Terapeutiska potentialen hos PRL-3 inriktning och kliniska betydelsen av PRL-3 genomisk amplifiering i magcancer

Terapeutiska potentialen hos PRL-3 inriktning och kliniska betydelsen av PRL-3
genomisk förstärkning i magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Phosphatase att regenerera lever 3 (PRL-3) har förtjänat uppmärksamhet som en avgörande molekyl i multipla steg av metastas. I den aktuella studien undersökte vi de mekanismer som reglerar PRL-3 uttryck, och bedömde den kliniska potentialen av PRL-3-hämmare i magcancer.
Metoder
PRL-3 genomisk amplifiering analyserades med hjälp av kvantitativ-polymerase chain reaktion och /eller fluorescens in situ hybridisering i 77 primära gastriska tumörer. Anticanceraktiviteten av PRL-3-inhibitor (1-4-bromo-2-bensyliden rodanin) behandling utvärderades mot cancerceller med olika genetiska och expression status.
Resultat
PRL-3 genomisk amplifiering var nära överensstämmande med hög nivån av proteinuttryck i cellinjer, och återfanns i 20% (8/40) hos humana primära tumörer med dess uttryck, som var alla stadium III /IV sjukdom (40%, 8/20), men i ingen (0 /37) bland dem utan uttryck. Dessutom var PRL-3 genom förstärkning i samband med metastaserad lymfkörtelstatus, vilket leder till långt framskriden och därmed dåliga resultat hos patienter med lymfkörtelmetastaser (P
= 0,021). PRL-3 små störande RNA kraftigt undertryckt metastaserande egenskaper, inklusive celltillväxt, invasion, och förankringsoberoende kolonibildning. Även om varken PRL-3 genomisk förstärkning eller uttrycksnivån var ansvarig för känsligheten för behandling PRL-3-hämmare, hämmaren visade dosberoende cancer effekt, och anmärkningsvärt apoptos på alla testade cellinjer med PRL-3 uttryck.
slutsatser
Vi har för första gången visat att PRL-3 genomisk förstärkning är en av de dominerande mekanismerna inducerar dess uttryck, särskilt i mer framskridet stadium, och att PRL-3-hämmare kan ha en stor potential mot magcancer med sitt uttryck.
Nyckelord
PRL-3 magcancer genomisk förstärkning målsökande terapi lymfkörtel bakgrund
gastric cancer (GC) är den fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i hela världen [1 ]. De senaste förbättringarna i diagnostiska verktyg och metoder har underlättat upptäckt av tidig GC och därmed utmärkt långsiktig överlevnad. Men patienter med avancerad sjukdom vid tidpunkten för diagnos förblir dåliga resultat. Metastas är en flerstegsprocess som omfattar lokal invasion, spridning och återupprättande i avlägsna organ, och är den avgörande faktorn för dödligheten [2]. Därför kan en bättre förståelse av metastaser bana väg för en mängd innovativa terapeutiska strategier i GC. Sälja The protein tyrosinfosfataser (PTP) bildar en stor familj av enzymer som fungerar som viktiga regulatoriska komponenter i signaltransduktionsvägar [3] . De fosfataser i regenererande lever (PRL-1, -2 och -3), som tillhör en liten grupp av PTP super, har en unik COOH-terminal prenylering motiv, som kritiskt påverkar deras cellulära lokalisering och funktion [4]. PRL-3 först identifierades som specifikt överuttryckt i levermetastaser härledda från kolorektal cancer [5], och därefter dess överuttryck dokumenterades i olika tumörtyper, inklusive GC [6]. PRL-3 kan främja cancer invasion, migration, tillväxt och angiogenes, antingen genom defosforylering som katalyseras genom katalytisk domän eller lokalisering till plasmamembranet i regi av COOH-terminal prenylering motiv [7-9]. Således har PRL-3 välförtjänt uppmärksamhet som en viktig molekyl i flera steg av metastaser och därmed som ett nytt terapeutiskt mål. Å andra sidan, är de mekanismer som inducerar PRL-3 uttryck inte helt klarlagda. Förstärkning av genomiska regioner som innehåller onkogener är den huvudsakliga mekanismen för dess åtföljande uttryck och utvecklingen av cancer, och har därför betydelse för riktade behandlingar [10]. PRL-3
genamplifiering svarar delvis för överuttryck i kolorektal cancer och matstrupscancer [5, 11]. Dock kvarstår förhållandet mellan genomisk förstärkning och GC svårfångade i både mekanistiska och terapeutiska synvinklar. I den aktuella studien undersökte vi egenskaperna hos PRL-3
genomisk förstärkning i GC och utvärderas ytterligare kliniska potential PRL-3-hämmare.
