alterazioni genetiche ed epigenetiche di netrina-1 recettori nel carcinoma gastrico con instabilità cromosomica

alterazioni genetiche ed epigenetiche di netrina-1 recettori nel carcinoma gastrico con instabilità cromosomica
Abstract
sfondo
Le espressioni dei geni dei recettori netrina-1 dipendenza, DCC Comprare e vendere UNC5C, sono spesso inibiti in molti tipi di cancro. Abbiamo ipotizzato che sottoregolazione di DCC e UNC5C ha un'importante funzione regolatrice della crescita nella tumorigenesi gastrica.
Risultati
Nel presente studio, una serie di analisi genetiche ed epigenetiche per DCC
e UNC5C
sono state eseguite in una coorte giapponese di 98 tumori gastrici sporadici e normali campioni di mucosa gastrica corrispondenti. La perdita di eterozigosi (LOH) analizza e instabilità dei microsatelliti (MSI) analisi è stata applicata per determinare instabilità cromosomica (CIN) e fenotipi MSI, rispettivamente. Più del 5% metilazione nel
DCC e UNC5C
promotori sono stati trovati nel 45% (44/98) e 32% (31/98) tumori gastrici, rispettivamente, e nel 9% (9/105) e 5% (5/105) normale mucosa gastrica, rispettivamente. Nel complesso, il 70% (58 su 83 casi informativi) e il 51% (40 su 79 casi informativi) di tumori gastrici nutriti sia LOH o metilazione aberrante nella
DCC e UNC5C
geni, rispettivamente. In totale, il 77% (51 su 66 casi informativi) di tumori gastrici ha mostrato difetti cumulativi in ​​questi due recettori dipendenza e sono stati significativamente associato con instabilità cromosomica. Sia DCC e UNC5C sono stati inattivati ​​nel 97% dei tumori gastrici CIN-positivi e nel 55% dei tumori gastrici CIN-negativi.
Conclusioni
difetto nei recettori netrina è una caratteristica comune nei tumori gastrici. DCC
alterazioni sono evidenti nelle fasi iniziali, e UNC5C
alterazioni degenerare con la progressione della malattia, suggerendo che le alterazioni cumulativi di netrina-1 recettori è stato un evento di ritardo nella progressione del cancro gastrico e sottolineando l'importanza di questo la crescita percorso normativo nella carcinogenesi gastrica.
Parole
cancro gastrico metilazione instabilità cromosomica DCC
UNC5C
Netrin-1 recettori Sfondo
stime globali di incidenza del cancro rango cancro gastrico come la quarta neoplasia più comune e la seconda causa più comune di decessi correlati al cancro in tutto il mondo [1]. cancro gastrico è una malattia eterogenea con molteplici eziologie ambientali e percorsi alternativi di carcinogenesi [2, 3]. Uno dei principali fattori di rischio eziologici per cancro gastrico Helicobacter pylori è
(H. pylori
) l'infezione. I rapporti precedenti hanno indicato un tasso di infezione 93,1-100% per H. pylori
in pazienti con cancro gastrico, mentre solo il 1,2-2,8% degli individui infettati da H. pylori
sviluppare il cancro gastrico [4-7].
le attuali conoscenze sui meccanismi molecolari alla base carcinogenesi gastrica indica uno principale via di instabilità epigenetica e due vie principali di instabilità genetica [8]. La principale via instabilità epigenetica è definito come il CpG isola methylator fenotipo (CIMP), che è stata inizialmente descritta nel cancro del colon-retto e anche osservato in un sottogruppo di tumori gastrici e che ospita un grado critico del aberrante ipermetilazione promotore associato con silenziamento trascrizionale di tumore multiplo geni soppressori [9, 10]. I due principali vie di instabilità genetica includono instabilità dei microsatelliti (MSI) e instabilità cromosomica (CIN) [8]. MSI è definita come la presenza di errori di replica in semplici sequenze microsatelliti ripetitive causati da mismatch repair (MMR) carenze. Uno è la sindrome di Lynch causata da mutazioni germinali nei geni MMR e un altro è sporadica MSI causato principalmente da ipermetilazione del promotore nel MLH1
gene [10, 11]. D'altra parte, CIN, che è caratterizzata da alterazioni cromosomiche-sia qualitativa o quantitativa-è un percorso più comune che può comprendere clinicopathologically e tumori eterogenei molecolarmente [8].
