Magenkrebs-Zellüberstand verursacht Apoptose und Fibrose in der Bauch Gewebe und führt zu einer günstigen Umfelds für die Peritonealmetastasen, in vitro und in vivo

Magenkrebs-Zellüberstand verursacht Apoptose und Fibrose in der Bauch Gewebe und führt zu einer günstigen Umfelds für die Peritonealmetastasen, in vitro und in vivo

Zusammenfassung
Hintergrund
In dieser Studie untersuchten wir Wirkungen von löslichen Faktoren, die von Magenkrebszellen auf peritoneale Mesothelzellen in vitro freigesetzt
und in vivo
.
Methoden
HMrSV5, eine humane peritoneale Mesothelzellen wurde mit Überständen von Magenkrebszellen inkubiert. Morphologische Veränderungen der HMrSV5 Zellen beobachtet. Apoptosis of HMrSV5 Zellen wurde unter einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet und quantitativ durch MTT-Assay und Durchflusszytometrie bestimmt. Ausdrücken der Apoptose-verwandten Proteinen (Caspase-3, Caspase-8, Bax, bcl-2) wurden immunochemisch ausgewertet.
Ergebnisse
Conspicuous morphologischen Veränderungen anzeigt apoptosis in HMrSV5 Zellen beobachtet wurden 24 h nach der Behandlung mit den Überständen von Magenkrebszellen. In vivo
, behandelt Peritonealdialyse Gewebe mit Überstand Magenkrebszellen wesentlich verdickt und umfangreiche Fibrose enthalten.
Schlussfolgerungen
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Überstände von Magenkrebszellen Apoptose und Fibrose bei HMrSV5 menschlichen peritonealen Mesothelzellen durch induzieren kann Überstände in den frühen peritonealen Metastasierung in einer zeitabhängigen Art und Weise und zeigen an, daß lösliche Faktoren in die Bauchhöhle, die Morphologie und Funktion von Mesothelzellen beeinflussen, so dass die resultierende Umwelt günstig Peritonealmetastasen werden kann.
Schlüsselwörter Peritonealkarzinose Magentumoren Mesothelzellen Apoptosis Fibrosis Hintergrund
Peritonealkarzinose schränkt die Verbesserung der Magenkrebs-Patienten 'Prognosen nach der Operation [1]. Peritoneale Metastasen führt zu einer metastatischen Kaskade tritt im Allgemeinen bei der späten Phase der Tumorentwicklung, die Magen-Krebs im Zusammenhang trägt wesentlich zur Sterblichkeit. Die Mechanismen der peritonealen Metastasierung von diffus Karzinom infiltriert sind nicht klar verstanden.
Die Peritonealdialyse Stroma-Umgebung Proliferation von Tumorzellen begünstigt, indem sie als reiche Quelle von Wachstumsfaktoren dienen und Chemokine bekannt, bei der Tumormetastasierung beteiligt zu sein. Die Moleküle dieser Kaskade vermittelnde wurden nicht umfassend untersucht worden [2]. Berichten zufolge könnte Mesothelzellen Krebsinvasion und durchlaufen morphologische Veränderungen in Reaktion auf die löslichen Faktoren veröffentlicht von Krebszellen [3] zu verhindern. Die spezifischen Moleküle in diesem Prozess beteiligt sind, durch intrinsische Eigenschaften der metastatischen Tumorzellen bestimmt. Die Tumorzellen müssen fest auf die submesothelialen Monoschicht zu befestigen und die mesothelial einschichtigen für die Invasion durchdringen. Buck et al.