Metoder
cellinjer och vävnadsprover
GC cellinje MKN7 tillhandahölls vänligen från cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, åldrande och cancer, Tohoku University (Sendai, Japan). Sju andra GC-cellinjer (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74, och NUGC4) köptes från RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japan). Dessa cellinjer omfattar de två huvudtyper av GC [12], tarm typ (MKN7, MKN74, AZ521, och H111-celler) och diffus typ (GCIY, KatoIII, SH10 och NUGC celler) [13-15]. MKN7, NUGC4 och AZ521 celler etablerades från lymfkörtel metastas (LNM), och MKN74 celler från levermetastaser. KATOIII och GCIY celler etablerades från metastatisk pleurautgjutning och ascites, respektive. H111 och SH10 celler etablerades från xenotransplantation. Normala skelettmuskel C2C12-celler köptes från DS Pharma Biomedical Co, Ltd (Osaka, Japan). AZ521 och C2C12-celler odlades i DMEM-medium (GIBCO, Carlsbad, CA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). De andra cellerna odlades i RPMI1640-medium (GIBCO) kompletterat med 10% FBS. 1-4-bromo-2-bensyliden rodanin köptes från Calbiochem Corp (San Diego, CA), som identifierades som en PRL-3-hämmare genom high throughput screening med hjälp av kemiska bibliotek med Korea Chemical Bank, och hämmade PRL-3 fosfatasaktivitet [16]. Faktiskt, fosforylering av KRT8, PRL-3-interagerande protein, inducerad av katalytiskt inaktivt mutant av PRL-3, men inte av vildtypen, bekräftades genom behandling PRL-3-inhibitor i ett dosberoende sätt [17]. Dessutom anticancer behandlingens effektivitet PRL-3-inhibitor visade också att vara liknande den hos siRNA behandling i esofaguscancer eller kolorektal cancer [11, 17].
Utav 173 formalinfixerade, paraffininbäddade, vävnadsprover serie där vi tidigare bedömt PRL-3 uttryck status med immunhistokemisk färgning (IHC) i GC [6], 77 matchade par av primära tumörvävnader och motsvarande normal slemhinna vävnader valdes slumpmässigt från patienter med differentialsteg enligt 13 e upplagan av den japanska Klassificering av magcancer (JCGC) [18]; 40 par med positiv PRL-3 uttryck (10 patienter i fas I, 10 i II, 10 i III, och 10 i IV) och 37 par med negativ uttryck (10 patienter i fas I, 10 i II, 9 i III, och 8 i IV). Samtliga patienter genomgick gastrektomi enligt mag riktlinjer cancerbehandling i Japan [19], och histopatologiska undersökningar gjordes enligt JCGC. 6 e upplagan av den internationella unionen mot cancer (UICC) /TNM klassificering användes också [20]. Tabell 1 visar detaljerad information om 77 patienter. Alla vävnadsprover samlades vid Kitasato Universitetssjukhuset, och informerat samtycke erhölls från alla patienter. Den aktuella studien godkändes av den etiska kommittén i Kitasato University.Table ett Samband mellan PRL-3 genamplifiering och kliniskt patologiska variabler i 77 patienter med magcancer
vid vid PRL-3 genamplifiering
vid variabler
Totalt antal
negativitet
Positivitet
p
värde
vid vid Number
(%) Review
Number
(%)
vid PRL-3 uttryck
0,006
Negativity
37
37
(100 ) katalog 0
(0) Review Positivitet
40
32
(80) katalog 8
(20) Review Ålder (år) katalog 0,726 Hotel < 60
34
30
(88) 4
(12) katalog ≥60
43
39
(91)
4
(9) Review Kön
0.710
Man
51
45
(88) katalog 6
(12) Review Kvinna
26
24
(92) 2
(8) Review lymfatiska trängning
0,343
Frånvaro
15
15
(100)
0
(0) Review närvaro
62
54
(87) katalog 8
(13) Review Vascular trängning
0,263
frånvaro
25
24
(96) 1
(4) Review närvaro
52
45
(87) katalog 7
(13) Review Differentiering
0,134
väl och måttlig
31
30
(97) 1
(3) Review Poor
46
39
(85) katalog 7
(15) Review djup invasion