Il Genome Atlas Network Cancer Research recentemente diviso in tumori gastrici quattro sottotipi [12]. I tumori sono stati classificati dal virus di Epstein-Barr (EBV) -positivity (9%), poi da MSI-alto status, di seguito chiamato MSI-positivi (22%), e le restanti tumori sono stati classificati per grado di aneuploidie in quelle definito genomicamente stabile (20%) o che manifestano CIN (50%). tumori EBV-positivo così come i tumori MSI-positivi erano conosciuti a raggrupparsi ciascuna per conto suo, esibendo estrema CIMP. Le differenze tra i profili di metilazione gastrico-CIMP EBV-CIMP e MSI-associati sono esemplificate dal fatto che tutti i tumori EBV-positivo analizzati visualizzati CDKN2A
(p16INK4A
) ipermetilazione del promotore, ma mancava la MLH1
ipermetilazione caratteristico MSI-associato CIMP.
per quanto riguarda CIN caratterizzato da variazioni del numero di copie di cromosomi, Deng et al. Usato analisi genomica alta risoluzione al profilo somatiche alterazioni del numero di copie in un pannello di 233 tumori gastrici (tumori primari e linee cellulari) e 98 abbinati tessuti non maligni gastrici. Per quanto riguarda ampie regioni cromosomiche, la regione più frequentemente amplificata incluso cromosomi 1q, 5p, 6p, 7p, 7q, 8q, 13q, 19p, 20p e 20q, e le regioni più frequentemente cancellato incluso cromosomi 3p, 4p, 4q, 5q, 6q , 9p, 14q, 18q e 21q [13].
regioni cromosomiche cancellati frequenti sono generalmente caratterizzati da perdita di eterozigosi (LOH) e suggeriscono la presenza di geni oncosoppressori [14, 15]. LOH sul cromosoma 18q21 è trovato in 30-71% dei tumori gastrici [13, 16-18], e DPC4
(Smad4
) /DCC
sono state postulate essere i principali obiettivi. DPC4
(Smad4
), un gene soppressore del tumore, presenta mutazioni frequenti accompagnate da LOH in circa il 20% dei tumori pancreatici [19], ma nessuna mutazione sono stati riportati in tumori gastrici [20]. Al contrario, pochi studi si sono concentrati su DCC
alterazioni del gene, e la sua genetica /stato epigenetico rimane ancora praticamente inesplorato nel carcinoma gastrico, in parte a causa della lunghezza e la complessità di questo gene [21]. È interessante notare che recenti studi hanno dimostrato che DCC così come UNC5C fungono da recettori dipendenza per netrina-1, in tal modo, rafforzando il loro ruolo potenziale come tumore-soppressori di tumori umani [22-25].
Recettori DCC sono distribuiti lungo la lunghezza dell'epitelio nell'intestino, mentre netrina-1 è differenzialmente espressi, formando un gradiente nel tratto gastrointestinale [24]. Un'elevata concentrazione di netrina-1 è presente alla base cripta dove le cellule staminali e cellule amplificazione transitori risiedono. Per contro, una bassa concentrazione di netrina-1 esiste sulla punta dei villi, dove molte cellule subiscono apoptosi e desquamazione-off. Questo netrina-1 gradiente è stato esaminato ulteriormente usando topi transgenici per determinare se netrina-1 è responsabile della regolazione dell'apoptosi DCC-indotta a livello dell'epitelio intestinale [24]. Lo studio di Mazelin et al. ha indicato che netrin-1 sovraespressione causato una diminuzione nella morte delle cellule epiteliali intestinali, che è stato osservato alcun aumento nella proliferazione e differenziazione delle cellule. Al contrario, netrina-1-mutante topi neonati esibivano aumentata morte cellulare. Presi insieme, questi dati supportano il concetto che netrin-1 regola l'apoptosi attraverso il recettore DCC-dipendenza a livello intestinale. Tuttavia, netrina-1 è improbabile che sia un regolatore diretto di omeostasi intestinale, dato che la normale organizzazione epiteliale non viene interrotto da netrina-1 sovraespressione [24].
