Befolyásolja a HRH2 promoter polimorfizmus rendellenes DNS metiláció az DAPK és CDH1in a gyomornyálkahártya

Befolyásolja a HRH2 katalógusa promoter polimorfizmus rendellenes DNS metiláció az DAPK katalógusa és Cdh1 katalógusa a gyomornyálkahártya katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa aberráns metilációs mintázat CpG-sziget ismert, hogy befolyásos gén hangtompító. A hisztamin játszik fontos élettani szerepet töltenek be a felső gyomor-bélrendszer és keresztül hat a H2-receptor. Mi jelentés nyomozást a hatását HRH2 katalógusa promoter polimorfizmus (rs2607474 G > A) metilációját DAPK katalógusa és Cdh1 katalógusa.
Módszerek katalógusa nem rákos gyomornyálkahártya vettünk 115 alanyok gyomorrák (GC) és 412 nem rákos beteg (nem-GC). Metiiációs státusának gének határoztuk meg MSP. A genotipizálás A rs2607474 végeztük PCR-SSCP.
Eredménye
metilálása DAPK
és Cdh1
volt megfigyelhető 296 és 246 vizsgálati alanynál. A frekvencia Cdh1 katalógusa metiláció az alanyok GC szignifikánsan alacsonyabb volt a daganatos elváltozás, mint a nem rákos nyálkahártya, míg a DAPK katalógusa metiláció nem volt más. Az allél megoszlása ​​rs2607474 volt 401GG, 119GA és 7AA. A GG homozigóta járt egy jelentősen megnövekedett kockázata metilációs mindkét DAPK katalógusa és Cdh1 katalógusa (p < 0,0001 és p = 0,0009-kal). A nem-GC tárgyak, vagy több mint 60 éves, GG homozigóta volt szorosabb kapcsolatba is DAPK katalógusa és Cdh1 katalógusa metiláció. Azonban ez a genotípus nem mutatott megnövekedett kockázatát a fejlesztési metilezése mindkét gén betegeknél GC. A H. pylori katalógusa negatív betegek, GG homozigóta fokozott kockázatát mutatta a metilációs mindkét DAPK katalógusa és Cdh1 katalógusa (p = 0,0074 és p = 0,0016-kal), mivel ez a genotípus járó megnövekedett kialakulásának kockázata a DAPK katalógusa metiláció H. pylori
pozitív (p = 0,0018). Ezen túlmenően, a tantárgyak 60 év feletti életkor, atrophia és metaplasia pontszámok szignifikánsan magasabbak voltak a GG homozigóta (p = 0,011 és p = 0,039,), valamint egy szignifikáns összefüggést az életkor és a sorvadás vagy metaplasia. Katalógusa Következtetések katalógusa Eredményeink azt sugallják, hogy rs2607474 GG homozigóta ruházza jelentősen megnövekedett kockázata az életkorral és a gyulladással kapcsolatos DAPK katalógusa és Cdh1 katalógusa metiláció.
Kulcsszavak katalógusa HRH2 katalógusa genetikai polimorfizmus aberráns DNS metiláció Háttér
gyomorrák egyik leggyakoribb rák a világon, és kapcsolatban van egy magas halálozási arány [1, 2]. Számos rákos megbetegedések, beleértve a gyomor tumorok, show metilezése több gén, beleértve az E-cadherin (Cdh1
),
halál-asszociált protein kináz (DAPK
) és ciklin-dependens kináz inhibitor 2A (CDKN2A
) [3, 4]. Metilálása promoter CpG-szigetek vezet DNS szerkezeti változásokat, és ennek következtében, gén inaktiválása [5]. Számos tanulmány azonosította ezt hangtompító DNS metiláció a felelős mechanizmus tumor szupresszor inaktiválása. Azonban néhány gén is metilált nem-neoplasztikus szövetekben a korral járó, [6, 7], és azt is javasolta, hogy a gén metiláció során fellépő krónikus gyulladás különféle szövetekben [8-10]. A gyomor nyálkahártya, azt feltételezik, hogy a metilezést a CpG-szigetre indukálják Helicobacter pylori katalógusa (H. pylori
) fertőzés nem rákos nyálkahártya [11, 12], valamint úgy, mint a rákot megelőző állapotok gyomor karcinogenezis [ ,,,0],13]. Közül több gén, DAPK
, Cdh1
és CDKN2A
ismert, hogy gyakran metilált nem-neoplasztikus gyomornyálkahártya, és ez a metilezés kapcsolatban van az életkorral, a H. pylori
fertőzés, szövettani foka gyomorhurut , és a gyomorrák [11, 13, 14].
