Influência da HRH2 polimorfismo promotor no metilação aberrante de DNA DAPK e CDH1in o epitélio gástrico

Influência da HRH2
polimorfismo do promotor na metilação do DNA aberrante de DAPK Comprar e CDH1
no epitélio gástrico da arte abstracta
Fundo
padrões de metilação aberrante ilha CpG são conhecidos por ser influente no gene silenciamento. A histamina desempenha papéis fisiológicos importantes no tracto gastrointestinal superior e actua através do receptor H2. Nós relatamos uma investigação sobre o efeito de HRH2
polimorfismo do promotor (rs2607474 G > A) na metilação do DAPK Comprar e CDH1
Métodos
amostras da mucosa gástrica não cancerosos foram obtidos a partir. 115 indivíduos com cancro gástrico (GC) e 412 indivíduos não-cancerosas (não-CG). estado de metilação de genes foi determinada por MSP. A genotipagem de rs2607474 foi realizada por PCR-SSCP.

Resultados da metilação de DAPK Comprar e CDH1
foi observada em 296 e 246 indivíduos, respectivamente. A frequência de CDH1
metilação nos indivíduos com GC foi significativamente menor em lesão câncer do que na mucosa não canceroso, enquanto a de DAPK
metilação não foi diferente. A distribuição alélica de rs2607474 foi 401GG, 119GA e 7AA. O homozigoto GG foi associado com um aumento significativo do risco para a metilação de ambos DAPK
e CDH1
(p < 0,0001 e p = 0,0009, respectivamente). Nos indivíduos não-GC ou mais de 60 anos de idade, GG homozigoto foi mais estreitamente associada tanto DAPK Comprar e CDH1
metilação. No entanto, este genótipo não apresentaram um risco aumentado para o desenvolvimento de metilação de dois genes em pacientes com GC. Em H. pylori
indivíduos negativos, GG homozigoto mostrou um aumento do risco para a metilação de ambos DAPK
e CDH1
(p = 0,0074 e p = 0,0016, respectivamente), ao passo que este genótipo foi associado com um aumento risco para o desenvolvimento de DAPK
metilação em H. pylori
indivíduos positivos (p = 0,0018). Além disso, em indivíduos com idade superior a 60 anos de idade, as pontuações atrofia e a metaplasia foi significativamente maior no homozigoto GG (p = 0,011 e p = 0,039, respectivamente) e observou-se uma correlação significativa entre idade e atrofia ou metaplasia.
conclusões
Nossos resultados sugerem que rs2607474 GG homozigoto confere um risco significativamente aumentado de idade e relacionadas com a inflamação-DAPK Comprar e CDH1
metilação.
Palavras-chave
HRH2
polimorfismo genético metilação do DNA aberrante Background
o câncer gástrico é um dos cancros mais comuns em todo o mundo e está associado com uma elevada taxa de mortalidade [1, 2]. Vários cancros, incluindo tumores gástricos, show de metilação de vários genes, incluindo E-caderina (CDH1
),
quinase associada à morte de proteína (DAPK
) e 2A inibidor da quinase dependente da ciclina (CDKN2A
) [3, 4]. A metilação do promotor ilhas CpG leva a mudanças estruturais de DNA e, consequentemente, a inativação do gene [5]. Muitos estudos têm identificado este silenciamento por metilação de ADN como um mecanismo responsável pela inactivação supressor de tumor. No entanto, alguns genes também são metilados em tecidos não-neoplásicas, devido ao envelhecimento [6, 7], e tem também sido sugerido que a metilação do gene ocorre durante a inflamação crónica em vários tecidos [8-10]. Na mucosa gástrica, tem sido postulado que a metilação de ilha CpG é induzida por Helicobacter pylori
(H. pylori
) infecção na mucosa não-canceroso [11, 12] e considerados como as condições pré-cancerosas na carcinogénese gástrica [ ,,,0],13]. Entre vários genes, DAPK
, CDH1
e CDKN2A
são conhecidas por serem frequentemente metilado na mucosa gástrica, não neoplásico e esta metilação está associada à idade, infecção por H. pylori
, grau histológico de gastrite , e cancro gástrico [11, 13, 14].