Simile ai recettori DCC, altri netrina-1 recettori, tra cui UNC5A, UNC5B, e UNC5C, sono stati scoperti come putativi geni soppressori tumorali in diversi tumori, tra cui il cancro gastrico [26, 27]. In particolare, un duplice downregulation di espressione UNC5C confrontati con i corrispondenti tessuti normali è stata osservata in circa il 70% dei casi di cancro gastrico [26]. Questa regione si trova a 4q21-23, che è spesso un luogo di delezione nel cancro gastrico ed è associato con epigenetica inattivazione del gene, come ad esempio metilazione del promotore [26-28].
In questo studio, abbiamo ipotizzato che sottoregolazione di DCC e UNC5C svolge un importante funzione regolatrice della crescita nella tumorigenesi gastrico, che abbiamo affrontato attraverso lo studio di un gruppo di linee di cellule di cancro gastrico e campioni clinici di pazienti con cancro gastrico. Qui, si segnala che la maggior parte dei tumori gastrici mostrano perdita di entrambi netrina-1 recettori. Forniamo anche i dati che suggeriscono che l'inattivazione di questi recettori è mediata attraverso entrambi i meccanismi genetici ed epigenetici. difetti cumulativi in ​​questi due recettori dipendenza sono significativamente associati con il fenotipo CIN, sottolineando l'importanza di queste nuove scoperte e questa crescita percorso normativo nella carcinogenesi gastrica.
Risultati
Caratteristiche dei pazienti affetti da cancro gastrico
di 98 cancro gastrico pazienti, 34 pazienti erano di sesso femminile (35%), e 48 tumori sono stati patologicamente diagnosticati come differenziata (49%) (Tabella 1). Per quanto riguarda la fase TNM, 18, 29, 37, e 14 pazienti affetti da cancro gastrico sono stati classificati come stadio I, II, III, e IV, rispettivamente. Con tumorali analisi genetiche, 13 tumori gastrici sono stati classificati come la visualizzazione di instabilità dei microsatelliti (MSI; 13%). Il rapporto medio LOH dei 98 tumori era 0,24 (deviazione standard (SD), ± 0.3) .table 1 Caratteristiche del cancro gastrico pazienti
Caratteristica
percentuale (n)
Età
L'età media (SD)
65,1 (11,8)
genere
Femminile
35 (34)
Maschio
65 (64)
Istologia
Diff
49 (48)
Undiff
51 (50)
fase
IA /IB
18 (18)
IIA /IIB
30 (29)
IIIA /IIIB /IIIC
38 (37)
IV
14 (14)
T
T1a /1b
14 (14)
T2
14 (14 )
T3
28 (27)
T4a /4b
44 (43)
N
N0
27 (26)
N1
35 (34 )
N2
24 (24)
N3
14 (14)
metastasi a distanza
negativo 86 (84)
positivo
14 (14)
MSI
MSI
13 (13)
non MSI-
87 (85) Rapporto
LOH
rapporto medio (SD)
0,24 (0,3 )
CIN
positivo
51 (50)
negativo
47 (46)
Non
informativo 2 (2)
KRAS
Mutant
5 (5)
selvaggio
95 (93)
BRAF
Mutant
0 (0)
selvaggio
100 (98)
PIK3CA
Mutant
4 (3)
selvaggio
96 (94)
H.pyroli
positivo
71 (70)
negativo
29 (28)
CIN fenotipo è stato classificato calcolando il rapporto LOH dei marcatori informativi delle sette sequenze microsatelliti polimorfici, indipendentemente dalla 4q e 18q loci. Quando un tumore mostrava un rapporto LOH maggiore di 0, il tumore è stato classificato come CIN-positive. Con questo criterio, 50/98 tumori (51%) sono stati classificati come CIN-positivo.
