Kanker geassocieerde fibroblasten zijn positief gecorreleerd met metastatische potentieel van menselijke maagkanker

Kanker geassocieerde fibroblasten zijn positief gecorreleerd met metastatische potentieel van menselijke maagkanker
Abstract achtergrond
De prognose voor patiënten met maagkanker is moeilijk te voorspellen, omdat defecten het vaststellen van de chirurgische pathologische. Kanker geassocieerde fibroblasten (cafe's) bleken belangrijke rol spelen bij het bevorderen van tumorgroei, invasie en metastase. Zo verhoogt de hypothese dat de mate van prevalentie cafe's kunnen helpen om de prognose maagkankerpatiënten stellen.
Werkwijzen
Immunochemiesysteem en realtime-PCR-experimenten werden uitgevoerd om de expressie van eiwitten die specifieke markers cafe's zijn te vergelijken of afgescheiden door CAF in de tumor en normale weefselmonsters. De omvang van de cafe's 'prevalentie werd ingedeeld op basis van immunochemische kleuring, en correlatie werd verder geanalyseerd tussen cafe's' prevalentie en andere tumor kenmerken die de prognose van maagkanker patiënten kunnen beïnvloeden.
Resultaten
Bijna 80 procent van de normale maag weefsels waren negatief of zwak positief voor cafe's kleuring, terwijl meer dan 60 procent van maagkanker weefsels matige of sterk positief voor cafe's kleuring waren. Realtime PCR-resultaten toonden ook significant verhoogde expressie van FAP, SDF-1 en TGF-β1 bij maagkanker weefsels in vergelijking met normale gastrische weefsels. Verdere analyse toonde aan dat de prevalentie CAF werd gecorreleerd met tumorgrootte diepte van de tumor, lymfeknoop metastasen, levermetastasen of het buikvlies metastase.
Conclusies
Reactive kanker geassocieerde fibroblasten (cafe's) werden vaak verzameld in maagkanker weefsels en de prevalentie van cafe's was gecorreleerd met de grootte van de tumor, de diepte van de tumor en tumor metastase, dus geven enkele dragers voor het vaststellen van de prognose van de maag-kankerpatiënten. achtergrond
maagkanker is de tweede belangrijke oorzaak van kanker- gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Aanzienlijke geografische verschillen bestaan ​​in de incidentie van maagkanker en vertegenwoordigt de meest voorkomende kanker bij China [2]. Steeds meer maagkanker patiënten zijn gediagnosticeerd in de afgelopen jaren met het veranderen van voeding en leefstijl en de ontwikkeling van diagnostische procedures. Hoewel chirurgische behandeling is effectief gebleken voor sommige vroege maagkanker, waaronder totale gastrectomie en uitgebreide groep gastrectomie zijn, de prognose voor deze patiënten is wegens herhaling na de operatie, in de vorm van lymfatische verspreiding, door bloed overgedragen metastase of peritoneale verspreiding [3]. Ondernemingen de prognose voor patiënten met maagkanker is aangetoond worden beïnvloed door verschillende gevestigde chirurgische pathologische functies, zoals de pathologische stadium, de locatie van de tumor en het weefseltype en de graad van de tumor [ ,,,0],4]. Terwijl Aurello et al. [5] hebben aangetoond dat het aantal knooppunten moeten worden gesloten N0 kan variëren afhankelijk van de diepte van tumorinvasie (T), de TNM vereist het ophalen en analyse van ten minste 15 lymfklieren voor nauwkeurige staging. In de meeste gevallen, het aantal knooppunten ontleed kleiner en slechts 20-30% van de patiënten de aanbevolen minimale ontleding van 15 knopen. Accessorial indicatoren waar bescheiden van de prognose maagkanker patiënten verstrekt nodig zijn.
Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF), een van de belangrijke stromale cellen die vaste tumoren, is gebleken dat prominente rol spelen bij het bevorderen van tumorgroei en progressie [6]. In tegenstelling tot fibroblasten rusten, cafe's bezitten een geactiveerd fenotype en kan worden geïdentificeerd door hun expressie van fibroblast-specifiek eiwit 1 (FSP1), vimentine, desmine en α-gladde-spieractine [7]. CAF communiceren onderling en met kankercellen en inflammatoire en immuuncellen rechtstreeks via cel contact en indirect via paracriene /exocriene signalering, proteasen, en modulatie van de extracellulaire matrix (ECM). Dit complex communicatienetwerk is cruciaal voor het verstrekken van de juiste micro-omgeving om het ontstaan ​​van tumoren, angiogenese en metastase [8, 9] ondersteunen. Bovendien, in vergelijking met getransformeerde tumorcellen, cafe's zijn genetisch homogeen [10] en is aangetoond door Gastavo et al die reactief stroma kan fungeren als een voorspeller van herhaling bij prostaatkanker [11], vertegenwoordigen aldus een aantrekkelijke predictor of therapeutisch target voor tumor patiënten.