0,006 *
T1 (m och sm) katalog 15
15
(100) Review 0
(0) Review T2 (mp och ss) katalog 35
33
(94) 2
(6) Review T3 (se) Review 19
16
(84) katalog 3
(16) Review T4 (si) katalog 8
5
(63)
3
(38) Review Lymfkörtel metastaser
0,022
Frånvaro
29
29
(100) katalog 0
(0) Review Presence
48
40
(83) Review 8
(17) Review JCGC lymfkörtelstatus †
0,004 *
N0
29
29
(100) katalog 0
(0) katalog N1
21
20
(95) 1
(5) katalog N2
20
14
(70) katalog 6
(30) Review N3 och avlägsna lymfkörtlar
7
6
(86) 1
(14) Review UICC lymfkörtelstatus ‡
0,002 *
N0
29
29
(100) katalog 0
(0) Review N1
18
17
(94) 1
(6) katalog N2
16
13
(81) katalog 3
(19)
N3 och avlägsna lymfkörtlar
14
10
(71) 4
(29) Review JCGC skede
0,005 *
I (IA och IB ) katalog 20
20
(100) katalog 0
(0) Review II
20
20
(100) katalog 0
(0) Review III (IIIA och IIIB) katalog 19
15
(79) 4
(21) Review IV
18
14
(78) 4
(22) katalog UICC skede
0,003 *
I (IA och IB) katalog 21
21
(100) Review 0
(0) Review II
20
20
(100) katalog 0
(0) Review III (IIIA och IIIB) katalog 16
13
(81) katalog 3
(19) Review IV
20
15
(75) Review 5
(25) katalog Fluorescence in situ-hybridiseringsanalys
Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) analys utfördes, såsom beskrivits tidigare [11]. PRL-3
är belägen på kromosom 8q24.3 (GenBank accessionsnummer NT 000.008,9) och kromosom 8 centro prob användes för att uppskatta kopietal. Eftersom PRL-3
FISK poäng algoritmer inte hade standardiserats, var den bedömning som baseras på kriterierna i HER2
[21]. För varje prov, var minst 60 cancerceller gjorde. Positiva PRL-3
genomisk förstärkning definierades som ett förhållande mellan PRL-3
till kromosom 8 centromer mer än 2,2, och negativa var förhållandet mindre än 1,8. Om förhållandet mellan PRL-3
till kromosom 8 centromer var 1,8 till 2,2, har ytterligare celler räknades, och förhållandet mellan mer än 2,0 slutligen betraktas som positivt [21]. Polysomy definierades som medelvärdet kromosom 8 centro signaler mer än 3,0 per kärna [22].
Kvantitativ-genomisk PCR
Vävnadssnitt från tumör och motsvarande normal slemhinna, som erhållits åtminstone 5 cm från tumören kanten, var skarpt dissekeras på hematoxylin och eosin-färgade objektglas, och genomiskt DNA extraherades därefter med hjälp av en QIAamp DNA FFPE Kit (QIAGEN Sciences, Hilden). Kvantitativ-genomisk polymeraskedjereaktion (Q-PCR) utfördes för att kvantifiera PRL-3
gense kopietal med användning iQ ™ Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) i tre exemplar på iCycler iQ ™ realtids-PCR Detection systemet (Bio-Rad). Att normalisera PRL-3
genkopietal per cell, ADAM metallopeptidase domän 2 (ADAM2
, NT 923907,1), belägen på kromosom 8p11.2, användes som en endogen referens eftersom det genamplifiering definieras som en kopia antal ökning med en begränsad region av en kromosom arm [10]. ΔCt-värdena beräknades som Ct (PRL-3
) -CT (ADAM2
) för varje prov. Relativt antal kopior bestämdes som 2 - ΔΔ Ct, där ΔΔC t = AC t (tumör) -ΔC t (motsvarande normal) [23]. Ökningarna av mer än två gånger i förhållande till motsvarande normala ansågs vara genomisk förstärkning. Ytterligare fil 1 skildrar detaljerad PCR tillstånd och sekvenser av primer och sond som används i föreliggande studie.
Western blotting
Hela cellysat extraherades i RIPA-buffert (Pierce, Rockford, IL) med tillsats av 10

• MicroRNA-645, uppreglerat i mänsklig adencarcinoma av mag esofagus korsning, hämmar apoptos genom att rikta tumörsuppressor IFIT2
• Prognostic effekterna av att upptäcka livsdugliga cirkulerande tumörceller i gastric cancerpatienter med hjälp av en telomeras-specifika virus agent: en prospektiv study