71% des cancers gastriques [13, 16-18], et DPC4
(Smad4
) /DCC
ont été postulé pour être les principales cibles. DPC4
(Smad4
), un gène suppresseur de tumeur, présentant des mutations fréquentes accompagnées LOH dans environ 20% des cancers du pancréas [19], mais aucune mutation n'a été signalé dans les cancers gastriques [20]. En revanche, peu d'études ont porté sur les modifications génétiques de CDC, et son statut génétique /épigénétique reste encore pratiquement inexploré dans le cancer gastrique, en partie à cause de la longueur et de la complexité de ce gène [21]. Fait intéressant, des études récentes ont démontré que CDC ainsi que UNC5C servent de récepteurs à dépendance de la nétrine-1, ainsi, renforcer leur rôle potentiel en tant tumoraux suppresseurs dans les cancers humains [22-25].
Récepteurs DCC sont répartis le long de la longueur de l'épithélium de l'intestin, alors que la nétrine-1 est exprimé de manière différentielle, en formant un gradient dans le tractus gastro-intestinal [24]. Une concentration élevée de la nétrine-1 est présent à la base de la crypte où les cellules souches et les cellules d'amplification transitoires résident. En revanche, une faible concentration de la nétrine-1 existe à la pointe des villosités, où de nombreuses cellules sont en cours de l'apoptose et desquamation-off. Ce nétrine-1 gradient a été examinée plus en utilisant des souris transgéniques pour déterminer si la nétrine-1 est responsable de la régulation de l'apoptose induite par DCC dans l'épithélium intestinal [24]. L'étude menée par Mazelin et al. a indiqué que la surexpression de la nétrine-1 a provoqué une diminution de la mort cellulaire epitheliale intestinale, alors on a observé aucune augmentation de la prolifération et la différenciation des cellules. En revanche, les souris nouveau-né nétrine-1-mutant exposé a augmenté la mort cellulaire. Pris ensemble, ces données étayent le concept selon lequel la nétrine-1 régule l'apoptose par le récepteur DCC-dépendance de l'intestin. Cependant, la nétrine-1 est peu susceptible d'être un régulateur direct de l'homéostasie intestinale, étant donné que l'organisation epitheliale normale ne soit pas perturbée par la surexpression de la nétrine-1 [24]. Le plus similaire aux récepteurs de DCC, d'autres récepteurs de la nétrine-1, y compris UNC5A, UNC5B et UNC5C, ont été également découvert que des gènes suppresseurs de tumeurs putatifs dans diverses tumeurs, notamment le cancer gastrique [26, 27]. En particulier, une double régulation négative de l'expression UNC5C par rapport aux tissus normaux correspondants a été observée dans environ 70% des cas de cancer gastrique [26]. Cette région est située à 4q21-23, qui est souvent un site de deletion dans le cancer gastrique, et est associée à une inactivation du gène épigénétique, comme la méthylation du promoteur [26-28].
Dans cette étude, nous avons émis l'hypothèse que la régulation négative de DCC et UNC5C joue une fonction de régulation de croissance important dans la tumorigenèse gastrique, ce qui nous nous sommes adressés en enquêtant sur un panel de lignées cellulaires de cancer gastrique et les échantillons cliniques provenant de patients atteints de cancer gastrique. Ici, nous déclarons que la majorité des cancers gastriques montrent la perte des deux nétrine-1 récepteurs. Nous fournissons également des données suggérant que l'inactivation de ces récepteurs est à médiation par des mécanismes génétiques et épigénétiques. Caractéristiques: Résultats cumulatifs défauts dans ces deux récepteurs à dépendance sont associés de façon significative avec le phénotype CIN, soulignant l'importance de ces nouvelles découvertes et cette voie réglementaire de croissance dans la carcinogenèse gastrique. de de patients atteints de cancer gastrique