azonban, hisztamin, az egyik az aktív aminok válaszként kibocsátott különböző fiziológiai ingerek, széles körben elterjedt a gyomor-bél traktusban, beleértve a gyomrot, és részt vesz a patogenezisében a gyomor-nyombélfekély és gyomorfekély gyulladás [15]. A gyomorban a H2 receptorok, bár széles körben elterjedt a testszövetekben, úgy tűnik, hogy van egy központi szabályozásában szerepet savszekréció, amint azt a széles körű használata a H2-receptor-blokkolók terápiájában savval kapcsolatos betegségek [16, 17] . A hisztamin fontos szerepet játszik a gyomor gyulladásos eljárva keresztül H2-receptor, bár a H. pylori
fertőzés az egyik fő összetevő tényezőket a fejlesztés gyomor-nyombél gyulladás [18]. A közelmúltban, a szövetség között genetikai polimorfizmusok hisztamin receptor gén és fogékonyság a skizofrénia, és a klinikai válasz klozapiné kezelés hatását vizsgálták [19]. Ezt a vizsgálatot a polimorfizmusok HRH2 katalógusa, kódoló H2 receptor, feltárja közötti kapcsolat genotípus a HRH2
-1018 G /A lokusz (rs2607474) és a klinikai válasz klozapin kezelés. Ezen túlmenően, ez a jelentés azt mutatja, hogy rs2607474 található egy enhanszer elem a HRH2 katalógusa gén promoter [19, 20], és ezért valószínű, hogy ez a változat indukál változásokat expresszióját receptorokhoz. Szerint HapMap-JPT, csak egy kapcsolódási egyensúlyban (LD) blokk, tagjai rs686874, rs2067474, rs678591, rs645574, rs2890892 és rs11954815, a HRH2. Az összes többi SNP kisebb polimorfizmusok. Ezért feltételezték, hogy az LD blokk befolyásolja az expresszióját és /vagy funkcióját hisztamin H2-receptor és a kiválasztott rs2607474, mint a Tag SNP. Ott még nem volt semmilyen jelentést az rs2607474 befolyásolja a fejlődését és előrehaladását a gasztrointesztinális rendellenességek. Feltételeztük, hogy az rs2607474 fejlődését befolyásolhatják aberráns DNS metilációs mintázat gyomor nyálkahártyáját.
A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy kapcsolatát HRH2 katalógusa promoter polimorfizmus (rs2607474) és a DNS metiláció a DAPK katalógusa és Cdh1
nem rákos gyomornyálkahártya. A különbség a DNS metilációs állapotát között gyomorrákos betegek és a nem rákos tárgyak is vizsgáltuk. Katalógusa Methods katalógusa szövetminták DNS extrakció és a Helicobacter pylori fertőzés állapotáról katalógusa A vizsgált populáció áll 527 beteg (412 nélkül rosszindulatú daganatok és 115 gyomorrákos) toborzott a Endoszkópia központ Fujita Health University Hospital vagy Kanazawa Medical University Hospital. A szisztémás súlyos betegségeket kizárták a vizsgálatból. Azok aktív gyomor- vagy nyombélfekély is kizártuk. Az összes téma estek felső endoszkópia biopszia nem rákos nyálkahártyáját. 115 alanyok gyomorrák, szövettani mintavétel is nyert daganatos elváltozás. Egyes részei minta azonnal lefagyasztottuk, és -80 ° C, míg néhány más részét rögzítettük 10% -os pufferolt formalinnal és paraffinba ágyaztuk. Később, genomi DNS-t extraháljuk, közvetlenül a fagyasztott mintákat a standard fenol /kloroform módszert után proteináz-K emésztés. Ezen 296 412 betegből nélkül gyomorrák, súlyossága krónikus gastritis szerint osztályozzák a frissített Sydney rendszer [21] egy patológus, aki nem volt hozzáférése a klinikai adatokat. H. pylori katalógusa fertőzési állapot megítélése a szerológiai, szövettani vagy urea kilégzési teszt. Az alanyokat diagnosztizálták fertőzött, ha legalább az egyik diagnosztikai vizsgálatok pozitív volt.