no entanto, a histamina, uma das aminas activas libertadas em resposta a uma variedade de estímulos fisiológicos, está amplamente distribuída no trato gastrointestinal incluindo o estômago e está envolvida na patogénese de ulceração gastroduodenal e inflamação gástrica [15]. No estômago, os receptores H2, embora amplamente distribuído nos tecidos do corpo, parecem ter um papel central na regulação da secreção de ácido, tal como confirmado pela utilização generalizada de bloqueadores de receptores de H2, na terapia de distúrbios relacionados com o ácido [16, 17] . Histamina desempenha um papel importante na inflamação gástrica que actua através do receptor H2, embora a infecção por H. pylori
é um dos principais factores que contribuem para o desenvolvimento da inflamação gastro-duodenal [18]. Recentemente, a associação entre polimorfismos genéticos de genes de histamina receptores e susceptibilidade à esquizofrenia, e sua resposta clínica ao tratamento com clozapina foi estudado [19]. Esta investigação dos polimorfismos de HRH2
, que codifica para o receptor H2, revela associação entre o genótipo na HRH2
-1018 G /A loco (rs2607474) e a resposta clínica ao tratamento com clozapina. Além disso, este relatório mostrou que rs2607474 está localizado em um elemento potenciador do promotor do gene HRH2
[19, 20] e é por isso provável que esta variante induz alterações na expressão de receptores. De acordo com HapMap-JPT, existe apenas um desequilíbrio de ligação (LD) de blocos, composto por rs686874, rs2067474, rs678591, rs645574, rs2890892 e rs11954815, em HRH2. Todos os outros SNPs são menores polimorfismos. Portanto, especulamos que este bloco LD influenciar a expressão e /ou função do receptor de histamina H2 e rs2607474 seleccionados como um SNP Tag. Há ainda não houve nenhum relatório sobre os rs2607474 efeito sobre o desenvolvimento e progressão de doenças gastrointestinais. Nossa hipótese é que o rs2607474 pode influenciar o desenvolvimento de padrões de metilação do DNA aberrantes em mucosa gástrica.
No presente estudo, investigou-se a relação entre HRH2
polimorfismo do promotor (rs2607474) e metilação do DNA de DAPK Comprar e CDH1
no epitélio gástrico não-cancerosas. A diferença do estado de metilação do DNA entre os pacientes com câncer gástrico e indivíduos não-cancerosas também foi investigado.
Métodos
amostras de tecido, extração de DNA e status de infecção por Helicobacter pylori
Nossa população estudada foi composta por 527 indivíduos (412 sem maligno tumores e 115 com câncer gástrico) recrutados a partir do Centro de Endoscopia do Hospital Universitário de Saúde Fujita ou Hospital Universitário Kanazawa Medical. Pacientes com doenças graves sistêmicas foram excluídos deste estudo. Aqueles com úlceras gástricas ou duodenais activas foram também excluídas. Todos os indivíduos foram submetidos a endoscopia digestiva alta com biópsia da mucosa não-cancerosas. Em 115 pacientes com câncer gástrico, biópsia também foi obtido a partir de lesão câncer. Partes de cada amostra foram imediatamente congeladas e armazenadas a -80 ° C, enquanto que alguns dos a outra parte foi fixada em formalina a 10% tamponada e embebidos em parafina. Mais tarde, o DNA genómico foi extraído directamente de amostras congeladas usando o método do fenol /clorofórmio padrão após digestão com proteinase K. Em 296 dos 412 indivíduos sem câncer gástrico, a gravidade da gastrite crônica foi classificada de acordo com o sistema de Sydney atualizada [21] por um patologista que não tinham acesso a qualquer informação clínica. H. pylori
estado de infecção foi avaliada por sorologia, histologia, ou teste respiratório da ureia. Os indivíduos foram diagnosticados como infectados quando pelo menos um dos testes de diagnóstico foi positivo. Tours A Comissão de Ética da Universidade de Saúde Fujita e Kanazawa University Medical aprovou o protocolo, e antes, consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos participantes.
modificação bissulfito e PCR (MSP)
-metilação específica para examinar a metilação do DNA, o DNA genómico foi tratada com bissulfito de sódio utilizando o kit de ADN BislFast modificação para Detecção de ADN metilado (TOYOBO, Co., Ltd., Osaka, Japão). MSP para DAPK
e CDH1
foram realizados utilizando os métodos descritos por Katzenellenbogen et al. [22] e Herman et al. . [23], respectivamente Online em reações breves, MSP foram realizados com os seguintes pares de primers usando EX Taq HS (Takara Bio, Inc., Shiga, Japão)