98 cancer gastrique patients, 34 patients étaient des femmes (35%), et 48 tumeurs ont été diagnostiqués comme pathologiquement différenciés (49%) (tableau 1). En ce qui concerne le stade TNM, 18, 29, 37, et 14 patients atteints d'un cancer de l'estomac ont été classés dans la phase I, II, III et IV, respectivement. Par des analyses génétiques de la tumeur, 13 cancers gastriques ont été classés comme affichant l'instabilité des microsatellites (MSI; 13%). Le ratio moyen de LOH des 98 tumeurs était de 0,24 (écart-type (SD), ± 0,3) .Table 1 Caractéristiques des Caractéristiques
Pourcentage de patients atteints de cancer gastrique (n °)
Age
L'âge moyen (SD)
65.1 (11.8)
sexes femelle
35 (34)
Homme
65 (64)
histologie
Diff
49 (48)
Undiff
51 (50)
Stage
IA /IB
18 (18)
IIA /IIB
30 (29)
IIIA /IIIB /IIIC
38 (37)
IV
14 (14)
T
T1a /1b
14 (14)
T2
14 (14 )
T3
28 (27)
T4a /4b
44 (43)
N
N0
27 (26)
N1
35 (34 )
N2
24 (24)
N3
14 (14)
métastases à distance
négatif 86 (84)
positive
14 (14)
MSI MSI

13 (13)
non-MSI 87 (85) Ratio
LOH
moyenne Ratio
(SD)
0,24 (0,3 )
CIN
51 (50)
négatif
47 (46)
Non
informative 2 (2)
KRAS
Mutant
positif
5 (5)
Wild
95 (93)
BRAF
Mutant
0 (0)
Wild
100 (98)
PIK3CA
Mutant
4 (3)
Wild
96 (94)
H.pyroli
71 (70)
négatif
positif 29 (28)
CIN phénotype a été classé en calculant le rapport de LOH des marqueurs informatifs des sept séquences microsatellites polymorphes, indépendamment de la 4q et 18q loci. Lorsqu'une tumeur a montré un taux de LOH supérieur à 0, la tumeur a été classée en tant que CIN positif. Selon ce critère, 50/98 tumeurs (51%) ont été classés comme CIN-positif.
Le séquençage direct des spécimens de cancer gastrique ont révélé la proportion de KRAS
, BRAF
et PIK3CA de les mutations (tableau 1). Des mutations ont été détectées dans le KRAS
codon 12 (5%, N
= 5/98) et le codon 13 (1%, N
= 1/98); BRAF
codon 600 (0%, N
= 0/98); PIK3CA
codon 545 (1%, N
= 1/98); et codon 1047 (3%, N
= 3/98). KRAS
codon 12 mutations comprenaient G12D (35G à A, N
= 4) et G12R (34G à C, N
= 1), et le codon 13 mutations comprenaient G13D (38G A, N
= 1). Fait intéressant, une tumeur affichée tant KRAS
codon 12 et 13 mutations (fichier supplémentaire 1: Figure S1A). exon 9 mutations E545K composé de la PIK3CA (1633G A, N
= 1), tandis que l'exon 20 mutations comprennent H1047R (3140A à G, N
= 3). En outre, nous avons déterminé le statut d'infection de H. pylori
en récupérant le génotype de l'cagA (fichier additionnel 1: Figure S1B). Grâce à cette analyse, nous avons pu récupérer la séquence du cagA à partir de 70 tissus de cancer gastrique (71%).
État de méthylation du DCC
dans des échantillons de cancer de l'estomac et de l'association avec des caractéristiques clinico
Nous avons étudié DCC
statut de méthylation dans 98 cancers gastriques et 105 échantillons de muqueuse gastrique normale. Localisation du gène de la CDC et les résultats d'un panel de restriction bisulfite combinée représentant les analyses (COBRA) sont représentés sur la Fig. 1a-b; ces résultats ont été analysés comme des variables continues (Fig. 1c). Nous avons constaté que les cancers gastriques 56/98 (57%) et 31/105 échantillons de muqueuse gastrique normale (29,5%) affichent plus de 1,0% dans la méthylation du promoteur du DCC. Le niveau moyen de la méthylation était de 18,3% [95% d'intervalle de confiance (IC), de 14,5 à 22,2%] chez les tissus gastriques de cancer qui présentaient plus de 1,0% méthylation dans le promoteur du DCC et de 4,9% (IC à 95%, de 3,3 à 6,5% ) dans les échantillons gastriques normaux correspondants de la muqueuse qui présentaient plus de 1,0% méthylation (P
< 0,0001, Wilcoxon /Kruskal-Wallis test;. la figure 1c-d). Par conséquent, nous avons défini la méthylation d'un DCC de 5% ou plus comme une variable continue (ie, > 5,0% méthylation a été définie comme la méthylation positive (méthylé) et < 5,0% méthylation méthylation négatif (méthylé)) . En utilisant ce critère, nous avons observé des cas méthylés de CDC dans 44/98 cancers gastriques (45%) et 9/105 muqueuse gastrique normale (9%). Figue. 1 méthylation du promoteur et 18q LOH de CDC analyse. (A) Représentation schématique de l'emplacement des trois sondes LOH et les régions du promoteur du gène DCC de dans le chromosome 18. La ligne rouge représente
le gène DCC.