[4] untersuchten die Schutzwirkung der Mesothelzellen Schicht, eine Rattenmodell, in dem das Mesothelzellen Auskleidung des parietalen Bauchfells wurde in den Versuchsratten, so dass die Basalmembran intakt abgezogen. Wir zeigten früher, dass die Schicht von konfluenten, intakte Mesothelzellen Invasion von Krebszellen aus der Bauchhöhle verhindert. Sobald jedoch die Integrität dieser Barriere gestört wird, kann Metastasen auftreten, weil das Peritoneum ein günstiges Umfeld für Magenkrebszellen liefert wachsen [5-9]. Weitere Studien haben gezeigt, dass vor dem Anbringen von Magenkrebszellen auf Peritoneum, Mesothelzellen hemisphärische Form erwerben und beginnen zu vergießen. Als Ergebnis werden nackte Bereiche des submesothelialen Bindegewebe in die Bauchhöhle ausgesetzt [10-12]. Es ist wahrscheinlich, daß das Eindringen der Mesothelzellen Monoschicht durch Tumorzellen initiiert mit tumorinduzierter Mesothelzelle Apoptose. In dieser Studie untersuchten wir die Wirkungen von löslichen Faktoren, die von Magenkrebszellen auf die Morphologie und die biologische Aktivität von peritonealen Mesothelzellen in vitro freigesetzt und in vivo
.
Methods
Reagents
3- (4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT) wurde von Fluka, USA erhalten. Propidiumiodid (PI) wurde aus Biosharp, USA erhalten. Bcl-2, Bax, Caspase-3, Caspase-8 und Aktin primären Antikörper und der sekundäre Antikörper, Ziegen-anti-Maus-IgG wurden von Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA, erhalten. Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und fötalem Kälberserum (FCS) wurden von GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA) erhalten. Andere Laborreagenzien wurden von Sigma, USA erhalten. Ein Phasenkontrastmikroskop (Japan Nikon), Transmissions-Elektronenmikroskop (Hitachi H-6001, Japan) verwendet.
Zelllinien und Zellkultur
Der menschliche Peritonealdialyse mesothelial Zelllinie HMrSV5 von der Abteilung für Zellbiologie erhalten , China Medical University, China. HMrSV5 wurde ursprünglich aus menschlichen omentum isoliert. Kurz gesagt, Omentum von zustimmenden nicht-urämischen Patienten gesammelt, die elektive Bauchchirurgie unterzogen wurden, und wurde in 0,05% (w /v) Trypsin und 0,01% (w /v) EDTA 20 min bei 37 ° C inkubiert. Die geernteten Mesothelzellen bei 150 g für 5 min zentrifugiert und dann in 75 cm übertragen 2 Gewebekulturflaschen und kultiviert in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS ), 100 U /ml Penicillin, 100 ug /ml Streptomycin, 2 mmol /L L-Glutamin und 20 mmol /L Hydroxyethylpiperazin ethansulfonsäure (HEPES, Gibco BRL, USA). Medium alle 2-3 Tage gewechselt wurde.
Menschlichen Magenkarzinomzelllinien, MKN-45, MKN-1, SGC-7901, BGC-823 und MGC-803 wurden von der Abteilung für Zellbiologie, China Medical University erhalten , China. Diese Zellen wurden in DMEM, supplementiert mit 10% FCS, 100 U /ml Penicillin, 100 ug /ml Streptomycin und 2 mmol /L L-Glutamin in einer befeuchteten 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C.
Herstellung von serumfreiem konditioniertem Medium
Serumfreies freies~~POS=HEADCOMP konditioniertes Medium (SF-CM) wurde von Magenkrebszellen oder normalen Magenepithelzellen hergestellt, wie zuvor berichtet [1]. Kurz gesagt wurden 5,0 × 10 5 Zellen ausgesät in 100-mm-Gewebekulturschalen mit 10 ml DMEM, das mit 10% FCS supplementiert und für 3 Tage bei 37 ° C inkubiert. Zu erhalten SF-CM wurden die Zellen zweimal mit Phosphat-gepufferter Lösung (PBS) gewaschen und dann 2 Tage lang mit 3 ml serumfreiem DMEM inkubiert. Die SF-CM wurde bei 1000 g für 5 min eluiert und zentrifugiert (Porengröße: 0,45 &mgr; m) durch Filter geleitet und gespeichert unter -20 ° C verwendet werden, bis
Tiere
Männliche C57BL /6-Mäuse. (acht Wochen alt, mit einem Gewicht von 20 ± 2 g), wurden aus China Medical University Tieranlage erhalten und gefüttert mit gereinigtem Wasser und einer kommerziellen Lager Diät in einem klimatisierten Raum bei 20-22 ° C.Animals in dieser Studie verwendet wurden beibehalten in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für Pflege und Verwendung von Labortieren durch die US-amerikanischen National Institutes of Health veröffentlicht (NIH Publikation Nr 85-23, überarbeitet 1996) und die Politik der Animal Care und Use Committee der China Medical University.