Os pares de primers:.
DAPK: metilado mais adiante; 5 '- ggatagtcggatcgagttaacgtc-3 '
reversa; 5 '- ccctcccaaacgccga-3 ',
DAPK: forward não metilado; 5 '- ggaggatagttggattgagttaatgtt-3 ',
reversa; 5 '- caaatccctcccaaacaccaa-3 ',
CDH1: metilado para a frente; 5 '- ttaggttagagggttatcgcgt-3 ',
reversa; 5 '- taactaaaaattcacctaccgac-3 ',
CDH1: forward não metilado; 5 '- taattttaggttagagggttattgt-3 ',
reversa; 5 '- cacaaccaatcaacaacaca-3 ',
temperatura de recozimento e os tempos foram determinadas usando DNA do sangue periférico de um indivíduo jovem, sem infecção por H. pylori
como controle negativo e este DNA metilado com SSSI metilase (New England Biolabs Inc., Beverly, MA) como um controlo positivo. A MSP foi realizada num volume de 20 uL contendo 0,1 ug de ADN-bissulfito modificated. O ADN foi desnaturado a 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 64 ou 65 ° C (para CDH1
ou DAPK
, respectivamente), durante 1 minuto, e 72 ° C durante 1 minuto, com uma extensão final a 72 ° C durante 5 minutos. As bandas de MSP foram detectados por electroforese em géis de agarose a 3,0% corado com brometo de ethdium. A hipermetilação foi definido como a presença de uma banda de metilação positivo mostrando sinais aproximadamente iguais ou maiores do que a do marcador de tamanho (10 ng /mL: 100 pb de DNA Ladder, Takara Bio Inc., Shiga, Japão), independentemente da presença de bandas não metiladas [4].
genotipagem do polimorfismo HRH2
O rs2607474 foi genotipados por PCR-SSCP conforme relatado anteriormente [24, 25]. Para detectar o genótipo, utilizando o par de iniciadores (para a frente: 5 '- acctgacccttttctgaaaaagtttgtc-3 ', e reverso: 5 '- ctactcctctgaagtgctgagaaccat-3 '), a PCR foi realizada em um volume de 20 uL contendo 0,1 ug de ADN genómico. O ADN foi desnaturado a 95 ° C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos a 96 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 30 segundos, com extensão final a 72 ° C durante 5 minutos. Depois disso, 2? L de produto de PCR foi desnaturado com 10 ul de formamida (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EUA) a 95 ° C durante 5 minutos. SSCP foi efectuada a 6 ° C usando um sistema de separação de DNA GenePhor com GeneGel Excel 12.5 /24 (GE Healthcare, EUA), após o que as bandas de ADN de cadeia única desnaturadas foram detectados utilizando um DNA Kit de coloração com prata (GE Healthcare). Nós confirmou que DNAs de cadeia simples foram claramente separados por esta condição [25]. resultados SSCP foram confirmados usando fragmentos de DNA positivos preparados por nested-PCR conforme relatado anteriormente [24, 26].
análise estatística
Idade e dezenas de sistema atualizados Sydney foram expressos como média ± SD. As idades médias entre dois grupos foram comparados com o teste t de Student
. A razão de sexo, H. pylori
infecção e de metilação de ADN foram comparadas pelo teste exato de Fisher. As contagens de alelos também foram comparadas entre o metilado e os grupos não metiladas por teste exato de Fisher. OR ajustadas foram calculadas com o uso de análise de regressão logística após ajuste para idade, sexo e H. pylori
estado da infecção. Cada atualizados pontuação do sistema de Sydney entre os 2 grupos foi comparada por Mann Whitney U
-teste. A correlação entre idade e cada pontuação sistema atualizado Sydney foi avaliada por ANOVA. Para todas as análises, o nível de significância foi estabelecido em p Art < 0.05.
Resultados
Assuntos
Um total de 412 não-câncer (não-GC) indivíduos e 115 de câncer gástrico (CG) pacientes participaram deste estudo. Estas características encontram-se resumidos na Tabela 1. A média de idade e a razão macho /fêmea do grupo GC foram significativamente mais elevados do que aqueles no grupo de não-GC. A H. pylori
relação positiva do grupo GC também foi significativamente mais elevada do que a do grupo não-GC. Além disso, as frequências de CpG metilação de ambos DAPK Comprar e CDH1
foram significativamente maiores no grupo GC do que nos não-GC group.Table 1 Características dos indivíduos e frequências de metilação do gene