Sequenziamento diretto di campioni di cancro gastrico hanno rivelato la percentuale di KRAS
, BRAF
, e PIK3CA
mutazioni (Tabella 1). Le mutazioni sono state rilevate nel KRAS
codone 12 (5%, N
= 5/98) e codone 13 (1%, N
= 1/98); BRAF
codone 600 (0%, N
= 0/98); PIK3CA
codone 545 (1%, N
= 1/98); e codone 1047 (3%, N
= 3/98). KRAS
codone 12 mutazioni consistevano G12D (35G ad A, N
= 4) e G12R (34G di C, N
= 1), e codone 13 mutazioni incluse G13D (38G ad A, N
= 1). È interessante notare che un tumore KRAS visualizzata sia
codone 12 e 13 mutazioni (file aggiuntivo 1: Figura S1A). PIK3CA
esone 9 mutazioni E545K composto (1633G ad A, N
= 1), mentre esone 20 mutazioni composti H1047R (3140A a G, N
= 3). Inoltre, abbiamo determinato lo stato di infezione di H. pylori
recuperando il cagA
genotipo (sui file 1: Figura S1B). Attraverso questa analisi, si potrebbe recuperare l'cagA
sequenza dal 70 tessuti di cancro gastrico (71%). Stato
metilazione del DCC
in campioni di cancro gastrico ed associazioni con le caratteristiche clinico-patologici
Abbiamo studiato DCC
stato di metilazione in 98 tumori gastrici e 105 normali campioni di mucosa gastrica. Location della DCC
gene ed i risultati di un panel di rappresentante restrizione bisolfito combinato analisi (COBRA) sono raffigurati in Fig. 1a-b; questi risultati sono stati analizzati come variabili continue (Fig. 1c). Abbiamo scoperto che 56/98 tumori gastrici (57%) e 31/105 normali campioni di mucosa gastrica (29,5%) visualizzati più di 1,0% di metilazione nel DCC
promotore. Il livello medio di metilazione è stata del 18,3% [95% intervallo di confidenza (IC), 14,5-22,2%] tra i tessuti di cancro gastrico che mostravano più di 1,0% di metilazione nel DCC
promotore e del 4,9% (95% CI, 3,3-6,5% ) nei normali campioni di mucosa gastrica corrispondenti che mostravano più di 1,0% di metilazione (P
< 0,0001, Wilcoxon /Kruskal-Wallis prova; Fig. 1c-d). Pertanto, abbiamo definito un DCC
metilazione del 5% o più come una variabile continua (ad esempio, > 5,0% metilazione è stata definita come metilazione-positive (metilato) e < 5,0% metilazione come metilazione-negativi (non metilato)) . Utilizzando questo criterio, abbiamo osservato DCC
casi denaturato in 44/98 tumori gastrici (45%) e in 9/105 normale mucosa gastrica (9%). Figura. 1 analizza DCC
metilazione del promotore e 18q LOH. (A) Rappresentazione schematica della posizione dei tre sonde LOH e DCC
regioni gene promotore di cromosoma 18. La linea rossa indica la
DCC
gene.
Gray e quadrati neri rappresentano i
non tradotte e la esone codifica regioni 1, rispettivamente; frecce sulle piazze
indicano siti iniziali di trascrizione; linee verticali indicano
siti CpG; diamanti bianchi
rappresentano i siti di restrizione per HhaI; linee orizzontali di spessore
raffigurano le posizioni dei prodotti COBRA; frecce sulle linee orizzontali di spessore
denotare primer COBRA. (B) I risultati rappresentativi di Cobra di DCC. Le frecce indicano
alleli metilati; M
denota metilazione; U
