Ezrin sovraespressione predice la prognosi infausta di adenocarcinoma gastrico
Abstract
sfondo
Ezrin è una proteina del citoscheletro che è coinvolta nella crescita del tumore e l'invasione. È stato suggerito che l'espressione Ezrin svolge un ruolo importante nella metastasi tumorali. Questo studio si propone di indagare il significato clinicopatologica di Ezrin sovraespressione in adenocarcinomi gastrici.
Metodi
espressione della proteina Ezrin è stata esaminata mediante immunoistochimica in 26 normale mucosa gastrica, 32 displasia, e 277 adenocarcinomi gastrici. Il rapporto tra l'espressione Ezrin e le caratteristiche clinico-patologici dei tumori gastrici è stato analizzato. Inoltre, una linea di cellule di cancro gastrico, MKN-1, è stato utilizzato anche per immunofluorescenza per valutare la distribuzione di proteine Ezrin.
Risultati
Ezrin proteina localizzata nel citoplasma e /o membrana nei migrazione di cellule di cancro gastrico , ed è principalmente concentrata al sito protrusione; tuttavia, solo la distribuzione citoplasmatica è stata osservata nelle cellule tumorali non migrante di immunofluorescenza. Il tasso positivo di espressione della proteina Ezrin era significativamente più alta in adenocarcinoma gastrico e displasia rispetto a quelle della normale mucosa gastrica. Inoltre, la frequenza espressione della proteina Ezrin è aumentato in modo significativo in metastasi linfonodali e stadi clinici in ritardo. Coerentemente, forte espressione di Ezrin è risultata significativamente correlata con una scarsa prognosi del cancro gastrico.
Conclusione
La rilevazione di espressione Ezrin può essere utilizzato come marcatore per la diagnosi precoce e la prognosi di adenocarcinoma gastrico.
Virtuale diapositive
La slitta virtuale (s) per questo articolo può essere trovato qui: http://www.diagnosticpathology.diagnomx.eu/vs/2303598677653946
Parole
adenocarcinoma gastrico Ezrin Tissue microarray Introduzione
cancro gastrico è uno dei tumori maligni più fatali in tutto il mondo. La prognosi infausta è associata con una vasta invasione locale e /o regionale metastasi linfonodali [1]. recidiva locale rimane la causa di decessi correlati al cancro dopo la resezione di una parte sostanziale di pazienti con cancro gastrico. Pertanto, la definizione di criteri affidabili per predire ricorrenza e di identificare i tumori è di grande interesse non solo per la comprensione dei processi molecolari e cellulari coinvolti nella tomorigenesis, ma anche per la ricerca di possibili nuovi bersagli molecolari terapeutici [2]. Metastasi tumorali avviamenti
con ripartizione di integrità epiteliale, seguito da cellule maligne invadono nello spazio circostante stroma e linfovascolare, con cui le cellule tumorali si recano in organi bersaglio distante [3, 4]. molecole di adesione cellulare e actina citoscheletro svolgono un ruolo cruciale nella metastasi tumorali [5, 6]. Il meccanismo principale per la maggior parte dei tipi di migrazione delle cellule è il citoscheletro di actina rimodellamento [7]. La proteina del citoscheletro Ezrin è un membro della famiglia Ezrin-radixin-Moesin (ERM) che è legata al comportamento del tumore aggressivo, coinvolgendo tutte le fasi della metastasi tumorali [7, 8] tra cui l'adesione cellulare, la sopravvivenza, la motilità e la trasduzione del segnale [9 -11].