Gray et carrés noirs
représentent les régions non traduites et l'exon de codage 1, respectivement; flèches sur les places
indiquent les sites de départ de transcription;
lignes verticales indiquent les sites CpG;
diamants blancs représentent les sites de restriction pour Hhal; lignes horizontales épaisses
représentent les emplacements des produits COBRA; flèches sur les lignes horizontales épaisses
désignent des amorces COBRA. (B) Les résultats représentatifs de COBRA de DCC. Les flèches indiquent
allèles méthylés; M
dénote la méthylation; U
désigne méthylation; Mc
désigne le contrôle méthylé; SM
désigne le marqueur de taille. (c) Les résultats de CDC de la méthylation comme une variable continue. Dans les diagrammes boîte de tracé, la ligne horizontale
dans chaque case représente la médiane, les limites
de chaque boîte représentent les intervalles interquartiles, et les moustaches
sont les valeurs maximales et minimales. Chaque barre
vert représente la moyenne. NM
dénote la muqueuse normale. T
désigne une tumeur. (D) la fréquence de méthylation de la positivité du cancer et des tissus normaux en fonction de différents seuils. (E) de DCC les niveaux d'expression d'ARNm et de l'état de méthylation dans 10 lignées cellulaires de cancer gastrique et une lignée cellulaire de fibroblastes de poumon humain. L'expression de l'ARNm de CDC est observée (ACt inférieur) dans des lignées de cellules GCIY et NHLH. DW désigne l'eau distillée
Ensuite, nous avons étudié l'association entre le promoteur de la méthylation de CDC et diverses caractéristiques clinicopathologiques et génétiques. le statut de méthylation de CDC était significativement associée avec le statut MSI. les cancers gastriques MSI-positifs ont été significativement plus fréquemment associés aux CDC de la méthylation avec du DCC que de la méthylation (6 vs 23%, p = 0,013
; tableau 2). Il n'y avait aucune association significative entre le statut de méthylation de CDC et tout autre 2 Association variables.Table entre les altérations épigénétiques /génétiques du gène DCC et les caractéristiques clinico dans les cancers gastriques
DCC
méthylation Status-% ( No.)
18q LOH Status-% (n)
DCC
Altération Status-% (n °)
méthylation
méthylation
P
Non informative
négatif

P positive
Non informative
négative positive

positive
P
total
méthylation seul

LOH seul
deux
(n = 54
)
(n = 44
)
(n
= 15)
(n = 47
)
(n = 36
)
(n = 15
)

(n = 25
)
(n = 58
)
(n = 22
)
(n = 19
)
(n = 17
)
âge
âge (SD)
63,6 (12,5)
67,0 (moyenne 10,7)
0.48a
68,9 (11,4)
64,8 (11,4)
63,9 (12,4)
0.76a
68,9 (11,4)
63,5 (12,9)
64,8 (11,3) 66,3
(9,5)
60,7 (12,7)
67,4 (11,4)
0.98a
sexes femelle
39 (21)
30 (13)
0.33b
40 (6)
38 (18)
28 (10)
0.32b
40 (6)
44 (11)
29 (17) 32
(7)
32 (6)
24 (4) Homme
0.19b
61 (23)
70 (31)
60 (9)
62 (29)
72 (26)
60 (9)
56 (14)
71 (41)
68 (15)
68 (13) 76
(13)
histologie
Diff
41 (22)
59 (26)
0.071b
47 (7)
55 (26)
42 (15 )
0.22b
47 (7)
52 (13)
48 (28)
59 (13)
32 (6)
53 (9)
076B
Undiff
59 (32)
41 (18)
53 (8)
45 (21)
58 (21)
53 (8)
48 (12)
52 (30)
41 (9)
68 (13)
47 (8)
Stage
IA /IB
20 (11)
16 (7)
0.83b
13 (2)
19 (9)
19 (7)
0.15b
13 (2)
24 ( 6)
17 (10)
14 (3)
21 (4)
18 (3)
0.70b
IIA /IIB
26 (14)
34 (15)
27 (4)
30 (14)
31 (11)
27 (4)
24 (6)
33 (19)
36 (8)
32 (6)
29 (5)
IIIA /IIIB /IIC
39 (21)
36 (16)
53 (8)
43 (20)
25 (9)
53 (8)
40 (10)
33 (19)