Etikai Bizottsága a Fujita Egészségügyi Egyetem és Kanazawa Orvostudományi Egyetem jóváhagyta a jegyzőkönyvet, és előzetes írásos beleegyezését adta az összes résztvevő személyektől.
Bisulfite módosítása és metiláció-specifikus PCR-t (MSP) katalógusa Annak vizsgálata DNS-metiláció, genomi DNS-t kezelünk nátrium-biszulfittal használatával BislFast DNS-módosító Kit metilált DNS kimutatás (TOYOBO, Co., Ltd., Osaka, Japán). MSP DAPK
és Cdh1
végeztük módszerek alkalmazásával által jelentett Katzenellenbogen et al. [22] és Hermán és munkatársai. [23], ill.
Röviden, MSP reakciókat végeztünk az alábbi primer párok segítségével EX Taq HS (Takara Bio, Inc., Shiga, Japán). Katalógusa primer párokat: katalógusa DAPK: denaturált előre; 5 '- ggatagtcggatcgagttaacgtc-3 '
fordított; 5 '- ccctcccaaacgccga-3 "katalógusa DAPK: metilálatlanok előre; 5 '- ggaggatagttggattgagttaatgtt-3 ',
fordított; 5 '- caaatccctcccaaacaccaa-3 "katalógusa Cdh1: metilezendő előre; 5 '- ttaggttagagggttatcgcgt-3 ',
fordított; 5 '- taactaaaaattcacctaccgac-3 "katalógusa Cdh1: metilálatlanok előre; 5 '- taattttaggttagagggttattgt-3 ',
fordított; 5 '- cacaaccaatcaacaacaca-3 ',
lágyítási hőmérséklet, és alkalommal határoztuk származó DNS alkalmazásával a perifériás vérben egy fiatal egyén nélkül a H. pylori
fertőzés, mint a negatív kontroll, és ez a DNS-metilezett a SSSI metiláz (New England Biolabs Inc., Beverly, MA), mint pozitív kontroll. Az MSP végeztük térfogatban 20 jil, amely 0,1 ug biszulfit-modifikált DNS-t. A DNS-t denaturáltuk 95 ° C-on 5 percig, majd 35 cikluson át 95 ° C-on 30 másodpercig, 64 vagy 65 ° C (a Cdh1 katalógusa vagy DAPK
-kal) 1 percig és 72 ° C 1 perc a végső extenzió 72 ° C-on 5 percig. A sávokat MSP mutattunk elektroforézissel 3,0% -os agaróz gélen festettük ethdium bromid. Hipermetilációja definiáltuk a jelenléte egy pozitív metiláció sávot mutatja jeleket körülbelül egyenlő vagy nagyobb, mint a méret markert (10 ng /ul: 100 bp méretű DNS-létra, Takara Bio Inc., Shiga, Japán), függetlenül a jelenléte metilálatlanok szalagok [4]. katalógusa genotipizálása HRH2 polimorfizmus katalógusa A rs2607474 volt genotipizálását PCR-SSCP mint arról korábban [24, 25]. Ahhoz, hogy érzékeli a genotípus, a primer párt (Előre: 5 '- acctgacccttttctgaaaaagtttgtc-3 ', és reverz: 5 '- ctactcctctgaagtgctgagaaccat-3 '), PCR-t hajtjuk végre 20 pl térfogatban, amely 0,1 ug genomiális DNS-t. A DNS-t denaturáltuk, 95 ° C-on 3 percig, majd 35 ciklusban 96 ° C-on 15 másodperc, 60 ° C-on 30 másodpercig és 72 ° C-on 30 másodperc, és végső extenzió 72 ° C-on 5 percig. Ezután 2 ul PCR-terméket denaturált 10 pl formamid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) 95 ° C-on 5 percig. SSCP végeztük 6 ° C hőmérsékleten egy GenePhor DNS elválasztási rendszer GeneGel Excel 12.5 /24 (GE Healthcare, USA), ami után a denaturált egyszálú DNS-sávokat alkalmazásával detektáltuk DNS ezüst festő kit (GE Healthcare). Igazoltuk, hogy egyszálú DNS-eket világosan elkülönülő ez az állapot [25]. SSCP eredményeket megerősítette alkalmazásával pozitív DNS-fragmenseket állítunk elő nested-PCR-rel, mint arról korábban [24, 26].