in deze studie hebben we verzamelde 100 gevallen van chirurgische resectie exemplaren van primaire maagkanker evenals normaal de maag weefsels (meer dan 5 cm ver van tumorweefsel) van januari 2007 tot juni 2007 in de Tweede Militaire Medische Universiteit gelieerde Changhai ziekenhuis (Shanghai, China). Immunochemie en RT-PCR-experimenten werden uitgevoerd om de expressie van eiwitten die specifieke merkers van CAF of uitgescheiden door CAF in de tumor en normale weefselmonsters zijn te vergelijken. De omvang van de cafe's 'prevalentie werd ingedeeld op basis van immunochemische kleuring, en correlatie werd verder geanalyseerd tussen cafe's' prevalentie en andere tumor kenmerken die de prognose van maagkanker patiënten kunnen beïnvloeden.
Methods
Cohort Inschrijving
Honderd gevallen van primaire maagkanker patiënten werden geïncludeerd van januari 2007 tot juni 2007 in de Tweede Militaire Medische Universiteit gelieerde Changhai ziekenhuis. Alle patiënten hebben schriftelijk toestemming verstrekt. Toelatingscriteria voor dit onderzoek zijn: (a) geen preoperatieve chemotherapie; (B) pathologisch of cytologisch gevalideerd maag-adenocarcinoom; (C) de leeftijd tussen 18-85 jaar; (D) verwachte levensduur > 3 maanden; (E) WBC > 3,5 × 10 9 /l; PLT > 10 11 /L; Hb > 100 g /l; Serumcreatinine niet meer dan 1,25 maal de normale bovengrens; GPT en ALP niet meer dan 1,25 maal de normale bovengrens; Totaal bilirubine niet meer dan 1,5 maal de normale bovengrens; PT < 12s; en (f) geen ernstige ziekte van het centrale zenuwstelsel.
Pathologisch analyse Leer Alle specimens waaronder tumorweefsels en normale maag weefsels die meer dan 5 cm ver was van tumorweefsels in 10% formaline binnen 30 minuten na chirurgische resectie werden vastgesteld. Paraffine ingebedde seriecoupes (4 pm) werden bereid. Tumordifferentiatie werd gekenmerkt volgens de WHO classificatie (2000), terwijl de TNM classificatie werd uitgevoerd volgens de International Union Against Cancer, vijfde editie (1997).
Immunochemie
Antibody gebruikt in deze procedure omvat konijn anti-FSP1 polyklonaal antilichaam ( Abcam, 01:50), muis anti-α-SMA monoklonaal antilichaam (Sigma, 1A4, 1: 200), anti-rat procollageen I monoklonale antilichaam (Chemicon, Mab1912, 1: 500), biotine-geconjugeerd rat anti-muis IgG polyklonaal antilichaam (eBioscience, 13-4013, 1: 100), biotine-geconjugeerd muis-anti-rat IgG polyklonaal antilichaam (eBioscience, 13-4813, 1: 100) en biotine-geconjugeerd muizen anti-konijn IgG polyklonaal antilichaam (BD PharMingen, C101-167, 1: 100). Immunochemische analyse werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [12]. Kort samengevat, paraffinesecties werden de-paraffinized in xyleen en een reeks van gegradeerde alcohol oplossingen. De secties werden daarna behandeld met 0,3% waterstofperoxide (H2O2) in water gedurende 10 minuten om endogeen peroxidase activiteit in het weefsel te blussen en de niet-specifieke bindingsplaatsen werden geblokkeerd met 0,5% runderserumalbumine (BSA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur . Vervolgens werden de secties gedurende 15 minuten in aanwezigheid van het primaire antilichaam, en vervolgens werden de glaasjes gewassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,1% Tween 20 (PBS /Tween) gedurende 15 minuten terwijl het veranderen van de oplossing 3 keer vóór de toepassing van het gebiotinyleerde secundaire antilichaam. De glasplaatjes werden geïncubeerd met het secundaire antilichaam gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geroerd voordat het gedurende 15 minuten gewassen in PBS /Tween dat 3 maal veranderd. De coupes werden vervolgens gedurende 15 minuten met een avidine-gebiotinyleerd mierikswortelperoxidase complex, en de reactie zichtbaar gemaakt met 0,02% 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride als chromogeen in een Tris-HCl-buffer, pH 7,6, bevattende 0,03% H2O2. Hematoxyline werd gebruikt om de kernen tegenkleuring.