Morphologische Auswertung unter einem Phasenkontrastmikroskop
menschliche peritoneale Mesothelzellen (HPMCs) wurden in einem 50 cm 2 Schale bis zur Subkonfluenz mit DMEM 10% FCS enthält. Das Medium wurde dann geändert, um (1) serumfreiem DMEM oder (2) SF-CM von Magenkrebs-Zelllinien. Die HPMCs in 24-well Kammern wurden für 24 h in den Testlösungen ausgesetzt und vorsichtig mit PBS gewaschen. Sie wurden dann unter einem Phasenkontrast-Mikroskop für die Größe, Form und Integrität der Zellmembran, Zytoplasma untersucht und Kern.
Transmissionselektronenmikroskopie
Die HPMCs kultiviert wurden, in ein bis Subkonfluenz 50-cm 2 Schale mit DMEM 10% FCS enthält. Das Medium wurde dann geändert, um (1) serumfreiem DMEM oder (2) SF-CM von Magenkrebs-Zelllinien. Nach Inkubation für 24 h wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und dann in eiskaltem 2,5% Elektronenmikroskopie Grad Glutaraldehyd in PBS (pH 7,3) fixiert. Die Proben wurden mit PBS gespült, nachfixiert in 1% Osmiumtetroxid mit 0,1% Kaliumferricyanid, dehydratisiert durch eine abgestufte Ethanolreihe (30% -90%) und in Epon eingebettet. Semidünn (300 nm) wurden die Schnitte geschnitten, um eine Reichart Ultracut (Reichart Ultracut (Leica, Deutschland) mit, gefärbt mit 0,5% Toluidinblau und unter einem Lichtmikroskop untersucht. Ultradünne Schnitte (65 nm) wurden mit 2% Uranylacetat gefärbt und Bleicitrat der Reynold, und bei 5000 × auf einem Transmissions-Elektronenmikroskop untersucht oder 8000 × Vergrößerung.
Quantitative Bestimmung der Zellschädigung durch MTT-Assay
der MTT-Assay wurde durchgeführt Lebensfähigkeit der menschlichen peritoneale Mesothelzellen nach der Behandlung zu beurteilen mit SF-CM von Magenkrebs-Zelllinien. Die Zellen in 96-Well-Plattenkulturen, nach der Belichtung für eine bestimmte Zeitdauer zu steuern oder zu Testlösungen (bei 12 h beobachtet, 24 h und 48 h) wurden mit 50 ug /ml inkubiert MTT in einer Verdünnung von 1:10, bezogen auf das Volumen des Kulturmediums für 3 h bei 37 ° C. am Ende der Inkubationszeit wurde die MTT-Lösung entfernt und 150 &mgr; l DMSO wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und gerührt, um lösen sich die dunkelblauen formazon Kristalle, die sich gebildet hatte. Der Anteil der lebensfähigen Zellen wurde durch Messung der optischen Dichte von jeder Probe bei 480 nm mit einem Spektrophotometer bestimmt. Drei Kulturen wurden zu jeder Lösung bei jeder Zeitperiode ausgesetzt. Die Mittel jeder Gruppe von Kulturen verglichen.