denota unmethylation; Mc
denota il controllo denaturato; SM
denota il marcatore dimensioni. (c) I risultati di DCC
metilazione come una variabile continua. Nei diagrammi box plot, la linea orizzontale
all'interno di ogni casella rappresenta la mediana, i limiti
di ogni scatola rappresentano le distanze interquartiliche, ei baffi Quali sono i valori massimi e minimi. Ogni verde bar
rappresenta la media. NM
denota mucosa normale. T
denota tumore. (D) La frequenza di metilazione-positività del cancro e tessuti normali secondo differenti soglie. (E) DCC
livelli di espressione di mRNA e lo stato di metilazione di 10 linee di cellule di cancro gastrico e una linea cellulare di fibroblasti polmone umano. DCC
espressione dell'mRNA si osserva (ΔCT inferiore) in linee cellulari GCIY e NHLH. DW denota acqua distillata
Successivamente, abbiamo indagato l'associazione tra DCC
metilazione promotore e le varie caratteristiche clinico-patologici e genetici. DCC
stato di metilazione è risultato significativamente associato con lo status di MSI. tumori gastrici MSI-positivi sono stati significativamente più frequentemente associati con DCC
metilazione che con DCC
unmethylation (23 contro 6%, P = 0,013
; Tabella 2). Non c'erano associazioni significative tra DCC
stato di metilazione e qualsiasi altro variables.Table 2 di associazione tra le alterazioni epigenetiche /genetiche del gene DCC e le caratteristiche clinico-patologiche in tumori gastrici
DCC
metilazione Visualizzazione di stato% ( n)
18q LOH Visualizzazione di stato% (n)
DCC
Alterazione Visualizzazione di stato% (n)
Unmethylation
metilazione
P
Non informativo
negativo positivo

P
Non informativo
negativo positivo

positivo
P
totale
metilazione solo

LOH solo
Sia
(n = 54
)
(n = 44
)
(n
= 15)
(n = 47
)
(n = 36
)
(n = 15
)

(n = 25
)
(n = 58
)
(n
= 22)
(n = 19
)
(n = 17
)
Età
L'età media (SD)
63,6 (12,5)
67,0 (10,7)
0.48a
68,9 (11,4)
64,8 (11,4)
63,9 (12,4)
0.76a
68,9 (11,4)
63,5 (12,9)
64,8 (11,3) 66,3
(9.5)
60,7 (12,7)
67,4 (11,4)
0.98a
genere
Femminile
39 (21)
30 (13)
0.33b
40 (6)
38 (18)
28 (10)
0.32b
40 (6)
44 (11)
29 (17) 32
(7)
32 (6)
24 (4)
0.19b
Maschio
61 (23)
70 (31)
60 (9)
62 (29)
72 (26)
60 (9)
56 (14)
71 (41)
68 (15)
68 (13) 76
(13)
Istologia
Diff
41 (22)
59 (26)
0.071b
47 (7)
55 (26)
42 (15 )
0.22b
47 (7)
52 (13)
48 (28)
59 (13)
32 (6)
53 (9)
076b
Undiff
59 (32)
41 (18)
53 (8)
45 (21)
58 (21)
53 (8)
48 (12)
52 (30)
41 (9)
68 (13)
47 (8)
fase
IA /IB
20 (11)
16 (7)
0.83b
13 (2)
19 (9)
19 (7)
0.15b
13 (2)
24 ( 6)
17 (10)
14 (3)
21 (4)
18 (3)
0.70b
IIA /IIB
26 (14)
34 (15)
27 (4)
30 (14)
31 (11)
27 (4)
24 (6)
33 (19)
36 (8)
32 (6)
29 (5)
IIIA /IIIB /IIC
39 (21)
36 (16)
53 (8)
43 (20)
25 (9)
53 (8)
40 (10)
33 (19)
45 (10)
26 (5) 24
(4)
IV
15 (8)
14 (6)
7 (1)
9 (4)
25 (9) Pagina 7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
T
T1a /1b
15 (8 )
14 (6)
0.24b Pagina 7 (1)
17 (8)
14 (5)
0.94b Pagina 7 (1)
16 (4)
16 (9)
18 (4)
21 (4)
6 (1)
0.54b
T2
13 (7)
16 (7)
13 (2)
15 (7)
14 (5)
13 (2)
16 (4)
14 (8) 14