Histologische analyse Belgique Om het niveau van FSP1, α-SMA en procollageen-I expressie, het percentage positieve-gekleurde cellen te evalueren werden beoordeeld op een schaal van 0-3, met minder dan 5% positief-kleurende cellen als graad 0, 5-25% per graad 1, 26-50% als graad 2, en meer dan 50% als klasse 3. en de intensiteit van de kleuring ook beoordeeld op een schaal van 0- 2, met een negatieve zwakke intensiteit als graad 0, zwak tot matige intensiteit als graad 1, en matige tot sterke intensiteit als rang 2. Tien high-power velden willekeurig onafhankelijk werden geselecteerd voor elke dia's en geanalyseerd door twee pathologen. Voor elke markering, de score van het percentage en de intensiteit was vermenigvuldigd en de scores voor deze drie markers werd toegevoegd wanneer deze markers gezamenlijk werd geanalyseerd. En de uiteindelijke score tussen 0-6 werd bepaald als negatief (-), score tussen 7-9 werd bepaald als zwak positief (+), score tussen 10-12 werd bepaald als gematigd positief (++), en score hoger dan 13 werd bepaald als sterk positief (+++).
Realtime PCR-
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit tumor- of normale weefsels van Trizol reagens (Invitrogen) en eerste streng cDNA werd gesynthetiseerd met behulp RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit ( Fermentas, USA) zoals eerder beschreven [13]. Realtime PCR werd uitgevoerd met LightCycler DNA Master SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. De kopieën van target cDNA werden genormaliseerd door GAPDH expressie.

FAP F:: 5'-TGGGAATATTACGCGTCTGTCTAC-3 '
FAP R: 5'-GATAAGCCGTGGTTCTGGTCA-3'
SDF-1 primers voor FAP, SDF-1, werden TGF-β1 en GAPDH als volgt opgesomd F: 5'-CCGTCAGCCTGAGCTACA-3 '
SDF-1 R: 5'-GAAGGGCACAGTTTGGAG-3'
TGF-β1 F: 5'-GCAACAATTCCTGGCGATAC-3 '
TGF-β1 R: 5' AAGGCGAAAGCCCTCAAT-3 '
GAPDH F: 5'-ATCAAGTTGCGTGCTGTG-3'
GAPDH R: 5'-TGCGAAATGAAAGGAGTGT-3 '
Voor elke doelgroep cDNA, de kopieën van de normale weefselmonsters wordt gemiddeld en de kopieën van elke tumorweefsel wordt gedeeld door het gemiddelde dan de resultaten van deze drie doelwit cDNA toegevoegd per tumorweefsel. Indien de som gelijk is aan of groter dan 8 is, dan het tumorweefsel wordt als positief voor CAF is.
Statistische analyse
Data zijn weergegeven als gemiddelde en standaardafwijking. Statistische analyses van de gegevens werden geanalyseerd met de tweezijdige onafhankelijke Student's t-test en χ 2 analyse met SPSS 12.0. Het niveau van de statistische significantie werd vastgesteld op P < 0.05.
Resultaten
Reactive tumor-geassocieerde fibroblasten waren overwegend in maagkanker weefsels Belgique Om de omvang van de prevalentie cafe's 'bij maagkanker weefsels te bepalen, in paraffine ingebedde coupes van weefselmonsters werden bereid en gekleurd voor FSP1, α- SMA en procollageen I expressie zoals hierboven beschreven. Daarnaast werd realtime-PCR uitgevoerd om het expressieniveau van verscheidene eiwitten waarvan werd uitgedrukt en afgescheiden door reactieve CAF, zoals FAP, SDF-1 en TGF-β1 bepalen.
Resultaten van immunochemische kleuring toonde aan dat reactiever fibroblasten waren aanwezig bij maagkanker weefsels dan normale gastrische weefsels. Vierentwintig van de 100 normale monsters waren negatief (-) aan reactief fibroblasten vlekken en 55 normale monsters waren zwak positief (+). En het aantal normale specimens die matig waren (++) of sterk positief (+++) waren 21 en 0, respectievelijk. Terwijl betreffende kankerweefsel, waren 13, 26, 25 en 36 monsters die negatief waren (-), zwak positief (+), matige positief (++) en sterk positief (+++) voor fibroblast kleuring (Fig 1a en figuur 1b). Als tumormonsters ingedeeld als negatief of zwak positief als negatief, en matige of sterk positief werden beschouwd werden als positief, er een significant verschil tussen tumor- en normale weefsels positief over de snelheid van cafe's (figuur 1c). Figuur 1 Immunochemie analyse van de rang van de prevalentie cafe's 'in de tumor en de normale maag weefsels. Paraffinesecties chirurgisch weggesneden tumor en normale weefsels van dezelfde maagkanker patiënten (100 gevallen) werden gekleurd voor FSP1, α-SMA en procollageen-1 expressie en CAF prevalentie werd gedifferentieerd zijn naar de positieve verhouding en de intensiteit van de immunochemische kleuring. Het aantal tumor- of normale weefselmonsters ingedeeld, -, +, ++ en +++ werd vergeleken (a). En de verdeling van deze vier soorten prevalentie cafe's in de tumor of 100 normaal weefsel monsters werden geanalyseerd (b). Grade - en + werd beschouwd als negatief, terwijl de kwaliteit ++ en +++ werd als positief voor cafe's prevalentie beschouwd, dan is het nummer van de tumor of normaal weefsel monsters, die positief of negatief is voor de prevalentie cafe's 'was vergeleken (c).