pubblicazioni recenti hanno dimostrato che Ezrin è fortemente espresso in una varietà di tumori invasivi, tra cui l'osteosarcoma, il melanoma, il sarcoma dei tessuti molli, carcinoma pancreatico, carcinoma epatocellulare e gastriche e della mammella [2, 11-17]. Ci sono prove accumulando suggerendo che Ezrin è un fattore determinante metastatica e una componente chiave nella metastasi tumorali, tuttavia, il suo esatto ruolo nel cancro gastrico è ancora sconosciuta. . Bal et al [18] ha riferito che c'era una correlazione negativa tra Ezrin e metastasi linfonodali, linfovascolare Space Invasion, e l'invasione perineurale in tutti i carcinomi gastrici, ma non era statisticamente significativa (P > 0,05), mentre nessuna associazione con la profondità dell'invasione, localizzazione del tumore, le dimensioni del tumore e metastasi a distanza (P > 0,05). Tuttavia, Zhao et al. [19] e Li et al. [20] hanno riportato che l'espressione positiva di Ezrin correlata con l'età, dimensioni del tumore, la posizione, la fase di differenziazione, profondità di invasione, invasione vascolare, linfonodi e metastasi a distanza, e TNM fase (P < 0,05). Nel presente studio, abbiamo quindi puntato a studiare l'espressione della proteina Ezrin in adenocarcinoma gastrico umano e le sue lesioni precancerose, e di esplorare il proprio rapporto di espressione Ezrin ai risultati clinici ed i parametri istologici di tumori gastrici.
Materiali e metodi
campioni clinici
totale 335 campioni di tessuto, tra cui 277 casi di adenocarcinoma gastrico, 32 casi di displasia e 26 normali tessuti gastrici, sono stati raccolti da Shanghai Outdo Biotech Co. Ltd. (Outdo Biotech) e Dipartimento di Patologia, The Ospedale Terzo popolare affiliata di Shanghai Jiaotong University. Tutti i tessuti sono stati regolarmente fissati in 10% formalina tamponata e inclusi in blocchi di paraffina. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico di Yanbian University Medical College.
I parametri patologici, tra cui l'età, il sesso, tipi istologici, la differenziazione, la presenza di metastasi linfonodali, stadio clinico e sopravvivenza libera da malattia, sono stati accuratamente rivisto tutti i 277 adenocarcinomi gastrici. Le età dei pazienti variava 36-78 anni con un'età media di 51,7 anni. Il rapporto maschi-femmine è di 164: 113. Dei 277 adenocarcinoma gastrico comprendeva 39 casi di stadio TNM 0, 98 casi di stadio TNM I (stadio TNM IA = 47, stadio TNM IB = 51), 75 casi di stadio TNM II, 59 casi di stadio TNM III, e 6 casi di TNM stadio IV. In quali, 85 casi erano adenocarcinoma ben differenziato, 103 casi come moderatamente differenziato, 59 casi come scarsamente differenziato, 5 casi come indifferenziata, 9 casi come carcinomi a cellule anello con sigillo, e 16 casi come adenocarcinoma mucinoso. Per i tipi di Lauren, 117 casi erano tipo intestinale, 139 casi il tipo di diffuso, e 21 casi come tipi misti. Stadiazione TNM è stata valutata secondo il sistema di stadiazione stabilito dal Comitato americano congiunto sul cancro (AJCC) [21]. Dei 277 adenocarcinomi gastrici, 151 casi sono stati linfonodi (LN) di metastasi negativo, e 126 casi sono stati LN meatastasis positivi. In totale 277 degli adenocarcinomi gastrici, 54,9% (152/277) dei casi sono stati più di tre anni di sopravvivenza libera da malattia. Inoltre, i normali tessuti della mucosa gastrica sono stati ottenuti dai margini di resezione del campione radicali di cancro gastrico.
Immunofluorescenza colorazione per la proteina Ezrin nelle cellule tumorali in vitro
linea di cellule di cancro gastrico MKN-1 è stato coltivato su vetrini al 100% di confluenza, e poi ha continuato a coltura con FBS medio gratuita per 24 ore dopo essere stato graffiato da una nuova punta della pipetta 200 microlitri per la ricerca delle cellule che migrano. Le cellule sono state quindi fissate con 4% paraformaldeide per 10 minuti e permeabilizzate con 0,5% TritonX-100 per 10 minuti dopo 24 ore. Il blocco è stato eseguito con il 3% di albumina bovina V (A8020, Solarbio, Pechino, Cina) per un'ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state incubate con l'anticorpo contro Ezrin (1: 100,ĺ5, Cell Signaling Technology di Boston, USA) per due ore, e seguite l'incubazione da Alexa Fluor
®488 capra anti-IgG di coniglio ( H + C) (A11008, Invitrogen, USA) per un'ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state di contrasto con 49-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (C1006, Beyotime, Shanghai, Cina), ei vetrini sono stati montati con Antifade Mounting Medium (P0126, Beyotime, Shanghai, Cina) . Infine, i segnali di immunofluorescenza sono stati visualizzati e registrati da Leica SP5II microscopio confocale.