(3)
11 (2)
18 (3)
T3
20 (11)
36 (16)
33 (5)
28 (13)
25 (9)
33 (5)
16 (4)
31 (18)
41 (9)
16 (3)
35 (6)
T4a /b
52 (28)
34 (15)
47 (7)
40 (19)
47 (17)
47 (7) 52
(13)
40 (23)
27 (6)
53 (10)
41 (7)
N
N0
30 (16) 23
(10)
0.66b
20 (3)
28 (13)
28 (10)
0.29b
20 (3)
32 (8)
26 (15)
23 (5)
32 (6)
24 (4)
0.19b
N1
37 (20)
32 (14)
47 (7)
38 (18)
25 (9)
47 (7)
44 (11)
28 (16)
32 (7)
26 (5)
24 (4)
N2
20 (11)
30 (13)
20 (3)
26 (12)
25 (9 )
20 (3)
20 (5)
28 (16)
32 (7)
21 (4)
29 (5)
N3
13 (7)
16 (7)
13 (2)
9 (4)
22 (8)
13 (2) Pagina 4 (1)
19 (11)
14 (3)
21 (4)
24 (4)
metastasi a distanza
negativa
85 (46)
86 (38)
0.87b
93 (14)
91 (43)
75 (27)
0.041b
93 (14)
88 (22)
83 (48)
95 (21)
79 (15)
71 (12)
0.55b
positivo
15 (8)
14 (6) Pagina 7 (1)
9 (4)
25 (9) Pagina 7 (1)
12 (3)
17 (10)
5 (1)
21 (4)
29 (5)
stato MSI
MSI
6 (3)
23 (10)
0.013b ​​
33 (5)
9 (4)
11 (4)
0.69b
33 (5) Pagina 4 (1)
12 (7)
14 (3)
0 (0)
24 ( 4)
0.25b
non-MSI
94 (51)
77 (34)
67 (10)
91 (43)
89 (32)
67 (10)
96 (24)
88 (51)
86 (19)
100 (19)
76 rapporto LOH (13)

rapporto medio (SD)
0,23 (0,30)
0,26 (0,31)
0.55A
0,22 (0,29)
0,10 (0,15)
0,44 (0,36)
< 0.0001a
0,22 (0,29)
0.05 (0.10)
0,33 (0,33)
0,16 (0,18)
0,44 (0,34)
0.44 (0.39)
< 0.0001a
CIN *
positivo
46 (25)
57 (25)
0.39b
47 (7)
38 (18)
74 (25)
0.0017b
47 (7)
24 (6)
66 (37)
55 (12)
76 (13)
71 (12)
0.0005b
negativo 54 (27)
43 (19)
53 (8)
62 (29)
26 (9)
53 (8) 76
(19)
34 (19)
45 (10)
24 (4)
29 (5)
KRAS
/BRAF
/PIK3CA

Mutant
6 (3)
11 (5)
0.30b
27 (4)
6 (3) Pagina 3 (1)
0.45b
27 (4) Pagina 4 (1)
5 (3)
9 (2)
5 (1)
0 (0)
0.82b
selvaggio
94 (51)
89 (38)
73 (11)
94 (44)
97 (35)
73 (11)
96 (24)
95 (55)
91 (20)
95 (18)
100 (17)
H.pyroli
positivo
72 (39)
70 (31)
0.85b
80 (12)
66 (31)
75 (27)
0.37b
80 (12)
60 (15)
74 (43 )
73 (16)
79 (15)
71 (12)
0.20b
negativo 28 (15)
30 (13)
20 ( 3)
34 (16)
25 (9)
20 (3)
40 (10)
26 (15)
27 (6)
21 (4 )
29 (5)
* due casi non sono informative dello stato CIN
un valore P
sono stati calcolati tra unmethylation e metilazione, 18qLOH negativo e positivo, e DCC alterazione negativo e positivo (totale) da Wilcoxon /Kruskal-Wallis test di
B P valori
sono stati calcolati tra il unmethylation e metilazione, 18qLOH alterazione negativo e positivo, e DCC negativo e positivo (totale) di test chi-quadrato di Piason
LOH del locus 18q associata a CIN fenotipo in cancro gastrico con gli casi informativi, le frequenze di 18q LOH ogni microsatellite marcatore erano 14/41 (24%) a D18S35, 17/55 (31%) a D18S69, e 21/58 (36 %) a D18S58 (la posizione di ogni macchina è mostrato in Fig. 1a). I tumori che mostrano LOH in tutti e tre, due, e solo uno dei tre marcatori microsatelliti erano 4 (4,8%), 9 (11%), e 23 (28%) di 83 casi informativi tra 98 tumori gastrici primari, rispettivamente. I tumori che mostrano LOH in almeno uno dei tre marcatori microsatelliti per 18q LOH sono stati classificati come 18q LOH-positive. Con questo criterio, i tumori 18q LOH-positivi sono stati rilevati in 36 (43%) dei 83 casi informativi tra i 98 tumori gastrici primari (Tabella 2).