Statisztikai analízis
Kor és frissíteni Sydney rendszer pontszámok átlag ± SD. Átlagéletkora két csoport között hasonlítottuk össze a Student-féle T
teszt. Az arány a nemek, a H. pylori fertőzés katalógusa és a DNS metiláció összehasonlították Fisher-féle egzakt tesztet. Az allél számít is összehasonlítjuk a denaturált és metilálatlanok csoportok Fisher-féle egzakt tesztet. Korrigált legkülső számoltuk a használata logisztikai regressziós elemzés után az életkor, a nem és a H. pylori fertőzés katalógusa állapotát. Minden frissített Sydney rendszer pontszámok között 2 csoportban összehasonlítottuk Mann-Whitney U próba
. Az összefüggés az életkor és egyes frissített Sydney rendszer pontszám értékelték ANOVA. Minden elemzések szintjén szignifikancia p katalógusa < 0.05.
Eredmények katalógusa tárgyai
összesen 412 nem rákos (nem GC) témák és 115 gyomorrák (GC) beteg vett részt a vizsgálatban. Ezeket a jellemzőket foglalja össze az 1. táblázat Az átlagos életkor és a férfi /nő arány GC-csoport szignifikánsan magasabbak, mint a nem-GC-csoport. A H. pylori
pozitív arány GC-csoport szintén szignifikánsan magasabb volt, mint a nem-GC-csoport. Továbbá, a frekvenciák CpG metiláció mind DAPK katalógusa és Cdh1 katalógusa szignifikánsan magasabbak voltak a GC csoportban, mint a nem-GC group.Table 1 Jellemzői a tárgyak és frekvencia gén metilációs Matton összességében Matton nem GC Matton GC Matton p értéke *
az alanyok száma katalógusa 527 katalógusa 412 katalógusa 115 katalógusa átlagéletkor ± SD katalógusa 61,0 ± 13,7 katalógusa 60,0 ± 13,8 katalógusa 66,2 ± 9,7 katalógusa 0,0019 katalógusa férfi: nő katalógusa 319: 208 katalógusa 235 177
84:31 katalógusa 0,0018 katalógusa H. pylori pozitív arány Matton 338/527 249/412 katalógusa katalógusa 89/115 katalógusa 0,00091 katalógusa DAPK denaturált arány katalógusa 296/527 201/412 katalógusa katalógusa 95/115 katalógusa < 0,0001 katalógusa Cdh1 denaturált arány katalógusa 246/527 150/412 katalógusa katalógusa 96/115 katalógusa < 0,0001 katalógusa *: nem GC-csoport vs. GC-csoport. katalógusa gyakorisága rs2607474 genotípusok között DAPK denaturált és metilálatlanok csoportok
elosztása az e genotípus minden 527 alanyok 401GG, 119GA és 7AA volt Hardy -Weinberg egyensúly (p = 0,70). Az átlagéletkor, a H. pylori katalógusa pozitív arány és GC /nem GC arány szignifikánsan magasabb volt a DAPK katalógusa denaturált mint a metilálatlanok tagja, míg a férfi /nő arány között a két csoport között nem volt szignifikáns különbség ( 2. táblázat). A minor allél gyakorisága rs2607474 a denaturált csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az metilálatlanok csoportban (p < 0,0001, amelyben α = 0,05, 1-βpower = 0,978). Ezen túlmenően, a frekvencia a GG homozigóta szignifikánsan magasabb volt a metilezett csoportban, mint a nem metilált csoport (p < 0,0001) .table 2 A frekvenciákat a genotípusok között DAPK metilált és metilálatlan csoportok