Immunoistochimica per la proteina Ezrin nei tessuti inclusi in paraffina
kit Dako LSAB (Dako, Glostrup, Danimarca) è stato utilizzato per immunoistochimica. E le 4 sezioni di tessuto micron di spessore seriali sono stati preparati su vetrini rivestiti di silano (Sigma, St Louis, MO, USA) e deparaffinate, reidratati e incubate con il 3% H 2O 2 in metanolo per 5 minuti a temperatura ambiente per eliminare attività perossidasica endogena. L'antigene è stato recuperato a 95 ° C per 20 minuti ponendo i vetrini in 10 mM tampone citrato di sodio (pH 6,0). I vetrini sono state poi incubate con l'anticorpo primario Ezrin (1:50,ĺ5, Cell Signaling Technology di Boston, Stati Uniti d'America) a 4 ° C per una notte. Dopo incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti con anticorpo secondario biotinilato, i vetrini sono stati incubati con complesso streptavidina-perossidasi a temperatura ambiente per 30 minuti. Immunocolorazione è stato sviluppato utilizzando cromogeno, 3,3 'Diaminobenzidina, e di contrasto con ematossilina di Mayer. IgG di coniglio isotopo utilizzato come controllo e il risultato è negativo. Inoltre, le sezioni di tessuto positivi sono stati elaborati omettendo l'anticorpo primario come controlli negativi.
Interpretazione di colorazione immunoistochimica
Tutti i vetrini sono stati valutati indipendentemente da due ricercatori (Lin Piao Z e Y) essendo cieco a tutti i dati clinici. I criteri di interpretazione sono stati descritti in precedenza da Elzagheid A et al. [22]. Brevemente, linfociti serviti come riferimento per forte immunoreattività (Figura 1), e l'immunoreattività è stata classificata in quattro categorie: +++ (punteggio 3) = simile alla colorazione linfociti; ++ (Punteggio 2) = meno di +++; + (Punteggio 1) = distinguibile dalla colorazione di fondo; e - (punteggio 0) = completamente negativo. Solo l'espressione citoplasmatica e di membrana è stata considerata come una colorazione positiva e le forti mezzo positivo '++' e '+++' cellule positive. Figura 1 colorazione immunofluorescenza per Ezrin proteine nelle colture di MKN-1 le cellule (rosso per Ezrin proteine & blu per DAPI). proteine Ezrin trova nel citoplasma e membrane in coltura MKN-1 migrazione delle cellule di cancro gastrico, ed è concentrata principalmente nel sito protrusione membranosa (Figura 1, 24 h); tuttavia, proteine Ezrin trova solo al citoplasma delle cellule tumorali-migrazione non (Figura 1, 0 h).
Analisi statistica
analisi statistica è stata effettuata utilizzando il Chi-square (x
2- prova) prova e prova medio-Whitney di software SPSS per Windows, versione 17.0 (SPSS, Chicago, USA). p-value inferiore a 0,05 considerati significativi.