Analogamente alla DCC
stato di metilazione, abbiamo studiato le associazioni tra 18q LOH lo stato e le varie caratteristiche clinico-patologici e genetici. Tra i casi informativi, la frequenza del cancro gastrico con metastasi a distanza era più alta nei tumori gastrici 18q LOH-positivi rispetto a 18Q tumori LOH-negativi (25 vs 9%, P = 0.041
; Tabella 2). I rapporti LOH calcolati per gli altri sette loci sono stati anche significativamente più alto per 18q LOH-positivi che per 18Q tumori LOH-negativo (0,44 vs. 0,10, P
< .0001; Tabella 2). Secondo questi risultati, quando un tumore hanno mostrato un rapporto LOH maggiore di 0, il tumore è stato classificato come CIN-positive. Inoltre, i tumori gastrici CIN-positivi che erano anche 18q LOH-positivi erano significativamente più abbondante rispetto a quelli che erano 18q LOH-negativi (74 vs 38%, P = 0,0017
; Tabella 2). Studi precedenti hanno dimostrato che la perdita di 18q è comunemente osservata nei tumori del colon-retto, e la sua frequenza è correlata con CIN fenotipo, ma inversamente correlato con MSI fenotipo [29, 30]. Come il nostro studio e un altro studio ha dimostrato, questo fenomeno è stato riprodotto anche per i tumori gastrici [18]
. Stato di espressione e di metilazione di DCC
in linee cellulari di cancro gastrico
per valutare le associazioni tra DCC
stato espressione e le alterazioni epigenetiche nel gene DCC
, abbiamo esaminato l'RNA messaggero (mRNA) livelli di trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) usando un set di primer descritti in precedenza [31] e hanno esaminato le associazioni tra DCC
espressione e stato di metilazione CpG nella DCC
regione del promotore in 10 linee di cellule di cancro gastrico (MKN7, N87, MKN74, MKN45, NUGC-2, NUGC-3, NUGC-4, GCIY, Ogum-1, e MKN1) e una normale linea cellulare di fibroblasti del polmone (NHLF). Tutte le linee di cellule, ad eccezione di MKN74, GCIY, OGUM-1, MKN1, e le cellule NHLF, mostrava diminuita espressione di DCC
trascritti genici, e loro promotori sono stati metilato (Fig. 1e). D'altra parte, anche se tre linee cellulari, N87, Ogum-1, e MKN1 mostrava diminuita espressione di DCC
trascritti genici, DCC
promotori in tali cellule non sono state metilato dalle COBRA. Tra le 10 linee di cellule di cancro gastrico, solo la linea cellulare GCIY espresso DCC
trascritti allo stesso livello come cellule NHLF, ma il suo promotore era metilato. Quando abbiamo classificato una linea di cellule che mostra aΔC T di oltre 15,0 come DCC
espressione-negativi e una linea cellulare con aΔC T di 15,0 o meno come DCC
espressione-positivi, solo il GCIY linea cellulare potrebbe essere classificato come DCC
espressione-positivi tra le sette linee di cellule di cancro gastrico con DCC
metilazione; questo risultato era statisticamente non significativa.