DAPK metilálatlan
katalógusa DAPK denaturált Matton p értéke * Matton az alanyok száma katalógusa 231 katalógusa 296 katalógusa átlagéletkor ± SD katalógusa 59,6 ± 13,4 62,1 katalógusa ± 13,8 katalógusa 0.035 katalógusa férfi: nő katalógusa 137: 94 katalógusa 182: 114 katalógusa NS
H. pylori pozitivitás Matton 122/231 216/296 katalógusa
< 0,0001 katalógusa nem GC: GC katalógusa 211: 20 katalógusa 201: 95 katalógusa < 0,0001 katalógusa HRH2 rs2607474 genotípus katalógusa GG katalógusa 155 katalógusa 246
< 0,0001 # katalógusa GA
72 katalógusa 47 katalógusa AA katalógusa 4 katalógusa 3 katalógusa A allél gyakorisága katalógusa 17,3% katalógusa 9,0% katalógusa < 0,0001 katalógusa *: metilálatlanok vs. denaturált, #: gyakorisága GG homozigóta. katalógusa NS: nem szignifikáns. katalógusa gyakorisága rs2607474 genotípusok között Cdh1 denaturált és metilálatlanok csoportok
H. pylori
pozitív arány és GC /nem GC arány szignifikánsan magasabb volt a Cdh1 katalógusa denaturált csoportban, mint a metilálatlanok csoport, míg az átlagos életkor és a férfi /nő arány között a két csoport nem különbözött szignifikánsan (3. táblázat). A minor allél gyakorisága rs2607474 a metilezett csoport szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az metilálatlan csoportban (p = 0,0004, amelyben α = 0,05, 1-βpower = 0,946), és a frekvencia a GG homozigóta szignifikánsan magasabb volt a metilezett csoport, mint a metilálatlanok csoportban (p = 0,013) .table 3 a frekvenciákat genotípusok között Cdh1 denaturált és metilálatlanok csoportok
Cdh1 metilálatlanok Matton Cdh1 metilezendő Matton p érték * katalógusa
az alanyok száma katalógusa 281 katalógusa 246 katalógusa átlagéletkor ± SD katalógusa 60,6 ± 14,0 katalógusa 61,4 ± 13,3 katalógusa NS katalógusa férfi: nő katalógusa 165: 116
154: 92 katalógusa NS katalógusa H. pylori pozitivitás Matton 152/281 186/246 katalógusa katalógusa < 0,0001 katalógusa nem GC: GC katalógusa 262 : 19 katalógusa 150: 96 katalógusa < 0,0001 katalógusa HRH2 rs2607474 genotípus katalógusa G /G katalógusa 197 katalógusa 204 katalógusa 0.013 # katalógusa G /Egy fiatal 78
41 katalógusa A /Egy fiatal 6 katalógusa 1 katalógusa A allél gyakorisága katalógusa 16,0% 8,7% katalógusa katalógusa 0,0004 katalógusa *: metilálatlanok vs. denaturált, #: frekvencia GG homozigóta. katalógusa NS: nem szignifikáns. katalógusa kapcsolatos kockázat rs2607474 GG homozigóta DAPK és Cdh1 metiláció katalógusa Összességében rs2607474 GG homozigóta előnyhöz igen jelentős mértékben fokozódhat a fejlesztési DAPK katalógusa metiláció ( OR 2,43; 95% CI, 1,60-3,69; p < 0,0001; 4. táblázat). A nem-GC egyénekben GG homozigóta is szignifikánsan megnövekedett kockázata a fejlesztési DAPK katalógusa metiláció (OR 2,61; 95% CI, 1,62-4,20; p < 0,0001). Azonban megjelenik sem jelentős a kockázata a nem rákos nyálkahártya