45 (10)
26 (5)
24 (4)
IV
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
T
T1a /1b
15 (8 )
14 (6)
0.24b
7 (1)
17 (8)
14 (5)
0.94b
7 (1)
16 (4)
16 (9)
18 (4)
21 (4)
6 (1)
0.54b
T2
13 (7)
16 (7)
13 (2)
15 (7)
14 (5)
13 (2)
16 (4)
14 (8) 14
(3)
11 (2)
18 (3)
T3
20 (11)
36 (16)
33 (5)
28 (13)
25 (9)
33 (5)
16 (4)
31 (18)
41 (9)
16 (3)
35 (6)
T4a /b
52 (28)
34 (15)
47 (7)
40 (19)
47 (17)
47 (7) 52
(13)
40 (23)
27 (6)
53 (10)
41 (7)
N
N0
30 (16) 23
(10)
0.66b
20 (3) Le plus 28 (13)
28 (10)
0.29b
20 (3)
32 (8)
26 (15)
23 (5)
32 (6)
24 (4)
0.19b
N1
37 (20)
32 (14)
47 (7)
38 (18)
25 (9)
47 (7)
44 (11)
28 (16)
32 (7)
26 (5)
24 (4)
N2
20 (11)
30 (13)
20 (3)
26 (12)
25 (9 )
20 (3)
20 (5)
28 (16)
32 (7)
21 (4)
29 (5)
N3
13 (7)
16 (7)
13 (2)
9 (4)
22 (8)
13 (2)
4 (1)
19 (11)
14 (3)
21 (4)
24 (4)
métastases à distance
négatif
85 (46)
86 (38)
0.87b
93 (14)
91 (43)
75 (27)
0.041b
93 (14)
88 (22)
83 (48)
95 (21)
79 (15)
71 (12)
0.55b
positive
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9)
7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
statut MSI MSI

6 (3)
23 (10)
0.013b ​​
33 (5)
9 (4)
11 (4)
0.69b
33 (5)
4 (1)
12 (7)
14 (3)
0 (0)
24 ( 4)
non-MSI de 0.25b
94 (51)
77 (34)
67 (10)
91 (43)
89 (32)
67 (10)
96 (24)
88 (51)
86 (19)
100 (19)
76 (13)
rapport LOH
rapport moyen (SD)
0,23 (0,30)
0,26 (0,31)
suivante: 0,55
0,22 (0,29)
0,10 (0,15)
0,44 (0,36)
< 0.0001a
0,22 (0,29)
0,05 (0,10)
0,33 (0,33)
0,16 (0,18)
0,44 (0,34)
0,44 (0,39)
< 0.0001a
CIN *
positif
46 (25)
57 (25)
0.39b
47 (7)
38 (18)
74 (25)
0.0017b
47 (7)
24 (6)
66 (37)
55 (12)
76 (13)
71 (12)
0.0005b
négatif 54 (27)
43 (19)
53 (8)
62 (29)
26 (9)
53 (8) 76
(19)
34 (19)
45 (10)
24 (4)
29 (5)
KRAS
/BRAF
/PIK3CA


Mutant 6 (3)
11 (5)
0.30b
27 (4)
6 (3)
3 (1)
0.45b
27 (4)
4 (1)
5 (3)
9 (2)
5 (1)
0 (0)
0.82b
sauvage
94 (51)
89 (38)
73 (11)
94 (44)
97 (35)
73 (11)
96 (24)
95 (55)
91 (20)
95 (18)
100 (17)
H.pyroli
positive
72 (39)
70 (31)
0.85b
80 (12)
66 (31)
75 (27)
0.37b
80 (12)
60 (15)
74 (43 )
73 (16)
79 (15)
71 (12)
0.20b
négatif 28 (15)
30 (13)
20 ( 3)
34 (16)
25 (9)
20 (3)
40 (10)
26 (15)
27 (6)
21 (4 )
29 (5)
* Deux cas ne sont pas d'information de l'état CIN
une valeur P de
ont été calculées entre méthylation et la méthylation, 18qLOH négative et positive, et DCC modification négative et positive (total) par Wilcoxon /Kruskal-Wallis test
b P
valeurs ont été calculées entre méthylation et la méthylation, 18qLOH modification négative et positive, et DCC négatif et positif (total) par le test du chi carré de Piason
LOH 18q de locus associé à CIN phénotype dans le cancer gastrique
Parmi les cas d'information, les fréquences de 18q LOH à chaque marqueur microsatellite étaient 14/41 (24%) à D18S35, 17/55 (31%) à D18S69, et 21/58 (36 %) à D18S58 (l'emplacement de chaque fabricant est représenté sur la Fig. 1a). Tumeurs montrant LOH à tous les trois, deux, et seulement un des trois marqueurs microsatellites étaient 4 (4,8%), 9 (11%), et 23 (28%) des 83 cas d'information parmi les 98 cancers gastriques primaires, respectivement. Tumeurs montrant LOH dans au moins un des trois marqueurs microsatellites pour 18q LOH ont été classés comme 18q LOH-positive. Selon ce critère, les cancers 18q LOH-positives ont été détectées chez 36 (43%) des 83 cas d'information parmi les 98 cancers gastriques primaires (tableau 2).