Riduzione di espressione DCC richiede sia genetici ed epigenetici alterazioni
Avanti, abbiamo studiato l'associazione tra l'espressione della proteina DCC e alterazioni genetiche ed epigenetiche nel gene DCC
in 86 cancro gastrico esemplari. Esempi rappresentativi di immunoistochimica risultati (IHC) di colorazione sono mostrati in Fig. 2a-c. Abbiamo classificato i tumori nei seguenti tre gruppi sulla base dei risultati IHC analizzati come variabile categorica: perdita completa di espressione DCC (. 8 casi, 9%; Fig 2a), la perdita focale di espressione DCC (38 casi, 44%; Fig. 2b), e l'espressione della proteina DCC positivo (40 casi, 47%; Fig. 2c). Fra 86 tumori gastrici, 46 casi (53%) visualizzata ridotta espressione DCC. Un precedente studio ha riportato che la ridotta espressione di DCC è stata osservata in un totale di 38% dei tumori gastrici, e tumori stadio T1-T2 ha mantenuto una espressione positiva DCC mentre è stato abolito nei tumori T3 [32]. Questo risultato è stato anche riproducibile in questo studio (sui file 2: Figura S2). Figura. 2 DCC
metilazione del promotore e immunoistochimica analisi. analisi immunoistochimica per DCC
(A-C). Nuclei di cellule tumorali sono completamente negativa (a), focally negativamente (b), e positivamente (c) macchiato. (D) di associazione tra l'alterazione epigenetica /genetica e DCC
espressione
Poi, abbiamo esaminato le associazioni tra le alterazioni genetiche ed epigenetiche e lo stato di espressione DCC. Sette degli 8 casi con perdita completa, 33 dei 38 casi con perdita focale, e 34 di 40 casi con espressione positiva DCC erano ben informato sia per DCC
metilazione del promotore e 18q LOH. Abbiamo scoperto che tra i tumori con perdita completa di espressione DCC, 5/7 tumori (71%) ha dimostrato sia DCC
metilazione del promotore e 18q LOH. Al contrario, 8/33 tumori (24%) hanno mostrato la perdita focale di espressione DCC ed entrambi metilazione e LOH, 5/33 tumori (15%) hanno mostrato LOH da solo, e 12/33 tumori (36%) visualizzati metilazione solo. Tra i tumori che erano positivi per l'espressione DCC, solo 2/34 tumori (6%) hanno dimostrato sia la metilazione e LOH, 13/34 (38%) dei tumori Loh da solo, e 8/34 tumori (24%) di metilazione da solo (tumori che mostra sia DCC
metilazione e 18q LOH contro gli altri, p = 0,0048
, test chi-quadrato di Pearson; Fig. 2d). I nostri dati suggeriscono che una riduzione della espressione DCC può richiedere denso metilazione nei CPGs promotore e LOH del locus 18q, secondo la teoria di due-hit [33]
. Associazione tra le caratteristiche clinico-patologiche e genetiche /alterazioni epigenetiche di DCC
nel cancro gastrico
Dal alterazioni sia epigenetiche e genetiche sono fondamentali per DCC soppressione, abbiamo studiato la relazione tra epigenetica e alterazioni genetiche nel gene DCC
con varie caratteristiche clinico-patologici. Di 98 tumori gastrici, 15 tumori sono stati classificati come non-informativo, 25 tumori sono stati classificati come negativi per DCC
alterazioni, e 58 tumori sono stati classificati come positivi per DCC
alterazioni. Tra le caratteristiche clinico-patologici, rapporto di LOH e distribuzione fenotipo CIN differivano significativamente tra i tumori negativi e positivi per DCC
alterazioni (tabella 2). Con gli 58 tipi di cancro con DCC
alterazioni, 17 tumori hanno mostrato alterazioni sia DCC
metilazione e 18q LOH, 19 aveva 18q LOH da solo, e 22 tumori esposti DCC
metilazione solo. Il rapporto LOH calcolato per gli altri sette loci era significativamente più alta nei tumori gastrici sia con DCC
metilazione e 18q LOH (media LOH rapporto, 0.44; SD ± 0,39) e nei tumori con solo LOH 18q (media LOH rapporto, 0.44; SD ± 0,34), intermedio in tumori con DCC
solo metilazione (media LOH rapporto, 0.16; SD ± 0,18), e più basso nei tumori negativi per DCC
alterazioni (media LOH rapporto, 0.05; SD ± 0.10; P
< 0,0001, Wilcoxon /test di Kruskal-Wallis). Quando abbiamo classificato i tumori gastrici con LOH rapporti superiori a 0 come CIN-positivi, 12/17 tumori gastrici (71%) sia con DCC
metilazione e 18q LOH, 13/17 tumori gastrici (76%), con 18q LOH da solo, Figura. Figura. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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