Risultati
Le caratteristiche di localizzazione delle proteine Ezrin e distribuzione
di osservare la localizzazione della proteina Ezrin nella migrazione e non migrazione delle cellule tumorali, il colto MKN-1 cancro gastrico le cellule sono state graffiati da una nuova 200 microlitri pipetta punta (Figura 1), e quindi la colorazione di immunofluorescenza per la proteina Ezrin è stato fatto. Si è trovato che la proteina Ezrin trova al citoplasma e /o membrana nelle migrano MKN-1 cellule, e principalmente concentrata al sito protrusione; Tuttavia, solo la distribuzione citoplasmatica è stata osservata nei non migrante MKN-1 le cellule di immunofluorescenza (Figura 1). Per le sezioni di tessuto, i segnali diffusamente e fortemente positivi per la proteina Ezrin è stata rilevata nel citoplasma delle cellule di cancro gastrico, tuttavia cellule positive negative o dispersi, le cellule di riserva principalmente basali, è stata osservata nel normale epitelio gastrico mediante immunoistochimica. È interessante notare che le singole cellule tumorali sparse o invasivo loci cancro al stroma spesso mostrato con forza e immunoreattività più intensa per Ezrin proteine (Figura 2). Figura 2 immunoreattività per Ezrin proteine nelle lesioni gastriche. La colorazione immunoistochimica per Ezrin proteine nel tissuearray di adenocarcinoma gastrico (A). cellule positive sparse (frecce) per le proteine Ezrin sono stati visti al citoplasma delle cellule basali di riserva in mucosa gastrica normale (B-A) (200 ×). Le cellule di cancro gastrico hanno dimostrato fortemente e diffusamente colorazione positiva per Ezrin proteine (B-B) (200 ×). singole cellule tumorali sparse e invasivo loci cancro al stroma mostrato immunoreattività intenso per Ezrin proteine (frecce) (Bc) (200 ×).
Correlazione tra iperespressione della proteina Ezrin e parametri clinici di tumori gastrici
proteine Ezrin ha mostrato una maggiore positività in adenocarcinoma gastrico (punteggio 1, 79,8%, 221/277; punteggio 2, 60,6%, 168/277) rispetto alla adiacente normale mucosa gastrica (punteggio 1, del 19,2%, 5/26, segnare 2, 0, 0/26 ). Inoltre, la proteina Ezrin era fortemente positiva nella displasia gastrica (punteggio 1, 65,6%, 21/32, segnare 2, 37,5%, 12/32) in immunoistochimica, che era anche significativamente più alto rispetto ai normali tessuti gastrici (punteggio 1, 19,2%, 5/26; punteggio 2, 0%, 0/26). Allo stesso modo, Lauren intestinale (65,8%, 77/117) e diffusa (61,2%, 85/139) tipi di cancro gastrico anche determinati fortemente tasso di espressione della proteina Ezrin rispetto al tipo misto (28.6%, 6/21) casi (P < 0,05). (Figures2 & 3, tabelle 1 & 2). Figura 3 proteine Ezrin ha dimostrato significativamente più elevata positività in adenocarcinoma gastrico e displasia rispetto alla mucosa gastrica normale adiacente (A), e il suo livello di espressione era significativamente più alta in fase avanzata (fase II, Fase III e IV stadio) di tumori gastrici rispetto nella fase iniziale (fase 0, stadio IA e IB fase) casi (B). Inoltre, fortemente espressione della proteina Ezrin è stato rilevato in Lauren tipo intestinale e diffusa degli adenocarcinomi gastrici che esso nei casi di tipo misto (C). Ezrin proteine sovraespressione mostrato da vicino correlazione con lo stato metastatico (D) e la sopravvivenza libera da malattia di adenocarcinoma gastrico (E).
Tabella 1 espressione della proteina Ezrin in adenocarcinoma gastrico
Diagnosi
Numero di casi
casi
positivi
tasso positivo (%)
tasso fortemente positivo (%) sull'oggetto - + ++ +++
adenocarcinoma gastrico
277
56 53 102 66
79,8% **
60,6% **
displasia
32
11 9 12 0
65,6% *
37.5 % *
normale mucosa
26
21 5 0 0
19,2%
0
Rispetto mucosa normale * P < 0.05, ** P < 0.01. Fortemente positivo:. ++ E +++
Tabella 2 Relazione tra iperespressione della proteina Ezrin e le caratteristiche clinico-patologici di adenocarcinoma gastrico
Caratteristiche cliniche
No. dei casi
casi fortemente positiva (%)
P-value
Età
< 50
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