De même que pour le DCC de l'état de méthylation, nous avons étudié les associations entre LOH 18q statut et diverses caractéristiques clinicopathologiques et génétiques. Parmi les cas d'information, la fréquence du cancer gastrique avec métastases à distance était plus élevée dans les cancers gastriques 18q LOH-positifs par rapport à 18q cancers de LOH-négatif (25 contre 9%, P = 0,041
; Tableau 2). Les ratios LOH calculés pour les sept autres loci étaient également significativement plus élevé pour 18q LOH positif que pour 18q tumeurs LOH-négatif (0,44 vs 0,10, P
< 0001; tableau 2). D'après ces résultats, lorsqu'une tumeur a montré un taux de LOH supérieur à 0, la tumeur a été classée en tant que CIN positif. En outre, les cancers gastriques CIN-positifs qui étaient également 18q LOH positifs étaient beaucoup plus abondants que ceux qui étaient 18q LOH-négatif (74 vs 38%, P = 0,0017
; tableau 2). Des études antérieures ont démontré que la perte 18q est couramment observée dans les cancers colorectaux, et sa fréquence est en corrélation avec le phénotype CIN, mais inversement corrélée avec le phénotype MSI [29, 30]. Comme notre étude et une autre étude a démontré, ce phénomène a également été reproduit pour les cancers gastriques [18] Expression et de la méthylation de l'état de DCC
dans des lignées cellulaires de cancer gastrique de.
Pour évaluer les associations entre le statut d'expression de DCC et des altérations épigénétiques dans le gène de la DCC, nous avons examiné l'ARN messager (ARNm) niveaux par transcription inverse réaction en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR) en utilisant un ensemble d'amorces précédemment décrites [31] et examiné les associations entre DCC de l'expression et CpG état de méthylation du DCC de la région de promoteur dans 10 lignées gastriques de cellules cancéreuses (MKN7, N87, MKN74, MKN45, NUGC-2, NUGC-3, NUGC-4, GCIY, OGUM-1 et MKN1) et une normale poumon lignée cellulaire de fibroblastes (NHLF). Toutes les lignées cellulaires, à l'exception MKN74, GCIY, OGUM-1, MKN1 et les cellules NHLF, ont montré une diminution de l'expression des transcrits de gènes de CDC, ainsi que leurs promoteurs ont été méthylés (Fig. 1E). D'autre part, bien que trois lignées cellulaires, N87, Ogum-1, et MKN1 a montré diminution de l'expression des transcrits de gènes de CDC, CDC de promoteurs dans ces cellules ne sont pas méthylés par COBRA. Parmi les 10 lignées cellulaires de cancer gastrique, seule la lignée cellulaire GCIY exprimé DCC de transcriptions au même niveau que les cellules NHLF, mais son promoteur était méthylé. Lorsque nous avons classé une lignée cellulaire montrant aΔC T de plus de 15,0 comme l'expression négative et d'une lignée cellulaire avec aΔC T de DCC de 15,0 ou moins comme expression positive, seule la GCIY de CDC lignée cellulaire pourrait être classé comme DCC de l'expression positive parmi les sept gastriques lignées cellulaires de cancer avec DCC de la méthylation; La réduction de cette constatation était statistiquement non significatif. d'expression DCC exige Next altérations génétiques et épigénétiques, nous avons étudié l'association entre CDC expression des protéines et des altérations génétiques et épigénétiques dans le gène DCC dans 86 cancer de l'estomac spécimens. Des exemples représentatifs des résultats immunohistochimie (IHC) de coloration sont présentés sur la Fig. 2a-c. Nous avons classé les tumeurs dans les trois groupes suivants en fonction des résultats IHC analysés comme une variable catégorique: perte complète d'expression DCC (. 8 cas, 9%; la figure 2a), la perte focale de l'expression DCC (38 cas, 44%; Fig. 2b), et une expression positive de la protéine DCC (40 cas, 47%;. la figure 2c). Parmi 86 cancers gastriques, 46 cas (53%) affiché une expression réduite DCC. Une étude précédente a rapporté que l'expression réduite DCC a été observée dans un total de 38% des cancers gastriques, et les tumeurs stade T1-T2 a maintenu une expression positive DCC alors qu'elle a été abolie dans les tumeurs T3 [32]. Cette constatation est également reproductible dans cette étude (fichier complémentaire 2: Figure S2). Figue. 2 DCC