não-GC
GC
p valor global *
o número de sujeitos
527
412
115
idade média ± SD
61,0 ± 13,7
60,0 ± 13,8
66,2 ± 9,7
0,0019
macho: fêmea
319: 208
235: 177
84:31
0,0018
relação positiva H.pylori
338/527
249/412
89/115
0,00091
DAPK relação metilado
296/527 201/412

95/115 Art < 0,0001
CDH1 relação metilado
246/527
150/412
96/115 Art < 0,0001
*:. grupo não-GC vs. grupo GC
Frequências de genótipos rs2607474 entre grupos metilados e não metilados DAPK
A distribuição deste genótipo em todos os 527 indivíduos foi 401GG, 119GA e 7AA e estava em Hardy -Weinberg equilíbrio (p = 0,70). A média de idade, H. pylori
relação positiva e relação de GC /não-GC foram significativamente maiores no DAPK
metilado que nos grupos não metiladas, enquanto que a relação homem /mulher entre os dois grupos não foi significativamente diferente ( Mesa 2). A frequência do alelo menor de rs2607474 no grupo metilado foi significativamente mais baixa do que no grupo não metilado (p < 0,0001, definindo α = 0,05, 1-βpower = 0,978). Além disso, a frequência do homozigoto GG foi significativamente maior no grupo metilado do que no grupo não metilado (p < 0,0001) .table 2 As frequências dos genótipos entre os grupos metilados e não metilados DAPK
DAPK não metilado
o número de sujeitos
231
296>
DAPK metilado
valor de p *
idade média ± SD
59,6 ± 13,4
62,1 ± 13,8
0,035
macho: fêmea
137: 94
182: 114
NS
H. pylori positividade
122/231 216/296
Art < 0,0001
não-GC: GC
211: 20
201: 95 Restaurant < 0,0001
rs2607474 HRH2 genótipo GG

155
246 Art < 0,0001 #
GA
72
47
AA 4
3
A freqüência do alelo
17,3%
9,0%
< 0,0001
*:.. unmethylated vs. metilado, #: frequência de GG homozigoto
NS: não significativo
frequências de genótipos rs2607474 entre grupos metilados e não metilados CDH1
O H. pylori
relação positiva e proporção GC /GC não foram significativamente maiores no grupo CDH1
metilado do que no grupo não metilado, enquanto a média de idade e a razão macho /fêmea entre os dois grupos não diferiram significativamente (Tabela 3). A frequência do alelo menor de rs2607474 no grupo metilado foi significativamente mais baixa do que no grupo não metilado (p = 0,0004, definindo α = 0,05, 1-βpower = 0,946) e a frequência do homozigoto GG foi significativamente maior no grupo metilado de no grupo não metilado (p = 0,013) .table 3 as frequências dos genótipos entre os grupos metilados e não metilados CDH1
CDH1 não metilado
CDH1 metilado
valor p
*

o número de sujeitos
281
246
idade média ± SD
60,6 ± 14,0
61,4 ± 13,3
NS
macho: fêmea
165: 116
154: 92
NS
H. pylori positividade
152/281
186/246 Art < 0,0001
não-GC: GC
262 : 19
150: 96 Restaurant < 0,0001
rs2607474 HRH2 genótipo
G /G
197
204
0.013 #
G /A
78
41
A /A
6
1

• composição de ácidos graxos do tecido adiposo subcutâneo e mucosa gástrica: Existe uma relação com úlceras gástricas <br> Abstract <br>: existe uma relação com úlceras gástricas
• recorrência local do câncer gástrico após gastrectomia total: uma presentation