sem daganatos elváltozás alanyoknál GC (4. táblázat). A frekvencia a DAPK katalógusa metiláció nem volt szignifikáns különbség a két nem rákos nyálkahártya és daganatos elváltozás alanyokban GC (95/115 vs 104/115, p = 0,12) .table 4 veszélye -1018 GG homozigóta a fejlesztési DAPK metiláció katalógusa Átlag (527) Matton GG Matton GA Matton AA Matton GG vs A fuvarozó OR (95% CI) Matton p értéke Matton metilálatlanok (231) hotelben 155 katalógusa 72 katalógusa 4 katalógusa referencia -
metilezett (296 ) hotelben 246 katalógusa 47 katalógusa 3 katalógusa 2,43 (1,60-3,69) hotelben < 0,0001 katalógusa nem GC (412) hotelben metilálatlanok (211) hotelben 138
69 katalógusa 4 katalógusa referencia -
metilezett (201) hotelben 167 katalógusa 31 katalógusa 3 katalógusa 2,61 (1,62-4,20) hotelben < 0,0001
GC (115) hotelben (nem rákos nyálkahártya) hotelben metilálatlanok (20) hotelben 17 katalógusa 3 katalógusa 0 katalógusa referencia
- denaturált (95) hotelben 79 katalógusa 16 katalógusa 0 katalógusa 0,825 (0,379-3,73) hotelben 0,78 katalógusa (daganatos elváltozás) hotelben metilálatlanok (11) hotelben 10 katalógusa 1 katalógusa 0
referencia -
metilezett (104) hotelben 86 katalógusa 18 katalógusa 0 katalógusa 0,598 (0,069-5,19) hotelben 0,64 katalógusa logisztikus regressziós analízis, az életkort, a nemek és a H. pylori fertőzés állapotát.
(): a tárgyak száma.
Másrészt, rs2607474 GG homozigóta járt egy jelentősen megnövekedett kockázata a fejlesztési Cdh1 katalógusa, valamint DAPK katalógusa, metiláció (OR 2,07; 95% CI, 1,35-3,17; p = 0,0009; 5. táblázat). A nem-GC egyénekben GG homozigóta is összefüggött egy szignifikánsan nagyobb kialakulásának kockázata Cdh1 katalógusa metiláció (OR 2,25; 95% CI, 1,35-3,75; p = 0,0019). Azonban mutatott sem jelentős a kockázata a nem rákos nyálkahártya sem daganatos elváltozás alanyoknál GC (5. táblázat). A frekvencia Cdh1 katalógusa metiláció az alanyok GC szignifikánsan alacsonyabb volt a daganatos elváltozás, mint a nem rákos nyálkahártya (78/115 vs. 96/115, p = 0,009) .table 5 veszélye -1018 GG homozigóta fejlesztésére Cdh1 metiláció katalógusa Átlag (527) Matton GG Matton GA Matton AA Matton GG vs a fuvarozó OR (95% CI) Matton p értéke Matton metilálatlanok (281) hotelben 197 katalógusa 78 katalógusa 6 katalógusa referencia -
metilezett (246 ) hotelben 204 katalógusa 41 katalógusa 1 katalógusa 2,07 (1,35-3,17) hotelben 0,0009 katalógusa nem GC (412) hotelben metilálatlanok (262) hotelben 180 katalógusa 76
6
referencia -
metilezett (150) hotelben 125 katalógusa 24 katalógusa 1 katalógusa 2,25 (1,35-3,75) hotelben 0,0019 katalógusa GC (115 ) hotelben (nem rákos nyálkahártya) hotelben metilálatlanok (19) hotelben 17 katalógusa 2

• Zsírsavösszetétele bőr alatti zsírszövet és a gyomornyálkahártya: van kapcsolatban gyomorfekély?
• Helyi kiújulás gyomorrák totális gastrectomia után: szokatlan presentation