Durchflusszytometrie
in den Testlösungen für 24 h Nach der Inkubation 48 h und 72 h wurden die Zellen mittels Trypsinisierung geerntet. Zellen wurden in PBS bei einer Konzentration von 1 × 10 6 /mL und fixiert in 2 ml Methanol für 30 min bei 4 ° C resuspendiert. Nachdem die CNE2 Zellen fixiert wurden, wurde das Gemisch in 0,5 ml PI-Lösung (0,05 mg /ml in 3,8 mol /L Na-Citrat) und 0,5 ml RNAse A (0,5 mg /ml) bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Schließlich wurden die Zellen in 1 ml PBS resuspendiert und durch Durchflusszytometrie analysiert gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Zellen in der subdiploid peak wurden apoptotische betrachtet.
Histologische Auftreten Peritoneum
männlichen C57BL /6-Mäuse (acht Wochen alt, mit einem Gewicht von 20 ± 2 g) wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Das Experiment folgte den Richtlinien für die Verwendung von Labortieren in Forschung und Lehre. Die Mäuse erhielten eine Standard-Pellet-Laborfutter gefüttert und mit Wasser ad libitum
zur Verfügung gestellt. Die Mäuse wurden in eine von drei Gruppen randomisiert (n = 5 oder 6 in jeder Gruppe). Mäuse in der Gruppe DMEM wurden mit DMEM (100 ml /kg) durch intraperitoneale Injektionen an den Tagen 1, 3, 5 und 7 behandelten Mäuse in der SF-CM-Gruppe mit 100 ml behandelt wurden /kg SF-CM von Magenkrebs Linien, die durch intraperitoneale Injektionen an den Tagen 1, 3, 5 und 7. Es wurde nichts zu Injektionen für die Kontrollmäuse gegeben. Nach 29 Tagen wurden die Mäuse mit Ethylether anästhesiert und getötet. Parietal peritoneums wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt und Masson Trichrom-Färbung. Morphologische Veränderungen des Peritoneum parietale wurden durch Lichtmikroskop beobachtet. Die Dicke der submesothelialen extrazellulären Matrix bestimmt wurde, nachdem die Gewebeschnitte hatte H & E und Masson-Färbung. Der Durchschnitt für 10 unabhängige Messungen wurde für jeden Abschnitt berechnet; Daten wurden dann zusammengefasst.
Western-Blotting
menschliche peritoneale Mesothelzellen kultiviert wurden in einer 50-cm 2 Schale bis zur Subkonfluenz mit DMEM 10% FCS enthält. Die Medien wurden dann geändert, um (1) SF-CM von Magenkrebs MKN-45-Zelle, MKN-1, SGC-7901, BGC-823 und MGC-803; und (2) serumfreiem DMEM dient als Kontrolle. Protein wurde in einem Standard-Lyse-Puffer mit Protease-Inhibitoren (Natriumorthovanadat, Phenylmethylsulfonylfluorid, Leupeptin und Aprotinin, erhalten aus BioShop, Burlington, ON, Canada) extrahiert. Aliquots von 20 &mgr; g Protein-Lysat wurde mit einem 12% SDS-PAGE-Gel auf eine Nylonmembran und separat sondiert mit Antikörpern für Bcl-2, Bax, Caspase-3 und Caspase-8 elektrophoresiert. Nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper wurden die Blots unter Verwendung eines ECL-Western-Blot Substrate Kit (Abcam, USA) entwickelt.
Statistical analysis
Alle Daten ausgedrückt werden als x ± sd

. Vergleiche von Arzneimittelwirkungen wurden unter Verwendung von Student t
-Test gemacht. Ein P
Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Ergebnisse

• Ist die gleichzeitige Splenektomie vorteilhaft für das langfristige Überleben von Patienten mit Magenkrebs unterzogen kurative Gastrektomie? Ein Single-Institution study
• Expression und klinische Bedeutung der langen nicht-kodierenden RNA HNF1A-AS1 in menschlichen Magen cancer