méthylation du promoteur et immunohistochimie analyses. analyse immunohistochimique pour DCC
(a-c). Les noyaux des cellules cancéreuses sont totalement négativement (a), focalement négativement (b) et positive (c) tachée. (D) d'association entre la modification génétique /épigénétique et Next de CDC de l'expression, nous avons examiné les associations entre les altérations génétiques et épigénétiques et DCC statut d'expression. Sept des 8 cas avec perte totale, 33 des 38 cas avec une perte focale et 34 de 40 cas avec expression positive DCC étaient instructifs pour la méthylation du promoteur et 18q la LOH de deux DCC. Nous avons constaté que, parmi les cancers avec une perte complète d'expression DCC, 5/7 des cancers (71%) a démontré à la fois la méthylation du promoteur et 18q LOH
DCC. En revanche, les cancers 8/33 (24%) ont montré une perte focale de l'expression DCC et à la fois la méthylation et Loh, les cancers 5/33 (15%) présentaient LOH seul, et les cancers 12/33 (36%) affichent méthylation seul. Parmi les cancers qui étaient positifs pour l'expression DCC, seulement 2/34 cancers (6%) ont démontré à la fois la méthylation et LOH, 13/34 (38%) des cancers Loh seul, et 8/34 cancers (24%) méthylation seul (cancers montrant à la fois la méthylation et 18q la LOH de CDC contre les autres, P = 0,0048
, le test du chi carré de Pearson;. la figure 2d). Nos données suggèrent qu'une réduction de l'expression de DCC peut nécessiter une méthylation dense dans les CpG du promoteur et du locus LOH 18q, selon la théorie des deux coup [33].
Association entre les caractéristiques clinico-pathologiques et des altérations génétiques /épigénétiques de CDC
dans le cancer gastrique
Depuis des modifications à la fois épigénétiques et génétiques sont essentielles à la suppression DCC, nous avons étudié la relation entre épigénétique et altérations génétiques dans le gène DCC avec différentes caractéristiques clinico. De 98 cancers gastriques, 15 cancers ont été classés comme non-informative, 25 cancers ont été classés comme négatifs pour CDC de les altérations, et 58 cancers ont été classés comme positif pour CDC de les modifications. Parmi les caractéristiques clinico, le ratio de LOH et la distribution de phénotype CIN différaient significativement entre les cancers négatifs et positifs pour DCC de les modifications (tableau 2).
Parmi les 58 cancers avec DCC de les altérations, 17 tumeurs ont montré des altérations dans les deux DCC
méthylation et 18q LOH, 19 avait 18q LOH seul, et 22 cancers exposés DCC de la méthylation seul. Le ratio de LOH calculé pour les sept autres loci était significativement plus élevée dans les cancers gastriques avec la méthylation de deux DCC et 18q LOH (moyenne LOH ratio 0,44; SD ± 0,39) et dans les cancers avec 18q LOH seul (moyenne LOH ratio 0,44; SD ± 0,34), intermédiaire dans les cancers avec DCC de la méthylation seul (moyenne LOH rapport, 0,16; SD ± 0,18), et le plus bas dans les cancers négatifs pour CDC de les altérations (moyenne LOH rapport, 0,05; SD ± 0,10; P
< 0,0001, Wilcoxon /test de Kruskal-Wallis). Lorsque nous avons classé les cancers gastriques avec des rapports LOH supérieur à 0 comme CIN-positif, 12/17 cancers gastriques (71%) avec la méthylation et 18q LOH de deux DCC, 13/17 cancers gastriques (76%) avec 18q LOH seul, Figue. Figue. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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