voor mRNA-expressie van de eiwitten toonden de resultaten dat de expressie van deze eiwitten in tumormonsters waren verhoogd vergeleken met deze in normale weefsels. FAP nemen als een voorbeeld, de mRNA-expressieniveau van FAP in tumormonsters werd 4 maal hoger dan in normale weefsels (Figuur 2a). En er waren ook 3 keer verhoging van mRNA expressie niveau met betrekking tot SDF-1 (Fig 2b) of TGF-β1 (figuur 2c). Figuur 2 Realtime-PCR-analyse van uitgescheiden eiwitten door CAF in tumor en normale gastrische weefsels. Totaal RNA werd extract en cDNA werd bereid uit chirurgisch weggesneden tumor en normale weefsels van dezelfde maagkanker patiënten (100 gevallen). Realtime-PCR werd uitgevoerd om het expressieniveau van FAP (a), SDF-1 (b) en TGF-β1 (c) vergelijken tumor en normale weefsels, de eerste twee lanen van de elektroforetogram vertegenwoordigde normale weefsels en de laatste twee lanen vertegenwoordigd tumor weefsels. *: P < 0,01.
Uit deze resultaten kunnen we concluderen dat reactief CAF heersten gastrische tumorweefsels en geheime hoog eiwitten waarvan is aangetoond essentieel voor tumorgroei, invasie en metastase. Prevalentie
CAF "was nauw verband met invasieve en metastatische eigenschappen van maag tumor Belgique Om vast te stellen of de rang van de cafe's prevalentie en andere clinicopathologische 'prevalentie kan worden geserveerd als een voorspeller voor de prognose van maagkanker patiënten werd correlatieanalyse uitgevoerd tussen de rang van cafe's worden uitgevoerd' parameters van maagkanker. Tumor specimens ingedeeld als negatief of zwak positief werden beschouwd als negatief, en matige of sterk positief werden beschouwd als positief in deze analyse. Patiënt en tumor eigenschappen zijn beschreven in tabel 1. We kunnen ook in tabel 1 dat er geen correlatie tussen prevalentie CAF en leeftijd, geslacht van de patiënt of de plaats van de tumor. Er was een stijging van de prevalentie cafe's "indien de tumordifferentiatie daalde van goed gedifferentieerd (43,75%) slecht gedifferentieerde (64,00%), terwijl de positieve percentage cafe's in ongedifferentieerde maagkanker slechts 26,67%, veel minder dan die goed of slecht gedifferentieerde maagkanker, dus we konden niet de correlatie tussen de cafe's 'prevalentie en tumordifferentiatie (P = 0,56) te vinden. Terwijl betreffende tumorgrootte diepte van de tumor (T) en lymfeklier (N), toonde aan dat er een statistisch significante correlatie tussen de prevalentie van cafe's en deze tumorkarakteristieken met hogere positieve percentage cafe's in grotere tumoren, meer invasieve tumoren en tumoren meer lymfeknoop metastase. Ook vinden we dat de positieve snelheid van cafe's was hoog in de maag kanker met levermetastasen (P < 0,01) of het buikvlies metastase (P < 0,01) .table 1 Patiënt en tumor kenmerken en hun relatie met de cafe's prevalentie

N
Positief voor cafe's N (%)
P waarde
Leeftijd (jaar)
2.77a
≤60
47
22 (46,81) Restaurant > 60
53
29 (54,72)
Sex
5.11a
Male
57
32 (56,14)
Female
43
19 (44,19)
locatie van de tumor
1.35b
proximale uiteinde van de maag (1/3)
13
9 (69,23)
Gastric lichaam (1/3)
19
9 (47,37)
Remote einde van de maag (1/3)
51
22 (43,14)
Meer dan 1/3 van de maag betrokken
17
11 (64,71)
Tumor differentiatie
0.56b
goed gedifferentieerd
16
7 (43.75)
Gematigd gedifferentieerd
44
24 (54,55)
slecht gedifferentieerde
25

• Vaststelling en karakterisering van een metastase model van menselijke maagkanker in naakt mice
• Detectie van sentinel en non-schildwachtklier micrometastasen door volledige seriële snijden en immunohistochemische analyse voor de maag cancer